NUÔI cấy mô tế bào THỰC vật THÀNH tựu

KHÁI NIỆMNuôi cấy mô tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bà

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

THÀNH TỰU

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

THÀNH TỰU

Nhóm 2

KHÁI NIỆM

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.

Tính toàn năng của tế bào thực vật.

Sự phân chia, phân hóa, phản phân hóa của tế bào

Các đặc tính trên được xác định dựa trên cơ sở

là đặc điểm di truyền Nhưng sự thay đổi về môi trường cũng có ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc tính trên

CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

VÔ TRÙNG

VÔ TRÙNG

VÔ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG

Dụng cụ trước khi đem sấy phải

được gói kín bằng giấy nhôm

Thời gian duy trì ít nhấp 120p.

Thời gian giảm dần nhiệt độ.

Chọn mẫu cấy phải căn cứ vào: trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu, mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy nhanh Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng nhanh, mức độ nhiễm bệnh ít hơn.

Kích thước và vị trí mẫu cấy

Chất lượng cây cho mẫu cấy

Mục đích và khả năng nuôi cấy

VÔ TRÙNG MẪU CẤY

Phương pháp phổ biến hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật.

Một số hóa chất được lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với mẫu thực vật VD: NaOCl và Ca(OCl)2.

Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn người ta dùng thêm các chất làm giảm sức căng

bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo…hoặc

bìnhChất kháng

sinh 50-100mg/l 30-60 Khá tốt

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

THÀNH PHẦN

Môi trường sử dụng các loại vitamin (quan trọng nhất

Hàm lượng sử dụng của myo-inositol là ≈ 100mg/l môi trường Myo-inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triễn, trong nhiều trường hợp nó còn có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.

Các aminoaxit và amit giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái

 L- arginin dùng cho nuôi cấy rể 10-100mgl/l

 L-tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi 10-100mgl/l

 L-serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn 10-100mgl/l

Các dạng amit được dùng là L-glutamin, L-asparagin

… một số trường hợp còn tham gia cảm ứng và duy trì trong quá trình phát sinh phôi vô tính

THÀNH PHẦN HỮU CƠ

Thành phần hữu cơ phức hợp được dùng trong môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nito, ainoaxit, vitamin và các chất khoáng….

Sử dụng thành phần hữu cơ phức hợp khi môi trường xác định không đạt được kết quả mong muốn về sinh trưởng và phát triễn

THÀNH PHẦN HỮU CƠ

Nồng độ sử dụng là 0,05-0,10% (W/v)

Nồng độ sử dụng là 0,025-0,20% (W/v) Chứa hàm lượng khá cao các loại

có chứa inositol và các chất thuộc nhóm cytokinin như zeatin

Hàm lượng sử dụng : 10-20% (V/v)

Nhóm auxin đưa vào môi trường nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào và tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính.

Các loại auxin thường được xử dụng cho nuôi cấy như IAA(1,0-3,0mg/l), IBA, NOA, -NAA, picloram, pCPA, Diacmba với hàm lượng từ 0,1-2,0mg/l

CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

Nhóm cytokinin kích thích sự phân chia tế bào,

sự hình thành và sinh trưởng của chồi invitro Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rể và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy

Các loại cytokinin thường dùng là Zeatin, Kinetin, BAP, TDZ, 2-ip với hàm lượng 0,1-2,0mg/l

Ngoài axin và cytokinin người ta còn dùng gibberillin để kích thích kéo dài tế bào

CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

Các chất tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy Các môi trường đặc có chứa hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình thường

Than hoạt tính được sử dụng với hàm lượng 0,3% (W/v)

0,2-CÁC THÀNH PHẦN KHÁC

Các thành phần chính ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường:

 Nuôi cấy mô sẹo

 Nuôi cấy tế bào đơn và huyền phù tế bào

 Dung hợp và nuôi cấy tế bào trần

TÍNH THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG

CÁC BƯỚC TRONG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

CÁC BƯỚC TRONG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ (các cây cho

mẫu nuôi cấy)

Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Bước 3: Nhân nhanh

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự

nhiên

Nguyên liệu và thiết bị:

Môi trường MS hoặc NN

Kính hiển vi giải phẩu

Dao, kéo, panh…dùng cho nuôi cấy

Một số hóa chất để pha môi trường

NUÔI CẤY BAO PHẤN THUỐC LÁ

Nhuộm acetocacmin

Nhuộm acetocacmin

Nuôi cấy trên môi trường đặc

Nuôi cấy trên môi trường lỏng

1 Nguyên liệu và cách tiến hành

- Chọn mẫu là những cành bánh tẻ từ những cây có chồi và lá phát triển đều, cân đối

- Mẫu được chọn rửa kỹ bằng nước xà phòng loãng, sau đó rửa lại dưới vòi nước chảy, cho mẫu vào bình tam giác tráng qua cồn, rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi tiến hành khử trùng mẫu.

