CÔNG NGHỆ bảo QUẢN ĐÔNG LẠNH tế bào THỰC vật

• Sự "tránh hình thành" kết tinh, trong khi vẫn duy trì một mức độ ẩm tối thiểu cần thiết để duy trì sự sống còn, khi xử lý nhiệt độ bảo quản lạnh cực thấp.. • Sự chuyển đổi của dung dị

CHỦ ĐỀ 9:

CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN ĐÔNG

LẠNH TẾ BÀO THỰC VẬT

GVHD: TS Phạm Thị Minh Thu

CHÀO MỪNG CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ ĐẾN VỚI

BUỔI THUYẾT TRÌNH CỦA

NHÓM 9_56SH2

1

II CÔNG NGHỆ

BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ

BÀO

III CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

III CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

IV TÀI LIỆU THAM

KHẢO

IV TÀI LIỆU THAM

KHẢO

• Từ cách tiếp cận làm mát chậm ban đầu, nghiên cứu đã chuyển sang nhiều kỹ thuật dễ dàng hơn, cho phép hoàn thiện quá trình đông lạnh các chất trong tế bào thông qua việc ngâm trực tiếp trong nitơ lỏng

3

•  Sự "tránh hình thành" kết tinh, trong khi vẫn duy trì một mức

độ ẩm tối thiểu cần thiết để duy trì sự sống còn, khi xử lý nhiệt

độ bảo quản lạnh cực thấp. 

• Sự chuyển đổi của dung dịch nước thành một chất vô định hình và đông lạnh chúng (tức là không tinh thể)

II CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN ĐÔNG

2 Phương pháp bảo quản

Sơ đồ phương thức bảo quản

 Môi trường bảo quản: nitơ lỏng

 Mẫu: phôi, mô sẹo, mô nuôi cấy

 Thời gian: 20-30 năm hoặc lâu hơn

 Trước bảo quản mẫu: cần xử lý để tránh sự tạo tinh thể nước trong tế bào gây chết mẫu

Bảo quản mẫu:trong nitơ lỏng(-196 0 C)

Sau bảo quản: phải phá băng (37-40 0 C) để phục hồi mẫu 

nuôi cấy để cho cây hoàn chỉnh

Tách mẫu ở giai đoạn sinh trưởng mạnh để đưa vào bảo

Bảo quản mẫu:trong nitơ lỏng(-1960 C)

Sau bảo quản: phải phá băng (37-40 0 C) để phục hồi mẫu 

nuôi cấy để cho cây hoàn chỉnh

8

• Đảm bảo độ an toàn và sạch

bệnh cao, có khả năng tạo quần

thể cây đồng nhất với số lượng

lớn.

• Với phương pháp bảo quản siêu

lạnh có thể bảo quản được lâu

dài với số lượng lớn và ổn định.

• Hạn chế khả năng mất nguồn

gen, nhất là các nguồn gen có

nguy cơ xói mòn cao, các loài

có nguy cơ bị tuyệt chủng.

• Không có nguy cơ bị ô nhiễm

bởi nấm mốc hoặc vi khuẩn

• Chi phí bảo quản lớn

• Đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại

• Có khả năng tạo ra biến dị Soma với tần

số biến dị khác nhau 9

3 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm Nhược điểm

III CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

1 Cây Vanilla planifolia (thuộc họ lan, thân dây leo)

1 Cây Vanilla planifolia (thuộc họ lan, thân dây leo)

Là giống cây trồng quan trọng trong công nghiệp sản

xuất hương vị và cũng là giống mang tính thương

mại nhất thuộc họ lan

Cách tiến hành

Thực hiện

Tiền xử lý và làm khô

Cẩn thận chọn những hạt nhỏ, tròn đều, đường kính từ 4-5mm

 Xử lý chất bảo vệ: prolin 5-10%, dd DMSO 1M và lactose 10%

Tăng nồng độ từng bước trong môi trường MS: ở nồng

độ sucrose lên 0.1,0.3,0.5,0.7 và 1.0M trong 5 ngày, mỗi ngày ứng với 1 nồng độ

Làm khô những hạt đã được tiền xử lý trên giấy lọc vô trùng trong đĩa Petri và sấy khô trên đĩa mỏng từ 1-10h

