Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sinh học để kiểm soát bệnh héo rũ cây trồng do vi khuẩn (the bacterial wilt)

Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các chủng vi khuẩn đối kháng trên cây cà chua trong điều kiện nhà kính .... Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh các giống vừng sản xuất do v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

………… ………

NGUYỄN THỊ HỒNG HẢI

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH HỌC ĐỂ KIỂM SOÁT BỆNH HÉO RŨ CÂY TRỒNG DO VI KHUẨN (THE BACTERIAL WILT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

………… ………

NGUYỄN THỊ HỒNG HẢI

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH HỌC ĐỂ KIỂM SOÁT BỆNH HÉO RŨ CÂY TRỒNG DO VI KHUẨN (THE BACTERIAL WILT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Ngọc Cường

HÀ NỘI – 2005

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi là chính Những kết quả trong luận văn là trung thực, một phần được công bố trên các tập san

và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào

khác

Người cam đoan

Nguyễn Thị Hồng Hải

ii

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Ngọc Cường, người đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Đào tạo và Bồi dưỡng sau Đại học cùng các Thầy Cô giáo – Trường Đại học Bách khoa

Hà Nội đã tổ chức khoá đào tạo và tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp và tập thể cán bộ phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà nội ngày 26 tháng 10 năm 2005

Nguyễn Thị Hồng Hải

iii

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt viii

Danh mục các bảng ix

Danh mục các hình và đồ thị xi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Cơ sở khoa học của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4 Mục tiêu của đề tài 4

5 Nội dung nghiên cứu 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tình hình gieo trồng vừng, cà chua ở Việt Nam và trên thế giới 5

1.1.1 Tình hình gieo trồng vừng 5

1.1.2 Tình hình gieo trồng cà chua 5

1.2 Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum 6

1.2.1.Khái quát về bệnh héo xanh cây trồng 6

1.2.2 Biểu hiện triệu trứng của cây nhiễm bệnh 8

1.2.3 Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum 9

1.3 Vi sinhvật đối kháng 14

Trang

iv

1.3.1 Quan hệ đối kháng trong thế giới vi sinh vật 14

1.3.2 Vi sinh vật nội sinh đối kháng 16

1.4 Biện pháp phòng trừ sinh học bằng phương pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 18

1.4.1 Cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn héo xanh R solanacearum 19

1.4.2 Các loại vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 20

1.4.3 Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phát triển nền nông nghiệp bền vững 24

1.5 Phân loại vi khuẩn 25

1.5.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 25

1.5.2 Phân loại theo phương pháp hiện đại bằng cách sử dụng kit “Api” và Vitek 26

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Nguồn vi sinh vật 27

2.1.2 Các thiết bị hoá chất và một số giống cây nghiên cứu 27

2.1.3 Các môi trường và dung dịch đệm chủ yếu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh R.solanacearum 28

2.2.1 Phương pháp điều tra thu mẫu 28

2.2.2 Phương pháp thu thập, phân lập vi khuẩn gây bệnh từ mẫu cây bệnh 29

2.2.3 Phương pháp đánh giá tính độc của R solanacearum 30

2.2.4 Phương pháp nhận dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacerum bằng kỹ thuật PCR 31

2.2.5 Phương pháp xác định thứ sinh học (biovar) 33

v

2.3 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn

R.solanacearum 34

2.3.1 Phân lập vi khuẩn đối kháng 34

2.3.2 Phương pháp phân loại vi khuẩn đối kháng 35

2.3.3 Phương pháp đánh giá tác động của vi khuẩn đối kháng lên sự nảy mầm của hạt cà chua và hạt vừng 37

2.3.4 Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên cây cà chua trong nhà kính 37

2.3.5 Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng lên cây cà chua và cây vừng trong nhà kính 38

2.3.6 Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng lên cây vừng trên đồng ruộng 39

2.4 Đánh giá hiệu quả kinh tế của vi khuẩn đối kháng trên cây vừng 39

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Bệnh héo xanh cây cà chua và cây vừng do vi khuẩn R solanacearum 41

3.1.1 Điều tra và thu mẫu 41

3.1.2 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh héo xanh 45

3.1.3 Nhận dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum 48

3.1.3.1 Thử nghiệm tính độc của các chủng vi khuẩn R solanacearum trên dòng cà chua mẫn cảm L-390 và giống vừng V6 48

3.2 Vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum 54

3.2.1 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 54

3.2.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 56

3.2.3 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 58

vi

3.3 Xác định vị trí phân loại của vi khuẩn đối kháng đại diện 60

3.3.1 Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng sử dụng trong xác định vị trí phân loại của chúng 60

3.3.2 Phân loại bằng kit “API 20 NE” và hệ thống Vitek 61

3.4 Quan hệ giữa nhóm vi sinh vật đối kháng có lợi với cây trồng (cây cà chua và cây vừng) 62

3.4.1 Nhóm vi khuẩn hệ rễ (Rhizosphere bacteria) 62

3.4.2 Nhóm vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) 63

3.5 Ảnh hưởng của các chủng đối kháng lên sự nảy mầm của hạt cà chua và hạt vừng 66

3.6 Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đối kháng trên cây cà chua trong nhà kính 68

3.6.1 Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 68

3.6.2 Đánh giá sự tác động của các chủng vi khuẩn đối kháng lên sinh trưởng và phát triển của cây cà chua 71

3.7 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo rũ do R solanacearum của các chủng vi khuẩn đối kháng trên cây vừng 73

3.7.1 Hiệu quả phòng trừ trong điều kiện nhà kính 73

3.7.2 Hiêụ quả đối kháng vi khuẩn héo xanh của vi khuẩn nội sinh bằng xử lý tế bào chết trên cây vừng 77

3.7.3 Hiệu quả gieo trồng cây vừng ngoài đồng ruộng 79

3.7.4 Hiệu quả kinh tế và năng suất cây vừng khi có bổ sung vi khuẩn nội sinh đối kháng 81

KẾT LUẬN 84

KIẾN NGHỊ 85

TÀI LIỆU THAM KHẢO 86

PHỤ LỤC 95

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ADN Axit deoxy ribonucleic (Deoxy ribonucleic Acid) AVRCD Asian Vegtable Research Development Center

cfu Đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit) EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid

FAO Tổ chức Nông Lương Thế giới

IAA Axít indol – 3 – axetic

PBMT Photphat Bufer Malat Tetrazodium chloride

TBE Trisbase Boric acid EDTA

TTC Triphenyl Tetrazolium chloride

viii

đồng ruộng ở 5 tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam 42 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng gây

biểu hiện triệu chứng bệnh héo xanh 46 Bảng 3.3 Khả năng chuyển hoá các nguồn cacbon của các chủng vi

khuẩn R solanacearum phân lập thể hiện tính độc 52

Bảng 3.4 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn

phân lập được 55 Bảng 3.5 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các

chủng R solanacearum 56

Bảng 3.6 Một số đặc điểm hình thái nuôi cấy của 8 chủng vi khuẩn đối kháng 58 Bảng 3.7 Một số đặc điểm cơ bản phục vụ mục đích phân loại các

chủng vi khuẩn đối kháng 60 Bảng 3.8 Phân loại các chủng vi khuẩn đối kháng bằng kit API 20 NE

và hệ thống Vitek (bio Mérieux) 61 Bảng 3.9 Mật độ và khả năng tồn tại của hai chủng vi khuẩn nội sinh

NA3, NA4 trong mô rễ cây rừng 64Bảng 3.10 Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng

nảy mầm của hạt cà chua và hạt vừng 66

Trang

ix

Bảng 3.11 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các

chủng vi khuẩn đối kháng trên cây cà chua trong điều kiện

nhà kính 68 Bảng 3.12 Đánh giá thống kê học tác dụng phòng trừ bệnh héo rũ vi

khuẩn của các chủng đối kháng đối với các giống cà chua sản

xuất 70 Bảng 3.13 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà chua khi có bổ sung vi

khuẩn đối kháng 71 Bảng 3.14 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh các giống vừng sản xuất

do vi khuẩn trong điều kiện nhà kính của các chủng vi khuẩn

đối kháng hệ rễ và nội sinh 74 Bảng 3.15 Đánh giá thống kê học tác dụng phòng trừ bệnh héo xanh vi

khuẩn của các chủng đối kháng đối với các giống vừng sản xuất 75

Bảng 3.16 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R solanacearum khi

xử lý với tế bào sống và tế bào chết của hai chủng vi khuẩn

nội sinh NA3 và NA4 77 Bảng 3.17 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo rũ cây vừng do vi khuẩn ngoài

đồng ruộng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng 80 Bảng 3.18 Hiệu quả về năng suất do biện pháp kiểm soát bệnh héo rũ

vi khuẩn cây vừng V6 ngoài đồng ruộng bằng các chủng đối

kháng nội sinh mang lại 82

x

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Chỉ tiêu đánh giá mức độ nhiễm bệnh 31 Hình 3.1 Ruộng cà chua và vừng bị héo xanh do vi khuẩn 41 Hình 3.2 Cây cà chua và cây vừng bị chết héo xanh do vi khuẩn ngoài

đồng ruộng 44 Hình 3.3 Lát cắt dọc đoạn thân sát cổ rễ cây cà chua và cây vừng biểu

hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn 44 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng phân lập vi khuẩn gây

bệnh héo xanh 48 Hình 3.5 Sản phẩm PCR của đại diện một số chủng R solanacearum

với cặp mồi P.759/760 trên gel agaroza 1% 51 Hình 3.6 Sự chuyển hoá nguồn cacbon của các chủng thể hiện độc tính 53 Hình 3 7 Vòng ức chế phát triển của các chủng vi khuẩn độc VT3,

ML2002 do các chủng N1,17 gây ra 57 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng đối kháng đại

diện 59 Hình 3.9 Tế bào của chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng NA4 chụp dưới

kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 10.000 - 20.000 lần 59 Hình 3.10 Kết quả thử kit API 20 NE và Vitek của đại diện một số chủng

đối kháng 62 Hình 3.11 Biến động quần thể của hai chủng vi khuẩn nội sinh NA3 và

NA4 trong mô rễ cây vừng 64 Hình 3.12 Sự tồn tại của vi khuẩn NA3 và NA4 trong gian bào mô rễ

cây vừng 65

Trang

xi

Hình 3.13 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của các chủng

vi khuẩn đối kháng đối với cà chua 69 Hình 3.14 Tác dụng kích thích sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lên

cây cà chua giống VL2500, Trang Nông 72 Hình 3.16 Tác dụng phòng trừ bệnh của các chủng đối kháng với vi

khuẩn R solanacearum trên cây vừng trong điều kiện nhà kính 76 Hình 3.17 Hiệu quả đối với vi khuẩn R solanacearum của tế bào hai

chủng đối kháng nội sinh trên cây vừng 78 Hình 3.18 Hình ảnh cây vừng ngoài đồng ruộng 80 Hình 3.19 Tỷ lệ % cây vừng sống sót của thí nghiệm đồng ruộng 81

xii

Mở đầu

1.Tính cấp thiết của đề tài

N-ớc ta có điều kiện khí hậu, đất đai phù hợp với hầu hết các loại rau

và cây công nghiệp gieo trồng trên thế giới, lại còn có thể sản xuất gần nh- là quanh năm Đây là những lợi thế không phải bất kỳ n-ớc nào trên thế giới cũng có Với kinh nghiệm lâu đời của ng-ời sản xuất, ngành sản xuất rau và cây công nghiệp không chỉ cung cấp những sản phẩm cho tiêu dùng nội địa

mà còn xuất khẩu sang các n-ớc vĩ độ thấp nh- bắc châu Á, châu Âu và Bắc

Mỹ … [12]

So với cây l-ơng thực và nhiều loại cây khác cây vừng và cà chua là những cây có giấ trị kinh tế cao trên một đơn vị diện tích Do vậy phát triển trồng vừng và cà chua không chỉ thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp mà còn nâng cao thu nhập cho ng-ời sản xuất

Cây vừng có tên khoa học là Sesaum indicum L, là cây lấy dầu với bộ

phận thu hoạch chủ yếu là hạt Hạt vừng có hàm l-ợng dầu rất cao, giá trị sử dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết cũng nh- ở dạng hạt thô Bên cạnh giá trị dinh d-ỡng, cây vừng còn là loại cây chịu hạn, có thể trồng ở các vùng đất nghèo dinh d-ỡng nh- đất cát pha đất cát Bên cạnh đó vừng là loại cây nhiệt đới có thể chịu đ-ợc nhiệt độ từ 25- 32oC, vì vậy chúng

đ-ợc trồng khá rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và các tỉnh Nam trung bộ n-ớc

ta Vòng đời sinh tr-ởng của vừng khá ngắn chỉ vào khoảng từ 60 đến 90 ngày nên lợi ích do phát triển trồng vừng đem lại là rất cao [12]

Cà chua (Lycopersion esculentum Mill) là loại rau ăn quả quan trọng

đ-ợc trồng phổ biến trên khắp thế giới, từ xích đạo Bắc cực (Alaska) Cà chua không chỉ để ăn t-ơi mà còn là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến ra hàng loạt sản phẩm đa dạng và phong phú nh- n-ớc uống, sốt cà chua, dạng bột, cà chua đóng hộp nguyên quả Về sản l-ợng, cà chua chiếm 1/6 tổng sản l-ợng rau hàng năm trên thế giới và luôn ở vị trí số một Theo số liệu của FAO (2002), diện tích trồng cà chua trên thế giới năm 2002 đạt xấp xỉ 3,754 triệu ha, sản l-ợng đạt 98,62 triệu tấn ở n-ớc ta cà chua đ-ợc trồng

nhiều ở các tỉnh miền Bắc, là loại cây ngắn ngày nh-ng cho hiệu quả kinh tế cao Ngoài việc tăng l-ợng cà chua cung cấp cho thị tr-ờng trong n-ớc, còn phải cung cấp nguyên liệu một số nhà máy chế biến cà chua cô đặc và xuất khẩu ở dạng quả t-ơi

Nh-ng thực tế, vấn đề trồng vừng, cà chua trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, gặp rất nhiều khó khăn bởi bệnh héo xanh do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum gây ra Đây là một trong 5 loại bệnh cây trồng thuộc

đối t-ợng quan tâm nhất của ch-ơng trình phòng trừ tổng hợp của FAO Theo báo cáo tại hội nghị quốc tế tổng kết về bệnh héo xanh của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau Châu á (AVRDC), thì thiệt hại do bệnh này có thể là 100% Riêng ở Đài Loan thiệt hại đối với thị tr-ờng cà chua sạch hàng năm vào khoảng 12 triệu đô la [56] Ước tính mức độ thiệt hại cho sản xuất cà chua

do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra là 15%  95% [76]

ở n-ớc ta bệnh héo xanh do vi khuẩn đã phát sinh ở hầu hết các địa ph-ơng có trồng các cây nh-: vừng, cà chua, lạc, thuốc lá, khoai tây, ở các tỉnh, thành phố: Hà nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Nghệ An có nơi có lúc bệnh gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 100% cây trồng Tình hình gây hại là nh- vậy nh-ng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở vừng và cà chua ch-a nhiều, chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của bệnh và b-ớc đầu xác

định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống cà chua hiện có ở Việt Nam ch-a có các công trình nghiên cứu cơ bản về mức độ biến dị tính trạng độc, sự

đa hình di truyền (đa hình ADN) các cá thể trong quần thể của vi khuẩn gây bệnh và sự l-u hành của chúng ở các vùng sản xuất khác nhau làm cơ sở khoa học cho các giải pháp phòng chống và chọn, tạo giống kháng bệnh Tuy nhiên

do bản chất kháng bệnh và sự biến đổi đặc tính độc của các phân lập vi khuẩn gây bệnh trên toàn thế giới nên các biện pháp phòng chống thay thế nh- phòng trừ sinh học đang thu hút đ-ợc sự quan tâm đáng kể

Phòng trừ sinh học bệnh héo xanh bằng các vi sinh vật đối kháng với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum đã cho thấy nhiều hứa hẹn khả quan và là biện

pháp rất cần thiết để thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật hoá học

Do đó, vấn đề phân lập và bảo quản một bộ s-u tập những chủng vi

khuẩn R solanacearum có độc tính cao để sử dụng trong việc chọn, tạo giống

vừng và cà chua kháng bệnh héo xanh, đồng thời tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với chúng và kích thích sự sinh tr-ởng, phát triển cây chủ nh- các tác nhân phòng trừ sinh học là rất cần thiết Xuất phát từ những lý do và

đòi hỏi nêu trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sinh học để kiểm soát bệnh héo rũ cây trồng do vi khuẩn (the bacterial wilt)"

2 Cơ sở khoa học của đề tài

Bệnh héo xanh cây trồng ngày càng gây thiệt hại trầm trọng trong thực

tế sản xuất ở Việt Nam và trên toàn thế giới Hơn nữa vi khuẩn gây độc ở các vùng địa lý khác nhau và các cây ký chủ khác nhau là có thể không giống nhau Vì vậy cần phải có những nghiên cứu cơ bản để có những kết quả chính xác và khoa học về loài vi khuẩn này để từ đó có những biện pháp phòng trừ hiệu quả

- Dựa vào các ph-ơng pháp truyền thống và ph-ơng pháp sinh học hiện

đại nh- ph-ơng pháp nhân bản (PCR) để nhận dạng, giám định vi khuẩn R

solanacearum nòi độc và vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn này

- Các cặp ADN mồi và kỹ thuật nhân bản đã thực sự là một công cụ hữu hiệu cho phép nhận dạng nhanh chóng vi khuẩn gây bệnh Điều này có nghĩa

là hiện nay các nhà khoa học nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn đã có thể phát hiện các dạng di truyền mới từ các dạng hiện có, những đặc tính gây độc phổ cây chủ tiềm tàng

- Dựa vào một số ph-ơng pháp phân lập, thử nghiệm vi sinh vật có khả

năng kích thích sự phát triển của cây trồng (chủ) và đối kháng với vi khuẩn R

solanacearum để góp phần vào chiến l-ợc phòng trừ tổng hợp vi khuẩn gây

bệnh này

- Các nhà khoa học đang tiến dần tới chỗ xác định đ-ợc cơ chế của quan hệ vi khuẩn gây bệnh cây chủ, mức độ độc tính và quan hệ vi khuẩn đối kháng - cây chủ – vi khuẩn gây bệnh, để tiềm tàng khả năng can thiệp và tác

động lên quá trình hình thành dịch bệnh theo h-ớng mong muốn của con ng-ời

3 ý nghĩa khoa học, thực tiền của đề tài

Góp phần làm sáng tỏ từ tìm hiểu mức độ đa dạng sinh học và độc tính của quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh để giải thích nguyên nhân lan rộng

của bệnh đến mức độ trầm trọng ở một số tỉnh thành ở Miền Bắc và Miền Trung Việt Nam

- Khẳng định sự có mặt của R solanacearum nh- là một trong những

loài vi khuẩn chính gây ra các vụ dịch chết héo xanh cây vừng đang phổ biến

ở nhiều địa ph-ơng góp phần làm sáng tỏ nguyên nhân bùng phát dịch bệnh héo xanh tới mức trầm trọng ở Nghệ An

- Chứng minh sự đa dạng sinh học của R solanacearum và vi khuẩn đối

kháng với chúng ở Việt Nam

- Xác định đ-ợc những chủng vi khuẩn có tác dụng kích thích sinh

tr-ởng cây cà chua và hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn R solanacearum

- Lần đầu tiên ở Việt Nam xác định đ-ợc những chủng vi khuẩn nội

sinh cây trồng có hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn R solanacearum trong

điều kiện nhà kính và đồng ruộng

4 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn một bộ s-u tập những chủng vi khuẩn R

solanacearum gây bệnh héo xanh vừng, cà chua và vi khuẩn đối kháng với

chúng

- Xác định và sử dụng một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh chết héo, đồng thời kích thích cây sinh tr-ởng phát triển và có triển vọng áp dụng thực tiễn, nhằm góp phần vào việc phòng trừ bệnh héo xanh có hiệu quả

5 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn, phân lập và tuyển chọn các

chủng R solanacearum gây bệnh héo xanh trên vừng và cà chua

- Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mới đặc hiệu loài AU.PT59/ 760 để

nhận dạng nhanh vi khuẩn R solanacearum

- Phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn hệ rễ, vi khuẩn nội sinh

đối kháng với R solanacearum

- Đánh giá mức độ kích thích sinh tr-ởng của một số chủng vi khuẩn

đối kháng lên cây và hoạt lực đối kháng với vi khuẩn R solanacearum trong

điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính và ngoài đồng ruộng trên cây vừng và cà chua, đồng thời tìm hiểu sự t-ơng tác giữa vi khuẩn đối kháng – cây chủ – vi khuẩn gây bệnh

Ch-ơng I Tổng quan tàI liệu

1.1 Tình hình gieo trồng vừng và cà chua ở Việt nam và trên thế giới 1.1.1 Tình hình gieo trồng vừng

ở n-ớc ta, vừng đ-ợc trồng nhiều tại Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Quảng Bình, và một số ít tại vùng Bắc bộ Thờivụ gieo trồng vừng th-ờng là:

- Vụ xuân: từ 15 tháng 2 đến 10tháng 3 (tuỳ điều kiện canh tác)

- Vụ hè thu: từ 10 tháng 5 đến 5 tháng 6 (tuỳ điều kiện canh tác)

Giống vừng đ-ợc trồng chủ yếu là giống vừng V6 (vừng trắng) của Nhật đ-ợc nhập vào Việt Nam cách đây 10 năm và năm 2000 đ-ợc công nhận

là giống chuẩn quốc gia Năng suất trung bình đạt 1,2 tấn/ha Ngoài ra còn có giống vừng địa ph-ơng nh- vừng đen, vừng trắng, Cây vừng có khả năng chịu hạn tốt nh-ng khả năng chịu úng kém Cây vừng dễ trồng, không đòi hỏi vốn đầu t- lớn Vừng không kén đất nên có thể sinh tr-ởng, phát triển tốt trên nhiều loại đất Đất trồng vừng phải là đất dễ thoát n-ớc vì cây vừng chịu úng kém

Sản l-ợng vừng trên thế giới là khác nhau, sản l-ợng hàng năm 2 triệu tấn chủ yếu ở Châu á (55 - 60%), Châu Mỹ (18 - 20%), Châu Phi (18 - 20%), ngoài ra còn có ở Châu âu, Châu Đại D-ơng tuy chỉ rải rác, không nhiều Các quốc gia trồng vừng trên thế giới là ấn Độ (400.000 tấn/năm), Trung Quốc (320.000 tấn/năm), Su Đăng (200.000 tấn/năm), Mêxicô (180.000 tấn/năm)

1.1.2 Tình hình gieo trồng cà chua

Cà chua đ-ợc trồng rất phổ biến ở n-ớc ta, những năm gần đây diện tích trồng cà chua vào khoảng 10000 - 12000 ha mỗi năm Cà chua đ-ợc trồng chính vụ vào tháng 10 hàng năm và thu hoạch đến hết tháng 2 năm sau, nh-ng th-ờng có vụ sớm và vụ muộn Vụ sớm đ-ợc trồng vào tháng 8 hàng năm còn

vụ muộn vào tháng giêng năm sau ở miền Bắc cà chua đ-ợc trồng chủ yếu ở những vùng ven đô và những vùng trọng điểm canh tác rau màu của một số

tỉnh, thành phố nh-: Hải D-ơng, H-ng Yên, Hải Phòng, Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Vĩnh Phúc Hơn 70% sản l-ợng (khoảng 80000 tấn) đ-ợc thu hoạch trong vụ đông xuân (tháng 12 năm tr-ớc đến tháng 3 năm sau)

Theo số liệu của FAO năm 1999, trên thế giới hiện có 158 n-ớc trồng

cà chua với tổng diện tích khoảng 3,594 triệu ha, đứng đầu trong các loại rau, năng suất trung bình là 25,4 tấn/ha và sản l-ợng hàng năm xấp xỉ 91,29 triệu tấn quả Châu á là khu vực trồng cà chua nhiều nhất: 1,19  1,22 triệu ha và cũng là nơi có sản l-ợng cao nhất: 26,7  28,5 triệu tấn Các n-ớc có diện tích trồng cà chua lớn nh-: Trung Quốc: 339300 ha, Ai cập: 140000 ha, Philipin:

16500 ha, Thái Lan: 12000 ha Nhìn chung diện tích trồng cà chua ở Việt Nam và trên thế giới là rất lớn [33]

1.2 Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.2.1 Khái quát về bệnh héo xanh cây trồng

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh héo xanh do vi khuẩn

Ralstonia Solanacearum gây ra

Năm 1875, Hallier lần đầu tiên đã phát hiện ra loại vi khuẩn gây thối củ khoai tây Sau này, vào năm 1985, E F Smith đã phát hiện thêm và nghiên cứu sâu, rộng trên nhiều loại vi khuẩn và trên hầu hết các loại cây trồng Năm

1892 Halsted khởi đầu cho các nghiên cứu bệnh héo xanh cà chua Càng về sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá, di truyền của các loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Năm 1896 E F Smith đã mô tả bệnh héo xanh do vi khuẩn ở khoai tây, cà chua, cà tím Năm 1909 ông lại phát hiện thêm bệnh này ở cây thuốc lá Năm 1953 Kelman công bố bệnh héo xanh do vi khuẩn ở trên 200 loại thực vật, cùng năm đó ông tìm ra môi tr-ờng 2,3,5 – Triphenil Tetrazolium clorit (TTC) đặc tr-ng để nhận biết loài vi khuẩn này [42]

Năm 1991 Denny, T.P và Back, S.R đ-a ra bằng chứng rằng, chính

polysaccharit ngoại bào (ESP) đ-ợc tạo ra do vi khuẩn P solanacearum (tên gọi cũ của Ralstonia Solanacearum) là nguyên nhân chính gây bệnh héo xanh

[31] Nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới đã cố gắng chứng minh

điều đó và cấu trúc những thành phần chính của polysaccharit ngoại bào đã

đ-ợc xác định (Orgambide etal, 1991) Những gen phức tạp trong quá trình sinh tổng hợp chúng cũng đã đ-ợc tách thành công (Cook and Sequeira 1991) [30].

Cấu trúc thành phần của những thành phần EPS có tính chất axit đã đ-ợc làm sáng tỏ và ng-ời ta đã tìm ra một đơn vị của 2 đ-ờng không thay thế là baclosamin (2,4,6 – trideaxit- glucoza) và galactosaminuronic axit (Orgambide etal, 1991) Một vài gen sinh tổng hợp đ-ợc xác định ở 1 vùng gọi là OPS Chúng

đã đ-ợc xác định là có chứa ít nhất 7 tiểu phần thể hiện chức năng có ảnh h-ởng lên sự tổng hợp của cả OPS và LPS (Lipopolysacharit) E.F.Smith coi bệnh héo xanh là bệnh thực vật quan trọng nhất có nguồn gốc từ vi khuẩn trên toàn thế giới

Loài này còn có tên mới là Ralstonia solanacearum (Hashimoto và cộng sự,

1992)

Trong số hơn 2600 chủng đ-ợc thử thì hơn 500 chủng có ở 4 dạng thực vật đã đ-ợc đặc tr-ng là có khả năng chống chịu cao, bao gồm 3 kiểu dại, chúng có thể sử dụng trong công tác chọn giống và đánh giá giống Mầm bệnh

có thể biến đổi cả về kiểu gen và kiểu hình với phổ cây chủ đa dạng Không chỉ với các cây chủ họ cà mà còn ở cả các loài thuộc 50 họ thực vật khác cũng

đều có thể bị nhiễm (Hayward,1994) [37] Bệnh này phá huỷ chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, nơi mà có các cây trồng chủ yếu nh- cà chua, lạc, khoai tây,

cà tím, gừng Chúng làm giảm năng suất của cây trồng một cách đáng kể

Thông th-ờng xét về mặt hình thái thì những khuẩn lạc dạng chảy sẽ có tính độc nh-ng năm 1990 Xu, PL, Iwata M, Leong, S, Sequeira, L bằng ph-ơng pháp đột biến nhờ gen “nhảy” Tn5, đã phân lập đ-ợc một loạt các đột biến mà hình thái khuẩn lạc không chảy nh-ng vẫn duy trì đ-ợc khả năng gây héo và gây chết thuốc lá Năm 1990 Huang, Y, Sequeira, L đã nhận ra đ-ợc

một vùng (locus) điều khiển chức năng nhân lên của R solanacearum Khi R

solanacearum K60 mang một plasmit có nhiều bản sao chứa dòng cosmit

pE6C (từ nòi K60 kiểu dại) hoặc pBE6 (từ nòi B1 không có tính độc), một vài thay đổi hình thái đã đ-ợc quan sát, cụ thể: Mất tình độc, giảm hàm l-ợng polysachrit ngoại bào và tăng hoạt tính của polygalacturonasa Cả hai cosmit

đều chứa một đoạn ADN có kích th-ớc 8000 đôi gốc bazơ đủ cho sự thay đổi

kiểu hình Nhìn chung có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn R solanacearum ở

các khía cạnh khác nhau, nh- di truyền, sinh lý, sinh hoá, sinh học phân tử v.v…

Năm 1905 ở Indonesia đã phát hiện bệnh héo xanh gây hại trên cà chua, lạc, khoai tây ở vùng Cirebon Tây Java, Breda de Hann (1990) Trong thời kỳ

1992 – 1994 các nhà nghiên cứu đã thu thập và tiến hành xác định nòi (race), thứ sinh học (biovar) của 264 chủng phân lập từ các cây ký chủ nh- cà chua, khoai tây, lạc, cà, ớt Các nguồn vi khuẩn thu thập từ những vùng có độ cao trên 1000 m đã đ-ợc xác định hầu hết thuộc nòi 1, biovar 3, chỉ có 1 hoặc 2 nguồn từ Iran thuộc nòi 1, biovar 4 Machmud (1993)