2 Khử trùng mẫu

- Khử trùng mẫu bằng bằng dung dịch nước Javel (nồng độ 50%), sau đó đổ bỏ dung dịch khử trùng và rửa lại mẫu bằng nước vô trùng

- Dùng dao cấy cắt mẫu khoảng 1,5 cm có mang một đốt lá, sau đó cấy vào môi trường vào mẫu.

- Môi trường vào mẫu là môi trường MS (Murashige and skoog) có bổ sung đường 30g/l; agar 7g/l; BA; NAA.

Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai

3 Quy trình tạo chồi con in-vitro

- Chọn những mẫu sống khỏe, không bị nhiễm nấm, khuẩn được

sử dụng làm nguyên liệu để tạo chồi.

- Dùng dao cấy cắt bỏ hai đầu của mẫu cấy, chỉ giữ lại đoạn mang chồi và cấy vào môi trường tạo chồi.

- Môi trường tạo chồi là môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, BA, NAA

4.Quy trình tạo cụm chồi và nhân nhanh cụm chồi

- Mẫu cấy là các chồi con in-vitro được 3 – 4 tuần tuổi, phát triển tốt, không nhiễm nấm, khuẩn Dùng dao cấy tách cắt lấy chồi và

để nguyên ngọn chồi cấy vào môi trường tạo cụm chồi.

- Môi trường tạo cụm chồi là môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, BA, NAA, kinetin.

Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai

5.Quy trình tạo cây hoàn chỉnh

- Mẫu cấy là các chồi được 3 – 4 tuần tuổi, phát triển tốt, không nhiễm nấm, khuẩn.Dùng dao cấy tách cắt lấy ngọn chồi và cấy vào môi trường tạo cây hoàn chỉnh.

- Môi trường tạo cụm chồi là môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, IBA.

6 Quy trình ra ngoài đồng

*Tiêu chuẩn cây giống

Cây con trong bình nuôi cấy đã qua huấn luyện, cây không bị nhiễm nấm, vi khuẩn, không cong queo, không cụt ngọn, chiều cao từ: 3-5 cm, số rễ: 3-4 rễ.

*Hỗn hợp bầu đất ươm cây

Chuẩn bị ruột bầu đất ươm cây: trộn đất tầng B và cám dừa theo

tỉ lệ 7:3 Sau đó đóng ruột bầu vào túi PE có kích thước 7 x 12cm, xếp đứng bầu đất theo luống đểtiện việc chăm sóc cây sau này

Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai

*Xử lý cây mầm và bầu đất trước khi ươm cây

- Trước khi cấy cây vào bầu đất, phải xử lí bầu bằng cách tưới đẫm bằng dung dich Viben C nồng độ 0,3% trước 24 giờ

- Cây mầm sau khi được rửa sạch, cắt bớt rễ và cấy vào bầu đất Cây cấy thường vào lúc chiều tối để tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào luống cây mới cấy

*Điều kiện nuôi ươm

- Che luống cây mới cấy bằng một lớp nilon trong để duy trì độ ẩm và phủ bên ngoài lớp nilon bằng lưới đen để giảm cường độ ánh sáng cho cây

- Hai ngày sau khi cấy phun dung dịch Viben-C nồng độ 0,3% để diệt nấm

- Nhiệt độ 30-350C, ánh sáng che phủ 50%, độ ẩm 85%.

80-Quy trình nuôi cấy mô cây keo lai

Nhân giống nhanh với số lượng lớn.

Có thể tiến hành ở một số loài TV mà phương pháp nhân giống bình thường không thực hiện được

Tạo ra giống sạch bệnh và tương đối đồng đều

về mặt di truyền

Có thể cho ra cây giống quanh năm

Có thể sử dụng cây nhân giống từ phương pháp nuôi cấy mô để làm cây mẹ cho những phương pháp khác

Hiệu quả kinh tế cao đối với người mua cây nuôi cấy mô về sản xuất kinh doanh

KẾT QUẢ CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Giúp cho nghành nông nghiệp trở nên chủ động hơn trong vấn đề về giống và đảm bảo sự phát triển bền vững.

Thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc

độ vốn có trong tự nhiên.Nhờ đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và làm rút ngắn thời gian đưa ra một giống mới.

Duy trì và bảo đảm được nhiều giống cây trồng quý hiếm.

Ý NGHĨA CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào

instability).

Những công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

THÀNH TỰU NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT