PHONG TRU SINH HOC BENH CAY

Chương I: Sự đa dạng sinh học và sự cân bằng sinh học • Giới thiệu về hệ sinh thái • Sự tương tác lẫn nhau của các nhóm sinh vật trong hệ sinh thái • Sự đa dạng sinh học trong hệ sinh t

Đối chứng PTSH bằng vi khuẩn

Phòng trị sinh học bệnh ghẻ trên khoai tây do Streptomyces scabies bằng xạ khuẩn Streptomyces sp.

Trái: đất trồng được xử lý xạ khuẩn có lợi Streptomyces sp.

Phải: đất không xử lý

Một số Nghiên cứu PTSH tại bộ môn

 Vi sinh vật đối kháng

Nấm Trichoderma spp.

Bệnh thối rễ (Fusarium solani)

 Vi sinh vật đối kháng

Bệnh đốm vằn trên lúa (Rhizoctonia solani)

Vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17

 Vi sinh vật đối kháng

Bệnh thán thư trên ớt (Colletotrichum sp.) Pseudomonas 46 P fluorescens 199 Control

 Vi sinh vật đối kháng

Bệnh thối gốc mè (Phytophthora capsici)

Control Treatment

Vi khuẩn P fluorescens 199

 Vi sinh vật đối kháng

Control Treatment

Bệnh Bã trầu trên dưa hấu (Didymella bryoniae)

Bacterial treated Control

• Phương pháp nghiên cứu PTSH bệnh cây trồng

• Các thuận lợi và khó khăn của biện pháp PTSH

Nội dung

Gồm 4 chương

PGPR, Trichoderma, Mycorhizae, Bacteriophage

4 Thành tựu, ưu điểm và trở ngại của biện pháp phòng

trị sinh học

Tài liệu tham khảo

1 Phòng trị sinh học bệnh cây trồng Phạm Văn Kim

2 Vi sinh vật đất Phạm Văn Kim

3 Plant Pathology Agrios N.G (1997 hoặc 2005)

4 Biological control of plant diseases (Vol I & II) Mukerji,

K G và Garg, K L CBS Publishers & Distributors India (1993)

5 Biological control: Benefits and risks Hokkanen, H.M.T

và Lynch, J.M Cambridge University Press (1995)

6 Các tạp chí khoa học về PTSH bệnh cây trồng

7 PGPR Biofertilization and Biopesticides.aki A Siddiqui

8 PGPR for sustainable agriculture Proceeding 2 nd Asian PGPR conference

Bài 3: Khảo sát khả năng đối kháng vi khuẩn vùng rễ

đối với các tác nhân VSV gây bệnh chính trong điều kiện PTN

Bài 4: Đánh giá hiệu quả phòng trị của các chủng vi

khuẩn đối kháng đối với mầm bệnh trong điều kiện in vivo

Chương I:

Sự đa dạng sinh học và sự cân bằng sinh học

• Giới thiệu về hệ sinh thái

• Sự tương tác lẫn nhau của các nhóm sinh vật trong hệ

sinh thái

• Sự đa dạng sinh học trong hệ sinh thái

• Sự cân bằng sinh học trong hệ sinh thái

• Ảnh hưởng của sự đa dạng sinh học lên cân bằng sinh

học

Giới thiệu về hệ sinh thái

Khái niệm: HST là tập hợp của quần xã sinh vật với môi

trường vô sinh của nó, trong đó, các sinh vật tương tác với nhau và với môi trường để tạo nên các chu trình sinh địa hóa và sự biến đổi năng lượng

Gồm các nhóm yếu tố tương tác nhau:

• yếu tố sinh vật: 3 nhóm sinh vật ( sản xuất, tiêu thụ và

chuyển hóa hay phân huỷ)

• yếu tố phi sinh vật: chất vô cơ, hữu cơ, yếu tố môi trườngt

sự tương tác các nhóm sinh vật trong hệ sinh thái

Tìm hiểu Sự đa dạng sinh học tại vùng rễ cây trồng

Hình : Hệ sinh vật trong đất bao quanh vùng rễ

Who’s there?

Nhóm ĐV lớn: Macrofauna (Soil ‘Engineers’)

Hình: Phân nhóm

sinh vật trong

đất dựa vào

kích thước

1 Phân hủy hữu cơ : Decomposition

(shredding residues)

VSV: Mixing soil (aeration)

ĐV đất quan trọng vì

(Soil animals are important for)

Who’s there?

Nhom động vật TB ( Mesofauna ):

Nhóm ăn mồi (Soil

predators,)

Tác nhân gây bệnh ( pathogens)

Sâu hại (herbivores)

Soil mesofauna

Nematodes

Mites

Protozoa TIFF (LZW ) decompressorQuickTime™ and a

are needed to see this picture.

Soil mesofauna are important for

1 Residue decomposition (phân hủy

hữu cơ)

2 Predation (Ăn mồi)

3 Pathogenesis (tác nhân gây bệnh)

Nhóm VSV

(Microorganisms) Nhóm điều khiển các tiến trình sinh học trong đất ( Soil process

controllers)

Soil microorganisms

Vi sinh vật đất

Nấm (Fungi)

Vi khuẩn (Bacteria)

Nấm ( Fungi)

• Tăng trưởng dạng sợi (Filamentous growth )

Nấm (Fungi)

• Phát triển dạng khuẩn ty (Filamentous growth)

• Chức năng rất quan trọng ( Functional criticals):

- mầm bệnh: Pathogen (plant )

- VSV phân hủy gổ, xác bã thực vật (Wood degrading)

- Nhóm nấm rễ cộng sinh cây trồng (-Mycorrhizal association)

Mycorhizae: Symbiotic structure formed by a fungus plus a plant) Plant pathogens Wood decomposer

Vi Khuẩn (Bacteria)

• Kích thước nhỏ , đơn bào , 0.5- vài µm

Sự tương tác lẫn nhau của các nhóm sinh vật trong

6 Sự hổ tương (mutualism hay synergism)

7 Sự tương trợ một chiều (commensalism)

8 Sự hợp tác (cooperation)

9 Quan hệ trung tính

1 Sự cạnh tranh (competition)

• Sự cạnh tranh về dinh dưỡng và chổ ở giữa các

nhóm sinh vật trong hệ sinh thái giúp quần thể củamỗi loài phát triển ở mức giới hạn

Trong lĩnh vực PTSH bệnh cây trồng như thế

nào?? Cụ thể là sự cạnh tranh giữa các nhóm vi sinh vật

Tương tác cạnh tranh giữa vi sinh vật thông qua: cạnh tranh về dưỡng chất tiêt ra từ cây trồng, cạnh tranh sắt do tiết ra siderophore, cạnh về nơi cư trú

Hình 3.4: Khả năng tiết siderophore của 1 số chủng VKĐK

trên môi trường CAS medium

Tt7.4et

Sự ăn mồi (Predation)

Là hiện tượng sinh vật bắt và ăn mồi sinh vật khác

Thí dụ: + tuyến trùng ăn thịt

+ Nguyên sinh động vật (protozoa ) ăn vi khuẩn+ động vật đất ăn protozoa và nấm: như: Trùngbánh xe (Rotifera ) ăn bào tử nấm

Collembolla

ăn xác bả thực vật và nấm Protozoa tiêu hóa vi khuẩn

Tuyến trùng ăn mồi

https://www.youtube.c

om/watch?v=vT8bms

2RHe8

Sự kí sinh (parasitism)

Là hiện tượng một sinh vật sống lợi dụng một sinh vật khác

Nấm kí sinh nấm khác Nấm kí sinh tuyến trùng

Vi khuẩn kí sinh tuyến trùng

Thực khuẩn thể kí sinh vi khuẩn

R solani

Ps fluorescens

Sự tương tác đối kháng (antagonism hay restraint)

+Vi khuẩn đối kháng nấm

Vi khuẩn đối kháng vi khuẩn Xạ khuẩn đối kháng nấm Coletotrichum

• Giữa vi khuẩn Rhizobium spp Và cây họ đậu

• Giữa xạ khuẩn Frankia sp Cây phi lao ( Casuria)

Nấm rễ dạng nội sinh

bên trong tế bào rễ cây và hình thành

các bọc hình bầu (vesicles) và các sợi

nấm phân nhánh (Asbuscular) theo

dạng chùm rễ trong tế bào rễ cây.

Nấm rễ ngoại sinh

(ectomycorhizae)

Sự cộng sinh của nấm rễ với cây trồng

Vai trò của Nấm rễ đối với cây trồng

-Gia tăng hấp thụ chất vô cơ và hấp thu Lân

-Tăng tính kháng bệnh của cây trồng

-Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi: hạn, nhiệt độ cao, pH bất lợi, ngộ độc…

-Tăng khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng thông qua tiết phytohormone

Source: Harrison et al 1999

Roots without mycorrhizae

Source: Harrison et al 1999

Roots with mycorrhizae

(Mass production of inoculum source of VA mycorrhiza l fungus in root

systems of corn in sand bed)

Một số nghiên cứu về nấm rễ của Viện Nghiên cứu Nông Nghiệp Đài Loan

(Taiwan Agricultural Research Institute)

Nhân sinh khối nấm rễ dạng VA trên hệ rễ của cây Bắp trên nền đất cát

Application of VA mycorrhizal fungus for promotion of citrus seedlings growth

Growth promotion of muskmelon inoculated with VA mycorrizal fungus (Left)

+ Sự cộng sinh cây họ đậu và vi khuẩn cố định đạm

Các loại vi khuẩn cố định đạm tạo bướu rễ trên cây họ

đậu: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium,

Mesorhizobium, Phyllobacterium, Rhizobium v.v

Nốt rễ trên cây đậu nành (Glycine max)

( photo by Martin F Wojciechowski and

Johanna Mahn )

Hình a & b: Sự thành lập nốt rễ cố định đạm bởi VK Rhizobium sp.

a

Hình a & b: Sự thành lập nốt rễ cố định đạm bởi VK Rhizobium sp (tt)

b

Quan hệ hổ tương (mutualism hay synergism)

Vi sinh vật được nuôi Khả năng cố định N trong cùng thời gian

Sự tương trợ một chiều (commensalism)

TD:

Mối quan hệ giữa Nitrosomonas và Nitrobacter

ammonium thành nitrit

1.4 & 1.5 Cân bằng sinh học và ảnh hưởng của

đa dạng sinh học lên cân bằng sinh học

Mối tương quan của đa dạng sinh học và cân bằng sinh học

trong hệ sinh thái

Đa dạng các kiểu tương tác các nhóm sinh vật trong hệ sinh thái giúp tạo ra cân bằng sinh học

Trong HST tự nhiên , tương quan giữa các thành phần sinh vật luôn ỡ

trạng thái cân bằng

• Cân bằng sinh học là trạng thái phát triển

của từng thành phần sinh vật trong hệ được đảm bảo và tương đối ổn định trong hệ sinh thái để hướng tới sự thích nghi cao nhất với điều kiện sống

• Trong hệ sinh thái cân bằng, đa dạng sinh

học rất tốt dẫn đến mật số của các loài sinh vật luôn ổn định, không xảy ra hiện tượng bộc phát, do giữa các loài có sự tương tác kiềm chế lẫn nhau, tạo nên cân bằng sinh học

và cân nhắc kỹ trước khi tác động lên một

thành phần nào đó của hệ, để không gây suy thoái, mất cân bằng cho hệ sinh thái

Sự mất cân bằng trong hệ sinh thái trồng trọt

– Cơ cấu cây trồng ít đa dạng

– Ít sử dụng phân hữu cơ

– Vi sinh vật đất rất phong phú

Sự khác biệt về sự nhiễm bệnh trên cây rau đối với bệnh thối hạch do nấm S sclerotium

A Trên đất có trồn lẫn phân hữu cơ

B Đất ít phân hữu cơ

CHƯƠNG 2

BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH CÂY TRỒNG

Chương 2: Biện pháp phòng trị sinh học

2.1 Giới thiệu về biện pháp PTSH

2.2 Cơ chế vi sinh vật tác động ngăn chặn mầm bệnh

2.3 Ứng dụng của biện pháp PTSH trong quản lí bệnh

cây trồng

Giới thiệu về biện pháp PTSH

– Pham van Kim (2006): Biện pháp sinh học trong

phòng trị bệnh cây là điều khiển môi trường , cây

tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưởng gây hại Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh và cũng không có khả năng nầy.

– PTSH bệnh cây trồng có thể được định nghĩa là biện

pháp sử dụng sinh vật có ảnh hưởng đến hoạt động của tác nhân gây bệnh Tác nhân PTSH có thể là nấm, vi khuẩn, tuyến trùng, virut Hầu hết các tác nhân PTSH này là sống trong đất và môi trường và không gây bệnh đối với chim, động vật và cá Chúng không phải là sinh vật chuyển gen.

Nguyên lý hình thành biện pháp sinh học

Dựa vào sự tương tác lẫn nhau của hệ sinh vật trong hệ sinh thái trồng trọt

– Tác động lẫn nhau giữa cây trồng và quần thể vi sinh vật

– Tác động lẫn nhau giữa các nhóm vi sinh vật (VSV có lợi và mầm bệnh

Từ đó biện pháp sinh học nhằm sử dụng nhóm vi sinh vật có lợi giúp cây trồng phát triển tốt hơn đồng thời ức chế sự phát triển của mầm bệnh

Tác động lên môi trường

Con người

Môi trường

vi sinh vật đối kháng

– Vi sinh vật đất rất phong phú

Sự khác biệt về sự nhiễm bệnh trên cây rau đối với bệnh thối hạch do nấm S sclerotium

A Trên đất có trồn lẫn phân hữu cơ

B Đất ít phân hữu cơ

2.3 Cơ chế tác động của VSV có lợi trong phòng trị các

tác nhân gây bệnh trên cây trồng

• Cơ chế giúp cây trồng tăng trưởng tốt,

chống lại các điều kiện bất lợi

VK Gram (-) Phổ tác dụng rộng

VK Gram (+) Nấm

Tổng hợp protein

Pseudomonas

fluorescens

2,4 Diacetylploroglucinol Monoacetylphloroglucinol Pyoluteorin

R solani

Ps fluorescens

Sự tương tác đối kháng (antagonism hay restraint)

+Vi khuẩn đối kháng nấm

Vi khuẩn đối kháng vi khuẩn Xạ khuẩn đối kháng nấm Coletotrichum

Pa 231-1

X.oo

Sự đối kháng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

(Bacterial leaf blight in rice caused by Xoo)

Sự đối kháng của vi khuẩn Ps aeruginosa 231-1 đối với X oryzae pv.

oryzae trên đĩa Pettri vào 2 ngày sau khi cấy

Sự đối kháng của P fluorescens đối với nấm R solani

R solani

Ps fluorescens

Phosphorus solubilization

Minh chứng về Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang (Fluorescent Pseudomonads) trong PTSH

 2,4-Diacetylphloroglucinol

 Molecular formula: C10H10O5

 Is a natural phenol found in specific strains of the Gram-negtive

bacterium Pseudomonas fluorescens

 2,4-DAPG biosynthesis locus contains six genes

phlA, phlB, phlC, phlD,phlE and phlF

 Coding for the regulation, synthesis, and putative export of 2,4-DAPG

 The genes are conserved among 2,4-DAPG producing pseudomonads isolated from soils worldwide

2, 4-DAPG

Minh chứng về kháng sinh do vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang tiết ra

Tác động của 2,4 DAPG đối tế bào VSV

 Đối kháng với mầm bệnh

Phổ ức chế rộng đối với nhiều VSV

Cách tác động: lên màng tế bào, phân hủy không bào và giết

chết tế bào

Phân hủy không bào Sự phân hủy tế bào VSV

Disintegration of cell

Amplification of 2,4-DAPG gene

Sl No Rhizosphere of crop Strains Species

2, 4, DAPG +ve strains

Isolation of 2,4- Diacetylphoroglucinol(DAPG) and testing of

DAPG against X axanopodis pv punicae

Trichoderma: là tác nhân PTSH (Trichoderma: A biocontrol agent)

• Trichoderma spp là thể nấm sợi được tìm thấy trongđất và đang được thương mại hóa như thuốc trừbệnh sinh học, phân bón sinh học

• Chúng bảo vệ cây trồng , giúp cây trồng tăng trưởng

• Là nhóm vi sinh vật sản xuất nhiều sản phẩn đồng

ĐẶC ĐiỂM CHUNG

 Trichoderma thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm

Bất Toàn, chi vi nấm.

 Sợi nấm có tỷ lệ phân nhánh cao lúc đầu màu

trắng khi nuôi cấy trong môi trường PDA (trong

suốt_CMA) về sau chuyển sang màu xanh Bào tửkhông có vách ngăn đa số hình bầu dục

 Sống hoại sinh trong đất hiện diện quanh hệ thống

rễ cây có khả năng phân huỷ chất hữu cơ thànhđường nhờ enzyme

 Có khả năng ký sinh và đối kháng với nhiều nấmbệnh

a amazonicu

Vì saoTrichoderm

a được sử

dụng trong

phòng trừ

sinh họcbệnh cây ?

Các sản phẩm đồng hóa của Trichoderma

Các sản phẩm đồng hóa quan trọng sản xuất bởi Trichoderma có khả năng ức chế sự phát

triển VSV

• Anthraquinones; Daucanes; simple pyrones; Koinginins;

Trichodermamides; Viridins; Viridiofungins; Nitrogen heterocyclic compounds; Trichodenones and cyclopentenone derivatives;

• Azaphilones; Harzialactones and derivatives, Butenolides;

Trichothecenes; Isocyano metabolites;

• Setin like metabolites; Bisorbicillinoids; Diketopiperazines;

Ergosterol derivatives; Peptaibols; Cyclonerodiol derivatives;

Statins;

• Heptelidic acid and derivatives; Acoranes and Miscelanea etc

Làm sao tinh ròng và hiểu được đặc tính của các

hợp chất có vai trì sinh học do nấm tiết ra

(Purification and characterization of bioactive metabolites)

Thin layer chromatography was performed in various solvent systems

The compound spotted on the TLC plates was sprayed with 2% H2SO4

The most active fractions were combined and purified by HPLC column

All the compounds were detected at λmax 254 nm UV absorption

spectrum of the antifungal substance was also measured by the

detector at the retention time of the active fraction during HPLC

LC-MS analysis of pure fungicidal substance was performed on Binary Nano HPLC system with Mass as the detector (Agilent Technologies, USA)

Assessments of the antifungal spectrum of purified fractions obtained were tested for their fungicidal activity on TLC plates (TLC

bioautography).

Phân tích bằng kỹ thuật sắc kí khí lỏng cao

(HPLC), LC-MS (sác lỏng- khối phổ

Bảng:Hoạt tính kháng nấm của các kháng sinh tiết ra bởi các loài Trichoderma

( Antifungal activity of antibiotics produced by Trichoderma species (using

various solvent extracts)

A flavus A parasiticus

Figure 10: Hoạt tính đối kháng Nấm do hợp chất tiết ra từ Trichoderma

^Antifungal activity of extract by Disc diffusion method and TLC separation of

active compound)

2 Cơ chế tiêu sinh

Do tác nhân có khả năng tiết ra các enzymes phân hủy vách tế bào của vi sinh vật

Sự tương tác giữa Pythium oligandrum (Po) và nấm gây bệnh Botrytis cinerea (Bc) trên lame nuôi cấy.

Ảnh hưởng của nấm phòng trị sinh học của nấm Trichoderma

hazianum (T) lên R solani (R) (Agrios, 2005)

2 ngày nuôi cấy 6 ngày nuôi cấy

3 Cơ chế cạnh tranh

Các vi sinh vật cạnh tranh nhau về dinh dưỡng và nơi định

cư

TD: Nhóm vi khuẩn P fluorescens tiết ra nhóm phức chất có

ái lực mạnh với sắt (siderophore) Trong môi trườngthiếu sắt, nhóm vi khuẩn này sẽ chiếm ưu thế trongquần thể hơn và cũng gây ức chế vi sinh vật khác pháttriển, đồng thời rễ cây trồng cũng có thể hấp thụsiderophore bằng cơ chế vận chuyển chủ động

+ Iron is also another essential nutrient, but it is scarce in soil PGPB, can produce compounds called

siderophores, which acquire ferric iron (Fe3+), root cells can then take this up by active transport mechanisms [6]