1.2.2 Biểu hiện triệu trứng của cây nhiễm bệnh

Biểu hiện đầu tiên có thể quan sát thấy đó là những lá non ở phần ngọn của cây bị héo tr-ớc tiên và dần dần rủ xuống Sau đó phần bị héo chuyển dần xuống phía d-ới gốc cây (trong phần lớn các tr-ờng hợp thấy các nhánh cây

có biểu hiện héo tr-ớc) Những triệu chứng điển hình nh- trên th-ờng gặp ở những cây đang vào giai đoạn sinh tr-ởng, phát triển mạnh nhất, đó là thời kỳ cây bắt đầu ra hoa, kết quả Hiện t-ợng này phổ biến đến mức làm cho nhiều nhà nghiên cứu th-ờng băn khoăn tự hỏi, phải chăng có sự biến đổi sinh lý sâu sắc trong cây ở giai đoạn này nên khiến cho cây dễ bị nhiễm và phát bệnh? Berhalim (Halim, 1996) thông báo rằng một số nhà nghiên cứu đã tìm thấy có

sự t-ơng quan tỷ lệ thuận giữa tỷ lệ mắc bệnh và mức độ giảm của hàm l-ợng kali trong cây Nếu quan sát kỹ thì ta thấy có hiện t-ợng vàng nhẹ ở phần gốc cây sát ngang bề mặt đất Triệu chứng này th-ờng là do mức độ sinh sản IAA trong cây tăng lên

Năm 1965 Kelman và Sequeira đã tìm ra đ-ợc một số cơ chế phát sinh của bệnh Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mạch

gỗ mà nó khác biệt so với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa, và gây khối

u Một số giai đoạn của cơ chế phát sinh bệnh do R solanacearum gây ra ở

cây chủ nh- sau:

- Sự xâm nhập của một số ít tế bào vi khuẩn và tiểu phần mô gỗ

- Sự nhân lên của chúng ở vùng mạch và sự lan truyền của quần thể vi khuẩn gây bệnh không gây ra các biến đổi nhận thấy ở vùng mô mềm cận gỗ hoặc các tế bào libe

- Những biến đổi bệnh lý ở phần lớn những thành phần của nhu mô nh- biểu hiện của phản ứng nhiễm bệnh hệ thống th-ờng gặp dẫn đến suy yếu nghiêm trọng sự mao dẫn n-ớc và sự xuất hiện héo xanh

- Phá huỷ thành tế bào và các tế bào nhu mô kế cận, dần dần hình thành các nội hốc xâm nhiễm libe lõi, mô vỏ hoặc phá huỷ đồng thời cùng một lúc nhất là các mô non và cây non Sự cố đầu tiên trong chuỗi các sự cố này có nghĩa quyết định để xác định sự đề kháng của cây chủ và tính đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh Ng-ời ta còn hiểu biết rất ít về các giai đoạn sau của diễn biến bệnh héo xanh Dọc theo phần gỗ phía trong thân cây bệnh th-ờng bắt gặp các vết màu nâu hoặc màu đỏ sẫm ở vùng hệ mạch, càng lên cao dọc theo

Vi khuẩn có từ một đến vài tiên mao và luôn chuyển động Khuẩn lạc của nó th-ờng có bề mặt trơn nhẵn, ít khi gồ ghề, hơi chảy hoặc không chảy, có thể

có màu trắng, trắng đục hoặc phớt hồng Cả nguồn tính độc cao và nguồn tính

độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa (Mehan và cs, 1994) [51]

1.2.3.2 Đặc tính sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Vi khuẩn R solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào

tử, có khả năng tổng hợp poly--hydroxybutyrat nh- là nguồn cacbon dự trữ Mặc dù nó không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang nh-ng nó có thể tổng hợp

sắc tố khuếch tán mầu nâu trên môi tr-ờng thạch có chứa Tyrozin

R.solanacearum có thể khử nitrat thành nitrit và tạo ra khí nh-ng không thể

thuỷ phân tinh bột, hoá lỏng yếu hoặc không hoá lỏng gelatin

Những đặc tính sinh hoá chính của vi khuẩn R solanacearum đ-ợc tóm

tắt ở bảng 1 (Hayward , 1960 và He và cs, 1983) [36, 38]:

Bảng 1.1 Những đặc tính sinh lí sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum

Chú thích:

(+): Phản ứng d-ơng hoặc phát triển đ-ợc

(-): Phản ứng âm hoặc không phát triển

Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển thay đổi từ 25-350C

R.solanacearum có phản ứng khác nhau với chất kháng sinh, các nòi vi khuẩn

có thể mẫn cảm với Streptomyxin, chống chịu với Penixilin, Viomyxin, (He

và cs, 1983) [38]

Về mặt sinh hoá của tính độc, năm 1963, khi nghiên cứu so sánh sự

tổng hợp IAA (axit indol 3-axetic) ở R solanacearum dạng chảy (lỏng) không

cố định có độc tính và dạng chai không độc, Sequeira và Williams đã phát hiện ra rằng cả 2 dạng đều tổng hợp IAA dễ dàng ngay cả khi Triptophan

không có mặt trong môi tr-ờng nuôi cấy Hơn nữa, 1 chủng R solanacearum

có độc tính đã tổng hợp IAA từ nhân vòng của Triptophan chứ không phải từ mạch thẳng Nh- vậy là chủng thuộc dạng khuẩn lạc chảy lỏng và có độc tính này đã không tuân thủ trình tự chuyển hoá: Triptophan → Indol - axetaldehit

→ IAA nh- đã thấy ở hầu hết các vi sinh vật và thực vật bậc cao [55] Trong khi đó, đột biến có dạng khuẩn lạc hình chai không độc lại chuyển hoá cả nhân vòng và mạch thẳng của Tryptophan thành IAA (Sequiera, 1992) [53]

1.2.3.3 Phân loại vi khuẩn R solanacearum

Vị trí phân loại của R solanacearum đ-ợc sắp xếp nh- sau:

Bacteria-Proteobacteria- Proteobacteria- Burkholderiales- Ralstonia solanacearum

Burkholderiaceae-Trong gần 30 năm qua, một hệ thống phân loại theo hai xu h-ớng đã

đ-ợc sử dụng, nó phản ánh những h-ớng tiếp cận thật khác biệt để giải quyết vấn đề phân loại d-ới loài

- Xu h-ớng thứ nhất, đề cao ái lực giữa vi khuẩn với cây chủ và xác lập

ra các nòi “race”

- Xu h-ớng thứ hai, khai thác các đặc điểm sinh hoá đã đ-ợc lựa chọn

kỹ, làm cơ sở để phân biệt thành các chủng sinh học (biovar)

“Chủng” và “chủng sinh học” đều là cách ghép nhóm mang tính hình thức ở mức độ cấu trúc d-ới loài và không bị ràng buộc bởi bất kỳ một khoá phân loại vi khuẩn nào Kết quả 5 chủng đã đ-ợc mô tả dựa vào quan hệ mật thiết với cây chủ và 5 biovar khác nhau dựa vào khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (3 đ-ờng và 3 r-ợu) Biovar 1 và 2 thuộc loại dinh d-ỡng kém linh hoạt so với biovar 3 và 4, giữa các biovar còn khác nhau bởi các hình

ảnh điện di đồ, các protein màng Biovar 1 và 2 còn khác biovar 3, 4 và 5 trên cơ sở các mẫu ADN thăm dò và trên cơ sở phân tích RFLP

Biovar 1 và 2 chiếm -u thế ở châu Mỹ, biovar 3 ở châu á ở Philippin thấy có mặt cả 4 biovar, còn biovar 2 có phân bố địa lý rộng nhất, trong khi đó biovar 3 có đặc điểm dinh d-ỡng linh hoạt hơn cả Có một bằng chứng cho

rằng R solanacearum là một loài cổ, chỉ có quan hệ xa với các loài thuộc chi

Ralstonia Theo phân loại, R solanacearum nh- là một nhóm ở bên trong

Ralstonia đã đ-ợc biết trong nhiều năm dựa vào phân tích số liệu của những

đặc điểm hình thái, lai ADN - ADN hoặc ARN-ARN

Các chủng R solanacearum biến đổi mạnh về các hoạt động sinh hoá,

phổ cây chủ và khả năng gây bệnh Năm 1962, Buddenhagen đã đề cập đến

các sơ đồ phân loại khác nhau và chia R solanacearum thành 3 chủng dựa

trên hình thái và sinh thái học của chúng :

Chủng1: Gồm các cá thể gây bệnh ở thuốc lá, các cây chủ họ cà

(Solanaceae) và một số loài thực vật khác

Chủng 2: Gồm các cá thể gây bệnh ở cây chủ thuộc họ Musaceae

Chủng 3: Gồm các cá thể gây bệnh ở lạc, khoai tây và một số ít cây chủ khác

Năm 1964, Hayward đã nhóm các chủng thuộc loài R solanacearum

thành 5 biovar Dựa vào sự đa hình về chiều dài đoạn ADN đ-ợc tạo ra bởi các enzym cắt giới hạn (RFLP), Cook đã chia các chủng sinh học thành hơn 40

nhóm RFLP [29], [71] Kelman và Hayward cho rằng R solanacearum là một

loài không đồng nhất, đa dạng với tính chuyên hoá khác nhau, bao gồm một

số biovar và pathovar khác biệt nhau [37], [42]

1.2.3.4 Tính độc của vi khuẩn R solanacearum

Kelman đã kết luận rằng có mối quan hệ giữa hình thái khuẩn lạc với tính độc và các chủng tổng hợp polysacharit ngoại bào là các chủng có tính

độc (Kelman và cs 1954) [42] Các nòi đột biến của R solanacearum có thể

đ-ợc phát hiện dễ dàng khi chúng đ-ợc cấy vạch trên môi tr-ờng thạch Kelman có 2, 3, 5- Triphenyl Tetrazolium Clorit (TTC) sau 36-48 giờ (Kelman, 1954) [41] Những đột biến có tính độc hoặc không có tính độc hình thành các khuẩn lạc nhỏ hình chai có một quầng đỏ xẫm nổi bật Nòi dại có độc tính hình thành những khuẩn lạc màu trắng, thể lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm Những đột biến mất độc tính hình chai có thể tách trực tiếp từ cây bệnh tuy với số l-ợng ít so với loại có độc tính Sự hình thành các cá thể không có độc tính trong canh khuẩn dao động phụ thuộc vào

điều kiện bảo quản Những vi khuẩn có độc tính có thể bảo quản dễ dàng trong n-ớc cất vô trùng (Kelman và cs, 1961) [40]

Tổng hợp chất nhầy polysacharit là một thuộc tính chung của tất cả các

chủng phân lập R solanacearum có tính độc (Trigalet và cs, 1992) [60]

Nh-ng khi xem xét trong phạm vi tính đặc hiệu loài thì không thấy có sự liên quan giữa tính độc và sự tổng hợp chất nhầy vì bản thân tính độc là phức tạp hơn nhiều Vì thế, không thể giải thích tính độc của vi khuẩn căn cứ vào sự hiện hữu hay không hiện hữu của chất nhầy polysacharit

Một sự t-ơng quan chặt chẽ giữa việc tạo ra exopolysacarit (EPS) và tính

độc, đ-ợc chứng minh bằng việc tạo ra những đột biến không độc, gen điều khiển

EPS nằm ở vùng gen ops [30] và eps [31] Cấu trúc của polysacarit đã đ-ợc xác

định [53], những đột biến không có polysacarit và không độc hoàn toàn sẽ không

có khả năng hình thành khuẩn lạc trên rễ cây chủ Những số liệu này cho thấy, đã

có mối liên quan giữa tính độc, tính xâm thực vào rễ và chất l-ợng của polysacarit

đã đ-ợc tạo ra trong thân cây

1.2.3.5 Các con đ-ờng xâm nhập của vi khuẩn R solanacearum vào cây chủ

Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mao mạch

thân gỗ, vi khuẩn R solanacearum rất khác biệt với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây thối Những hình thức chủ yếu mà vi khuẩn R solanacearum xâm

nhập vào cây chủ nh- sau (Li và cs, 1981) [45]:

- Do t-ơng tác giữa vi khuẩn gây bệnh với các quần thể đơn bào ăn rễ nh- giun tròn thì tỉ lệ mắc bệnh cao vì giun tròn làm tổn th-ơng và biến dạng bộ rễ của

cây, qua đó vi khuẩn R solanacearum dễ dàng xâm nhập vào bên trong mô mạch

- Do sự chăm sóc làm cho cây bị đứt rễ, sây sát thân, dập lá, mà vi khuẩn tiềm trữ trong đất, không khí hoặc qua nguồn n-ớc có cơ hội tấn công vào cây chủ

- Do côn trùng nh- : ong, kiến, châu chấu… hoặc các loại sâu hại, mang

vi khuẩn R solanacearum, chúng chích hút vào cây, qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm

nhập vào cây chủ Hình thức này rất phổ biến và vi khuẩn lan truyền nhanh có thể làm cho cả một cánh đồng bị chết héo

- Với những vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, chúng có thể xâm nhập qua các lỗ mở ở rễ cây, thuỷ khổng, lỗ ở vỏ khí khổng ở lá

1.2.3.6 ảnh h-ởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh và phát triển bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây vừng và cây cà chua

Các điều kiện ngoại cảnh nh-: nhiệt độ môi tr-ờng, nhiệt độ và độ ẩm của

đất, các loại đất, m-a gió và c-ờng độ chiếu sáng, có ảnh h-ỏng rất nhiều đến sự phát triển và dịch bùng phát thành dịch của bệnh héo xanh

Bệnh héo xanh xuất hiện ở những vùng có nhiệt độ nóng ẩm Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển từ 25-350C, nhiệt độ tối thiểu là 100C và tối

đa là 410C, pH thích hợp 7,0- 7,2 (Kelman và cs, 1994) [42] Nhiệt độ cao làm tăng nhịp độ sinh sản của vi khuẩn gây bệnh trong cây chủ dẫn đến cây héo nhanh hơn, số l-ợng vi khuẩn xâm nhập vào đất nhiều hơn và đó là nguồn gốc cho chu kỳ xâm nhiễm cây bên cạnh tăng lên Nhìn chung nhiệt độ môi tr-ờng ở phạm vi

300C-350C thì nguy cơ mắc bệnh và nhịp độ phát triển của bệnh héo xanh cũng tăng lên

Nhiệt độ trên 250C ở độ sâu 5 cm cùng với độ ẩm đất cao thuận lợi cho bệnh phát triển (Wang và cs, 1983) [67] Độ ẩm của đất và các vi sinh vật đối kháng là quan trọng hơn cả tính chất đất, độ ẩm của đất đã quyết định độ lớn của quần thể vi sinh vật đối kháng và chúng đến l-ợt mình làm tổn th-ơng tới sự tồn

tại và phát triển của R solanacearum trong đất

L-ợng m-a cũng ảnh h-ởng rất lớn đến sự phát triển của vi khuẩn R

solanacearum Những vùng có m-a nhiều bệnh th-ờng nặng hơn Sau khi m-a to,

thời tiết nóng lên hoặc xen kẽ giữa những ngày m-a và thời tiêt nắng đẹp sẽ tạo

điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển và kết quả là hiện t-ợng héo và chết cây sẽ nghiêm trọng (Tan và cs, 1994) [57]

1.3 Vi sinhvật đối kháng

1.3.1 Quan hệ đối kháng trong thế giới vi sinh vật

Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh tr-ởng và phát triển của các loài vi sinh vật khác và chúng th-ờng đ-ợc gọi là vi sinh vật

đối kháng Hiện t-ợng đối kháng đ-ợc quan sát ở nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn có thể trực tiếp (competition, antibiosis) hoặc không trực tiếp (tạo tính kháng của cây chủ) Ng-ời ta còn biết rằng những chủng không độc của R solanacearum có khả năng đối kháng

với những chủng vi khuẩn độc khi lây nhiễm hỗn hợp Việc sử dụng hiện t-ợng đối kháng này trong công tác bảo vệ thực vật đ-ợc gọi là biện pháp phòng trừ sinh học Ph-ơng pháp này đã đ-ợc sự quan tâm và đầu t- rất lớn của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua [61]

Biện pháp sinh học kiểm soát sâu bệnh thực vật đã đ-ợc phát triển, nh-ng đôi khi thực hiện ở điều kiện ngoài tự nhiên lại không có hiệu quả nh- mong muốn Nh- vậy, mối t-ơng quan giữa tính đối kháng của vi khuẩn đã

đ-ợc chứng minh trong phòng thí nghiệm và ngoài thực tế là ch-a chặt chẽ [34] Kích th-ớc vùng ảnh h-ởng đối kháng trực tiếp trên môi tr-ờng thạch

đôi khi không đ-ợc biết chính xác, hơn nữa ở những điều kiện in vitro thì rất

thuận lợi nh-ng lại không có tính thực tế, vì điều kiện ngoài môi tr-ờng

th-ờng là ít thuận lợi hơn điều kiện in vitro, điều này dẫn đến đôi khi kết luận

sẽ là không chính xác [30]

Vùng ức chế sinh tr-ởng trên môi tr-ờng thạch có thể là do những yếu

tố hoá học (pH thấp hoặc cao), sự có mặt của những chất kháng sinh có phổ hoạt động mạnh, hoặc những bacteriocin đặc biệt, hoặc sự có mặt của thực

khuẩn thể [84] Chae Gun Phae đã cho rằng, chủng Bacillus subtilis NB22 có

thể tiết vào đất chất iturin, chất này có khả năng ức chế sinh tr-ởng và phát

triển của vi khuẩn gây bệnh héo xanh [24]

Nhiều tác giả đã đề nghị rằng, sự đối kháng trực tiếp có thể có những cơ

chế khác, không có bất kỳ một sự đối kháng nào thể hiện trong điều kiện in

vitro, lại không có hiệu quả trong việc giảm mức độ bệnh của cây trong điều

kiện nhà kính và trên đồng ruộng, một số chủng độc mất độc tính và không có

hoạt tính kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm, nh-ng lại có hiệu quả giảm

độ nghiêm trọng của bệnh trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng [45], [60])

Mặc dù, d-ới những điều kiện kiểm tra rất thuận lợi, nh-ng ch-a có một trong những tác nhân kiểm soát sinh học nào đã chứng tỏ có hiệu quả cao trên

đồng ruộng Trong hầu hết các tr-ờng hợp, những thí nghiệm trên đồng ruộng

là quá hạn chế [50] Sự bảo vệ cây tr-ớc bệnh héo xanh không có hiệu quả là vì sự hình thành những khuẩn lạc ở rễ cây của những tác nhân kiểm soát sinh học là quá thấp [68], hoặc phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện môi tr-ờng [48]

1.3.2 Vi sinh vật nội sinh đối kháng

Nội sinh (endophyte) theo tiếng Hy Lạp “endon” có nghĩa là bên trong

và “phyte” có nghĩa là thực vật và thuật ngữ này th-ờng đ-ợc áp dụng cho nấm (Carroll, 1988; Clay, 1988) bao gồm nấm cộng sinh (mycorrhizal fungi) (O’Dell và Trappe, 1992) Theo Wilson (1995), định nghĩa nội sinh cho đến nay đ-ợc áp dụng cho cả nấm và vi khuẩn có tất cả hay một phần của chu trình sống xâm nhập vào mô thực vật sống và không gây nhiễm cũng nh- gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho mô thực vật

Nhận thức về môi tr-ờng ngày càng tăng đã thúc đẩy việc phát triển các ph-ơng pháp sinh học thay thế cho các ph-ơng pháp bảo vệ thực vật bằng các tác nhân hoá học Vi khuẩn từ vùng lá (Phylloplane) có thể phòng trừ sinh học một số bệnh cây trồng Hầu hết các vi khuẩn đ-ợc dùng làm tác nhân phòng trừ sinh học đều đ-ợc chọn lọc từ vi khuẩn hệ rễ Tuy nhiên, các vi khuẩn này không đảm đ-ơng đ-ợc vai trò của mình do khả năng tạo dòng kém ở hệ rễ và không bền vững khi nuôi cấy dài ngày Chính vì vậy, quan hệ mật thiết giữa vi khuẩn nội sinh và cây chủ đã khiến vi khuẩn nội sinh trở thành ứng viên tự nhiên cho công tác chọn lọc các tác nhân phòng trừ sinh học do chúng có khả năng tạo dòng hệ rễ cao và đây đ-ợc xem là một tính trạng cần thiết của vi khuẩn nội sinh để xử lý vào hạt hay rễ tr-ớc và khi trồng

Vi khuẩn nội sinh tạo một ổ sinh thái t-ơng tự nh- ổ sinh thái của các vi khuẩn gây bệnh thực vật, đặc biệt là các mầm bệnh xâm nhiễm mạch gây héo

Điều này tạo cho vi khuẩn nội sinh trở nên -u thế khi sử dụng nh- các tác nhân phòng trừ sinh học Có rất nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học hệ rễ cho thấy rằng 5 trong số 6 vi khuẩn hệ rễ cảm ứng kháng hệ thống ở d-a chuột có khả năng tạo dòng rễ cả trong và ngoài (Kloeper và cộng sự, 1992) Vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng

chống lại một số mầm bệnh thực vật nh- Clavibacter michiganensis subsp

sepedonicum, tác nhân gây bệnh thối vòng trên khoai tây (Van Buren và cộng

sự, 1993) và P fluorescens 89B-27 và Serratia marcescens 90-166 cảm ứng kháng với P syringae pv lachrymans, Fusarium oxyporum f.sp cucumerium

và Colletrotrichum orbiculare (Liu và cộng sự 1995a, b, c) ứng dụng vi

khuẩn nội sinh vào cây bông bằng tiêm cành làm giảm thối rễ gây ra bởi

Rhizoctonia solani và héo mạch gây ra bởi F oxysporum f.sp vasinfectum

(Chen và cộng sự, 1995) Xử lý hạt cà chua với chủng vi khuẩn nội sinh

Bacillus pumilis SE4 cản trở đ-ờng vào của nấm bệnh gây héo mạch F oxysporum f.sp radicislycospersici và sự sinh tr-ởng của khuẩn ty chỉ hạn

chế ở biểu bì và bao rễ ngoài (Benhamou và cộng sự, 1998) ứng dụng chủng

P fluorescens 63-28 hạn chế sự sinh tr-ởng của Pythium ultimum ở đậu

(Benhamou và cộng sự, 1996) và F oxysporum f.sp radici-lycopersici ở cà

chua (M’Piga và cộng sự, 1997) Trong số các chủng này, một chủng fluorescent pseudomonas (CCA90) có thể tạo dòng cả bên trong và bên ngoài mô rễ và cành Vi khuẩn nội sinh có thể ức chế triệu chứng bạc lá (Poon và cộng sự, 1977) và các phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây sồi có hoạt tính sinh

học chống lại mầm bệnh gây héo sồi Ceratocystis fagacearum (Brooks và

cộng sự, 1994) [21]

T-ơng tự vi khuẩn nội sinh trong một quần thể hoạt động giống nh- các tác nhân phòng trừ sinh học Stuzz và Matheson (1996) chỉ ra rằng kháng với

sự phát triển bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora var atroseptica

ở củ khoai tây có t-ơng quan âm tính với mật độ quần thể vi khuẩn nội sinh

trong củ khoai tây có thể ức chế sinh tr-ởng mầm bệnh in vitro Chen và cộng

sự (1995) [26] cũng chỉ ra rằng trong số 170 chủng vi khuẩn phân lập từ nội

mô của cây bông, 40 chủng có hoạt tính sinh học chống lại Rhizoctonia solani

ở cây bông và 25 chủng cảm ứng kháng hệ thống với Colletotrichum

orbiculare ở d-a chuột

Crop Genetics International (Hannover, MD) kiểm tra tiềm năng sử dụng vi khuẩn nội sinh đ-ợc tạo ra bằng kỹ thuật di truyền để phòng trừ sinh học bệnh cây trồng nông nghiệp (Fahey và cộng sự, 1991) Bằng kỹ thuật di

truyền, vi khuẩn nội sinh Clavibacter xylli đã đ-ợc chuyển gen nội độc tố delta của Bacillus thuringensis subsp kurtaki vào cây bông để phòng trừ sâu

European corn borer Mặc dù các công nghệ nh- vậy vẫn còn đắt và ch-a

đ-ợc công nhận rộng rãi nh-ng chúng có thể là các hệ thống chuyển thuốc trừ sâu sinh học đích và không gây lo ngại về môi tr-ờng truyền thống nh- sử dụng các tác nhân phòng trừ hoá học

1.4 Biện pháp phòng trừ sinh học bằng ph-ơng pháp sử dụng vi sinh vật

đối kháng với vi khuẩn R solanacearum

Một bức tranh toàn cảnh gồm các công trình nghiên cứu của nhiều tác

giả về biện pháp phòng trừ sinh học vi khuẩn loài R.solanacearum đã đ-ợc Trigalet, Frey và Demery (Trigalet và cs, 1994) [61] đ-a ra nh- sau:

- Các tác nhân phòng trừ sinh học đều cho thấy sự giảm các mức độ

quần thể R solanacearum một cách hiệu quả, mặc dù hầu hết các kết quả đều

ở phạm vi phòng thí nghiệm, nhà l-ới và quy mô đồng ruộng nhỏ Quan niệm

sử dụng phòng trừ sinh học đ-ợc dựa trên khả năng các nhân tố phòng chống cạnh tranh ở vùng rễ quyển, sinh kháng sinh hay cảm ứng cây chủ -u tiên cho

sự tăng tr-ởng của nhân tố phòng trừ sinh học và ức chế sự tăng tr-ởng của R

solanacearum

- Các chủng R.solanacearum không độc và vi sinh vật đối kháng chính

là các tác nhân phòng trừ mà đ-ợc nghiên cứu nhiều trong chiến l-ợc phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Chẳng hạn nh- các chủng không độc có khả năng phòng chống héo ở lạc trong điều kiện nhà kính (He, 1990) Nhiều

chủng có khả năng sản sinh bacteriocin (Cuppels và cs, 1978) và một số chủng sinh bacteriocin không độc có khả năng giảm triệu chứng héo của cà chua trong điều kiện nhà kính (Tsai và cs, 1985; Ren và cs,1988) Bacillus

polymyxa và P.flurescens giảm héo ở cà chua trong điều kiện nhà kính

(Aspiras và De La Cruz, 1986) Hsu và cộng sự (1993) đã công bố rằng cải tạo

đất bằng một hỗn hợp theo công thức ammonium sulphate, bột x-ơng, bột hải

ly, cua, glycerol, xỉ silic và valine đã làm tăng tần xuất tạo khuẩn lạc ở đầu rễ

của các chủng P fluorescens chính vì vậy đã làm tăng khả năng phòng chống

héo cho cây trong các thực nghiệm trong chậu

- Một loài khác P cepacia đ-ợc phân lập từ rễ ngô (Elphinstone và

Aley, 1993) đã cho thấy khả năng đối kháng trong thí nghiệm dịch nuôi cấy

và trong chậu (Hartman và cs, 1993)

- Tanaka và cộng sự năm 1990 đã phát hiện đ-ợc các chủng thực khuẩn thể không độc có vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học đối với vi khuẩn

R.solanacearum Wall và Sanchez năm 1993 đã đ-ợc phát hiện thấy tần suất

cao hơn trong đất không có cây bị nhiễm so với những vùng gần ruộng bị nhiễm kề cạnh

Việc ứng dụng cơ chế kháng ở cây chủ do nhiễm các chủng độc bị sốc

nhiệt, các đột biến không độc hoặc các chủng đối kháng của R.solanacearum

đã đ-ợc thông báo đối với Nòi1 (Averre và Kelman, 1964; Sequeira và cs, 1977; Tanaka, 1983; He và Kang, 1986) Đột biến không độc đ-ợc cảm ứng gen Tn5 có khả năng tạo khuẩn lạc ở rễ cà chua và ngăn cản sự tạo khuẩn lạc của các chủng dạng dại một cách hiệu quả (Trigalet và Trigalet-Demery,

Các giới hạn tác động đến khả năng đối kháng trực tiếp trên môi tr-ờng thạch th-ờng không đ-ợc biết một cách chính xác và các điều kiện cần cho hoạt tính in vitro cực thuận có thể không xuất hiện, chính điều này đôi khi gây

ra một số kết luận không chính xác (Abo-El-Dahab và El-Goorani, 1969; Wagih, 1991) Các vùng ức chế sinh tr-ởng trên môi tr-ờng thạch có thể do các chất hoá học (pH thấp), các chất kháng sinh có phổ hoạt động rộng, do các chất kháng khuẩn đặc hiệu hơn, hoặc do sự có mặt của thực khuẩn thể Các kỹ thuật thích hợp phải đ-ợc hình thành để phân biệt các cơ chế khác nhau này (Vidaver, 1976, 1983; Gross và Vidaver, 1990)

Phản ứng do các chất đặc hiệu gây ra đ-ợc gọi là chất kháng sinh có

ảnh h-ởng đến vi sinh vật Vi sinh vật đối kháng tạo ra những chất này có khả năng ức chế sinh tr-ởng chỉ một số loài nhất định Một số vi sinh vật đối kháng chỉ ức chế vi khuẩn gram d-ơng và một số khác có thể ức chế cả vi khuẩn gram âm và gram d-ơng Một số khác chỉ có tác động đến liên cầu

khuẩn hay Bacillus v v Các chất giống nh- kháng sinh do Pseudomonas

cepacia (Aoki và cs, 1991) và Pseudomonas glumae (Wakimoto, 1987) sản

sinh cần đ-ợc nghiên cứu nhiều hơn để đánh giá vai trò tiềm tàng của chúng

chống laị vi khuẩn R solanacearum ngoài đồng ruộng

Vai trò sinh học của các chất kháng sinh nói riêng và hiện t-ợng đối kháng nói chung là rất quan trọng trong sự sống của vi sinh vật Bằng cách sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của mình, vi sinh vật đối kháng có khả năng

ức chế các tác nhân cạnh tranh ở một mức độ nhất định và chúng điều hoà quần thể vi sinh vật trong tự nhiên

Rất nhiều tác giả cho rằng đối kháng trực tiếp không liên quan đến

inplanta mà có những cơ chế khác nh- cảm ứng kháng cho cây chủ Gợi ý này

dựa trên những quan sát về các chủng mất tính độc không có hoạt tính kháng

invitro lại có hiệu quả giảm độ nghiêm trọng của bệnh trong điều kiện nhà

l-ới và thí nghiệm trên đồng ruộng (Zehr, 1971; Kempe và cs, 1983; Wakimoto, 1987; Trigalet và Trigalet-Demery, 1990) Cảm ứng kháng ở cây chủ do nhiễm nhân tạo các chủng độc bị giết bởi nhiệt, các đột biến không

độc hoặc các chủng đối kháng của R solanacearum vào rễ, cành và lá đã đ-ợc

thông báo rộng rãi (Averre và Kelman, 1964; Sequeira và Hill, 1974; Rathmell

và Sequeira, 1975; Graham cs, 1977; Sequeira và cs, 1977; Tanaka, 1983, 1985)

Các nhân tố quyết định sự phản ứng của cây chủ đối với vi khuẩn đối kháng rõ ràng là rất phức tạp và nhiều hợp chất thực vật có thể là các chất ức chế sự sinh tr-ởng của vi khuẩn này (Sequeira, 1982)

1.4.2 Các loại vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn đối kháng với R solanacearum đ-ợc phân lập từ nhiều nguồn

khác nhau chẳng hạn nh- những vùng đất và vùng rễ quyển ức chế bệnh của

cây chủ Ngoài ra các chủng R solanacearum không độc cũng đ-ợc thông báo

là có hoạt tính đối kháng các chủng độc hoặc là khi nhiễm chung hoặc xử lý tr-ớc những chủng này với cây chủ

Bảng 1.2 Vi khuẩn đối kháng với R solanacearum

Pseudomonas fluorescens

Kempe và Sequeira (1983) Ciampi-Panno và cs (1989) Gallardo và cs (1989) Anuratha và Gnanamanickam (1990)

Pseudomonas glumae Wakimoto (1987)

Erwinia sp Fucikovsky và cs (1989)

Các thể đột biến R solanacearum

không độc

Kempe và Sequeira (1983) Chen và Echandi (1984) Tanaka (1985)

Trigalet và Trigalet-Demery (1990) Hara và Ono (1991)

Triwidodo và cs (1995) Mặc dù vi sinh vật đối kháng hứa hẹn khả năng phòng trừ bệnh này nh-ng ch-a có một tác nhân phòng trừ sinh học nào chứng tỏ có hiệu quả cao trong môi tr-ờng tự nhiên Trong hầu hết các tr-ờng hợp thì thực nghiệm trên

đồng ruộng vẫn còn nhiều hạn chế và việc bảo vệ không đủ cho mục đích sử dụng th-ơng mại (Anuratha và Gnanamanickam, 1990; Tanaka và cs, 1990) Việc bảo vệ không thành công có thể là do sự tạo xâm nhiễm trong rễ của các nhân tố phòng trừ sinh học còn quá nghèo (Chen và Echandi, 1984) hoặc do

sự phụ thuộc quá nhiều vào các điều kiện tự nhiên (McLaughin và Sequeira, 1988) Cho đến nay các thực nghiệm đồng ruộng triển vọng nhất trong phòng

trừ sinh học là việc sử dụng phân lập đối kháng Pseudomonas fluorescens

BC8 (Gallardo và cs, 1989) có thể làm giảm héo ở khoai tây khi dùng nh- một yếu tố bổ sung, tốt nhất là nhiễm ở giai đoạn củ Hơn nữa các nhân tố phòng trừ sinh học d-ờng nh- là rất thích nghi với sự sống sót theo kiểu hoại sinh trong đất bị nhiễm tự nhiên và có thể xâm nhập vào cây qua hệ rễ từ đất

Chiến l-ợc phòng trừ sinh học trong phòng thí nghiệm th-ờng không thành công trong điều kiện đồng ruộng bởi vì các chiến l-ợc này chủ yếu dựa trên những điều kiện phải cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh nh- trong đất bị nhiễm bệnh tự nhiên Trong các vi môi tr-ờng đất và rễ quyển các nhân tố phòng trừ sinh học phải đấu tranh với các nhân tố sinh học và vật chất phức tạp gồm có các cấu phần, cấu trúc, độ ẩm và pH của đất Tất cả các yếu tố này

đều ảnh h-ởng đến cấu trúc của khu hệ vi sinh vật (Nesmith và Jenkins, 1985; Weller, 1988) Trong một nỗ lực để hạn chế các nhân tố này chúng ta phải chuyển sang một ph-ơng pháp mới nh- việc sử dụng nhân tố đối kháng nội ký sinh (Endophytic antagonist) có nguồn gốc từ mầm bệnh dạng dại Nh- vậy các vi sinh vật này sẽ có khả năng thích nghi tốt trong vi môi tr-ờng của cây

và cạnh tranh đ-ợc với mầm bệnh

Việc sử dụng nhân tố đối kháng nội ký sinh có một số -u thế hơn so với việc sử dụng một nhân tố đối kháng bên ngoài Chẳng hạn nh- khi nhân tố đối kháng này bản thân nó đã hình thành đ-ợc trong cây nó có thể vẫn tồn tại khi cây phát triển và bằng cách đó nó liên tục bảo vệ cho cây Nhân tố lý t-ởng này sẽ giữ lại đ-ợc những đặc điểm cần cho sự tạo khuẩn và khả năng sống sót theo kiểu nội ký sinh trong cây nh-ng mất khả năng gây bệnh Nhân tố này có thể tạo khuẩn lạc trong rễ để xâm nhập vào hệ mạch xylem và nhân lên bên trong mô mạch

Các thể đột biến không độc tự phát của R solanacearum bị giảm khả

năng sản sinh polysaccharide ngoại bào (EPS) mà đã đ-ợc giả thiết là nhân tố gây độc Những thể đột biến này đầu tiên đ-ợc Kelman (1954) miêu tả và có thể phân lập một cách dễ dàng (Kelman và Hruschka, 1973) Các thể đột biến nh- vậy đ-ợc xem là nhân tố phòng trừ sinh học cho bệnh héo do vi khuẩn Một số thể đột biến này đã đ-ợc thông báo là có thể nhân lên trong mô của cây chủ mẫn cảm sau khi nhiễm bằng kỹ thuật cắm tăm (Averre và Kelman,

1964) Tuy nhiên, sự lan truyền có hệ thống này của chúng bị hạn chế có thể bởi vì chúng dễ dàng bị kết dính với lectin của cây hoặc bị liên kết với thành

tế bào cây chủ (Sequeira, 1982) Có thể EPS cho phép sự di chuyển có hệ thống của vi khuẩn độc bằng cách ngăn cản quá trình kết dính với thành tế bào

Một mối t-ơng quan mạnh mẽ giữa việc sản sinh EPS và tính độc gần

đây đã đ-ợc chứng minh bằng các thể đột biến mất tính độc đ-ợc cảm ứng bởi

gen nhảy nằm trên nhóm gen ops (Cook và Sequeira, 1991) và eps (Denny và

Baek, 1991) Cấu trúc của polysaccharide quan trọng này đã đ-ợc xác định (Orgambide et al., 1991) và các đột biến không có loại polysaccharide này hoàn toàn không độc và không thể tạo khuẩn lạc trong cây chủ sau khi nhiễm (Trigalet-Demery và cs, 1993) Các thể đột biến mà sản sinh một l-ợng ít polysaccharide này có tính độc rất mạnh sau khi nhiễm vào rễ Các dữ liệu trên đây cho thấy rằng có những t-ơng quan trực tiếp giữa tính độc, sự xâm chiếm rễ sau khi nhiễm và số l-ợng polysaccharide này đ-ợc sản sinh trong

cây Ng-ời ta cho rằng một đột biến R solanacearum có tính độc yếu có khả

năng tham gia kháng bệnh hơn một đột biến hoàn toàn không độc (Hara và Ono, 1991), có lẽ là do đột biến có tính độc yếu có khả năng xâm nhập vào mô mạch và cảm ứng phản ứng kháng của cây chủ trong khi đó thể đột biến hoàn toàn không độc không thể xâm nhập vào bên trong cây chủ và nh- vậy chỉ có thể tạo ra sự đối kháng trực tiếp tại vùng rễ quyển

Một loại đột biến không độc thứ 2 vẫn còn khả năng sản sinh EPS dạng dại nh-ng không có khả năng gây phản ứng siêu nhậy trên cây chủ kháng và

gây bệnh trên cây mẫn cảm Một số đột biến này nằm trên nhóm gen hrp 23

kb (Boucher và cs, 1985, 1987, 1992) Các thể đột biến gen hrp không độc

trên cây cà chua nh-ng vẫn có khả năng xâm nhập qua rễ và nhân lên trong

cây mẫn cảm (Trigalet và Demery, 1986) Các thể đột biến hrp biến đổi theo

sự xâm nhập của chúng khi rễ bị nhiễm mà không gây sát th-ơng nhân tạo; có một sự t-ơng quan d-ơng giữa sự xâm nhập của thể đột biến với mức độ bảo

vệ cho cây; không có thể đột biến nào cho thấy khả năng kháng sinh chống lại

vi khuẩn độc, chính vì vậy đối kháng xảy ra trong cây là do sự cảm ứng cơ chế

kháng của cây chủ và sự có mặt cuả thể đột biến hrp trong mô cây chủ t-ơng

quan với sự giảm khả năng tạo khuẩn lạc của chủng độc trong thân Các dữ

liệu trên cho thấy rằng nhiễm các thể đột biến hrp vào rễ cây tr-ớc đã hạn chế

đ-ợc sự phát triển của bệnh

Một số kết quả khởi đầu sử dụng các chủng R.solanacearum đột biến gen hrp làm nhân tố phòng trừ sinh học bệnh héo ở cà chua đã mở ra một

chiến l-ợc phòng trừ khả thi trong điều kiện đồng ruộng Các kết quả nghiên

cứu đã chứng minh rằng các thể đột biến gen hrp có thể bảo vệ cây khỏi bệnh

từ 80 đến 100% trong những điều kiện thích hợp nhất ngay cả khi nồng độ vi khuẩn độc nhiễm vào cây cao

Tóm lại, vi sinh vật đối kháng đã đ-ợc nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và đã đ-a vào sản xuất nhiều loại chế phẩm Tuy nhiên, hiệu quả trong lĩnh vực phòng chống bệnh héo xanh cây trồng còn nhiều hạn chế, vì phải phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh-: kỹ thuật thâm canh, tiểu vùng khí hậu, giống cây trồng, nhiệt độ, thời vụ canh tác…

1.4.3 ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phát triển nền nông nghiệp bền vững

Sử dụng vi khuẩn nội sinh trong vi nuôi cấy để thúc đẩy thay đổi phát triển và sinh lý của vật liệu thực vật giúp tăng c-ờng kháng stress sinh học và vô sinh ở cây non hình thành từ vật liệu nuôi cấy này ở những vùng khí hậu mùa xuân ẩm và lạnh và mùa trồng trọt ngắn, việc sử dụng vi khuẩn nội sinh

hệ rễ có thể thúc đẩy sự hình thành hạt và ổn định trong các điều kiện bất lợi

và chính vì vậy tối đa hoá thời gian sinh tr-ởng sinh tr-ởng có sẵn Ví dụ nh- trong các điều kiện stress về nhiệt, khoai tây đ-ợc xử lý với vi khuẩn nội sinh

có thể tăng c-ờng khả năng tạo củ (+63%)

Chọn giống cây trồng để cài thiện t-ơng tác cây chủ và vi khuẩn nội sinh Để tăng năng suất cây trồng cần xem xét đến việc cải tạo độ bền vững của t-ơng tác vi khuẩn nội sinh và cây chủ Có thể cải tạo khả năng làm chủ (phản ứng) của cây chủ hoặc chọn các tính trạng có lợi của vi khuẩn trong các quần thể vi khuẩn c- trú trong cây chủ Bằng chứng gián tiếp gợi ý rằng vi khuẩn nội sinh đã thích ứng với cây chủ qua thời gian và mối quan hệ nh- vậy

có thể trở nên đặc hiệu cây trồng (Corn và cộng sự, 1997) Chính vì vậy, một

vài chu trình trong cùng một cây chủ có thể biến đổi vi khuẩn nội sinh để sống trong cây chủ mới đó T-ơng tự một số cây chủ phản ứng với xử lý vi khuẩn nội sinh kích thích sinh tr-ởng hơn các cây chủ khác Ví dụ nh- khoai tây giống Red Pontiac phản ứng tốt với các tác động kích thích sinh tr-ởng sau khi xử lý với vi khuẩn pseudomonad PsJN hơn giống khoai Shepody

Lịch sử canh tác cây trồng và chọn lọc giống cây trồng kích thích quần thể vi khuẩn nội sinh đặc hiệu Quần thể vi khuẩn nội sinh thực vật đóng góp vào quần thể vi khuẩn nội sinh tồn tại trong đất ruộng Khi thực vật chết, thực vật cũng giải phóng quần thể vi khuẩn nội sinh trở lại đất, chính vì vậy mật độ quần thể tỷ lệ trực tiếp với dung tích vật liệu thực vật phân huỷ Ví dụ nh- củ khoai tây chứa mật độ cao quần thể vi khuẩn nội sinh và có thể đóng góp vào quần thể vi khuẩn nội sinh của đất khi củ khoai tây mẹ thối rữa Mở rộng ra với trình tự cây trồng đặc hiệu có thể tạo -u thế xây dựng lên quần thể vi khuẩn nội sinh đặc hiệu Nếu trình tự cây trồng bổ sung có thể lý giải rằng quan hệ nội sinh có lợi đ-ợc củng cố qua thời gian

Tóm lại, vi khuẩn nội sinh thực vật giúp tăng tr-ởng thực vật, kháng bệnh và tăng năng suất cây trồng Để sử dụng chúng hiệu quả hơn cần phải chọn lọc và cải tạo quần thể vi khuẩn nội sinh cây trồng và các nguồn đất của chúng và để ổn định chúng ở mức độ cực thuận Do các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp có thể phá vỡ trạng thái bền vững của quần thể vi khuẩn nội sinh nên cần xem xét sự liên quan của các tác động có hại tiềm tàng trên cây trồng, đất trồng và ngay bản thân bên trong quần thể vi khuẩn nội sinh Chẳng hạn nh- việc sử dụng bừa bãi các loại thuốc hoá học nông nghiệp có thể phá

vỡ thế bền vững của vi hệ sinh thái đất-cây trồng Thách thức với cộng đồng nghiên cứu sẽ là phát triển hệ thống để cực thuận quan hệ có lợi của thực vật

và vi khuẩn nội sinh

1.5 Phân loại vi khuẩn

1.5.1 Phân loại theo ph-ơng pháp truyền thống

- Căn cứ vào khả năng dinh d-ỡng, chuyển động của vi khuẩn, đặc điểm của tiên mao, khả năng hình thành bào tử, tình trạng bắt màu gram, hình thái, kích th-ớc khuẩn lạc và tế bào, đặc tính quang học, đặc điểm sinh lý, sinh hoá

- Dựa trên khả năng sử dụng một số nguồn cacbon để xác định sự tăng tr-ởng hoặc sự thay đổi màu dẫn tới sự giảm màu trong quá trình oxy hoá nguồn C do vi khuẩn [53]

1.5.2 Phân loại theo ph-ơng pháp hiện đại bằng cách sử dụng kit “Api”

và Vitek

Api và Vitek là những kit và hệ thống có kích th-ớc nhỏ, gọn, thuận tiện cho việc xác định nhanh các nhóm vi khuẩn, bao gồm sự kiểm tra đặc

điểm sinh lí sinh hoá, sản sinh enzyme ngoại bào và đặc điểm của bộ máy trao

đổi chất (khả năng và đặc điểm chuyển hoá các chất dinh d-ỡng) của vi khuẩn đích bao gồm cả khả năng đồng hoá các loại đ-ờng Sự kiểm tra mức

độ t-ơng đồng đ-ợc tiến hành theo l-ợc đồ sau: nuôi cấy huyền phù tế bào vi khuẩn cần xác định vị trí phân loại trong các giếng của phiến nhựa 96 giếng

đã đ-ợc tráng với một “chất thử” xác định Trong suốt giai đoạn nuôi cấy sự chuyển hoá “chất thử” dẫn đến làm thay đổi màu canh khuẩn trong các giếng hoặc tự động hoặc khi có bổ sung thêm thuốc thử Kiểm tra khả năng đồng hoá một loại cơ chất nào đó của vi khuẩn đ-ợc kiểm tra bằng cách cấy tế bào chủng vi khuẩn hoà tan trong môi tr-ờng tối thiểu với hoá chất tráng sẵn trong từng giếng của “Kít Api 20 NE” hoặc “Hệ thống Vitek 32” là nguồn dinh d-ỡng thiết yếu duy nhất (nguồn C, N,…) Thông qua mật độ quang học trong mỗi giếng (đục hay trong ) có thể biết kết luận chủng vi khuẩn xác định có phát triển trong một giếng xác định hay không - chủng vi khuẩn chỉ sinh tr-ởng nếu chúng có thể sử dụng cơ chất t-ơng ứng có trong giếng của “Kit”

So sánh kết quả những phản ứng sinh lí, sinh hoá do chủng vi khuẩn cần xác

định vị trí phân loại tạo ra với kết quả trong th- mục dữ liệu chuẩn để có kết luận về vị trí phân loại cần tìm

Ch-ơng II Vật liệu và ph-ơng pháp

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguồn vi sinh vật

- Nguồn vi khuẩn gây bệnh đ-ợc phân lập từ các cây cà chua (giống

Mỹ, Balan, Pháp) và cây vừng (giống vừng Nhật-V6, giống vừng địa ph-ơng)

có biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh điển hình thu thập từ một số tỉnh nh-: Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hải Phòng, Hải D-ơng, Thanh Hoá, Nghệ An

ở các vụ đông và vụ hè từ năm 2003 đến năm 2004

- Nguồn vi sinh vật đối kháng đ-ợc phân lập từ các mẫu cây họ cà, cỏ,

ớt, hành

2.1.2 Các thiết bị hoá chất và một số giống cây nghiên cứu

Giống cà chua Trang Nông và giống VL2000 (giống nhập ngoại của Mỹ) là những giống cà chua sản xuất đ-ợc trồng phổ biến ở nhiều tỉnh thành trong cả n-ớc

Giống vừng V6: Là giống vừng trắng đ-ợc nhập từ Nhật Bản, có tiềm năng năng suất cao và chất l-ợng tốt Đây là giống vừng mới có khả năng chịu hạn khá, thích ứng rộng và đang đ-ợc thực tế sản xuất chấp nhận và đánh giá cao

Giống vừng địa ph-ơng: Là giống vừng trắng và vừng đen mà ở các vùng Thanh Hoá và Nghệ An hay trồng

2.1.3 Các môi tr-ờng và dung dịch đệm chủ yếu

- Môi tr-ờng TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R solanacearum

(Kelman, 1954): pepton 10g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5g; thạch 20g; n-ớc cất 1 lần 1000 ml Khử trùng ở 0,5 at, 121C, 20 phút, làm lạnh đến 60C và thêm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1%