ở nhiệt độ phòng

Kĩ thuật trữ lạnh

 Chuyển 10 hạt khô vào mỗi lọ cryo 2.0ml

Làm đông nhanh bằng cách cho trực tiếp lọ

cryo vào nito lỏng

Mẫu có thể được dự trữ trong nito lỏng

trong 10 năm

Hóa lỏng, rã đông, tái tạo thành cây hoàn chỉnh

 Hóa lỏng mẫu bằng cách nhúng trực tiếp lọ cryo vào nước

ở 400 C trong vòng 5-10 phút

 Trồng những hạt đã được rã đông vào đĩa Petri chứa 25ml môi trường MS rắn gồm 30g/l sucrose, 1mg/l BAP và 0,5mg/l IBA, đặt trong tối 7 ngày đầu sau đó chiếu sáng với cường độ

35 µmol/m2/s để cây mẹ phát triển Tốc độ hồi phục 50-70%

 Sau 2 tuần, chồi mọc lên từ hạt đã được rã đông

Sự nảy mầm của hạt

 Sau đó cấy chuyền vào môi trường MS cơ bản để giúp cho sự phát triển của chồi và hệ thống rễ

Cảm ứng tạo rễ: cấy những đoạn chồi có chiều dài khoảng

2cm vào môi trường MS cơ bản Trong vòng 3 ngày ta sẽ thấy được sự hình thành rễ

Cây sau quá

trình tạo rễ

Cảm ứng tạo mô sẹo:

•Nuôi cấy mô, sau đó cắt các nguyên liệu nuôi cấy đẻ chuẩn

bị cho quá trình cảm ứng tạo sẹo

•Cấy các mô cho môi trường MS có bổ sung 1mg/lBA và

0.5mg/l NAA

•Ban đầu giữ cho mô cấy ở trong tối từ 2-5 ngày để cảm ứng tạo sẹo

Tái sinh cây

Cấy các mô sẹo mới hình thành vào môi trường MS có chứa 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA Nuôi cấy cấp 2 trong môi trường MS trong vòng 20 ngày

Mô sẹo sẽ phân hóa thành Protocorm, chồi có rễ trong

khoảng 3-6 tháng

Tách rời và nuôi cấy các chồi phát triển tốt và có tạo rễ cho đến khi cứng cáp rồi đem ra ngoài vườn hay sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống kế tiếp

Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo

1 Cây Nothapodytes nimmoniana

Nothapodytes nimmoniana là một cây thuốc chống ung thư quan trọng có nhiều chất hoạt tính sinh học, trong

đó camptothecin (CPT) là chất quan trọng nhất. 

QUY TRÌNH

Khử trùng và xử lý hạt

• Hạt được tách ra từ quả

• Rửa hạt bằng nước máy để loại bỏ chất nhầy trong 10 phút

• Hạt giống sau đó đã được khử trùng bằng cách ngâm trong 0,01% HgCl2 trong 5-10 phút Tiếp theo rửa trong nước cất

Nuôi cấy phôi đã khử trùng

Mẫu phôi đã được xử lí được nuôi cấy trong môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) ( ở điều kiện: 25±2 0C, thời gian chiếu sáng là 10 giờ sáng/14 giờ tối) nuôi cấy trong 8 tuần

Bảo quản lạnh phôi bằng nito lỏng

(-196OC)

Bảo quản lạnh phôi bằng nito lỏng

(-196OC)

•Phôi tiếp tục được xử lí khô trong 30 phút

•Chuyển các phôi vừa được xử lí vào lọ cryo 2.0ml có chứa sẵn chất bảo vệ

•Cho trực tiếp lọ cryo vào nito lỏng (cần đưa về nhiệt độ tối

ưu cho tế bào)

Đánh giá khả năng nảy mầm của phôi

Các quan sát về sự nảy mầm phôi được thực hiện sau 8 tuần Tỷ lệ sống sót được đánh giá là Tỷ lệ phần trăm của các phôi được thể hiện ở bất kỳ sự tăng trưởng nào, bao gồm cả sự phát triển thành cây con cây, sự phát triển của thân và sự phát triển của rễ

Kết quả thí nghiệm

Hình a: Các trục phôi với lá mầm mới được tách ra từ hạt có độ

ẩm 55,7% và khả năng nảy mầm đạt 86,67% và tăng trưởng

bình thường trong môi trường MS

Mô sẹo sau khi rã đông

Xử lí mất nước (150-180 phút) không chỉ giảm tỷ lệ sống sót xuống còn 16.67-10% mà còn gây ra tăng trưởng bất thường với sự phát triển của hạt trong phôi sống sót

Sự thoái hóa của đọt cây non trong phôi bị khô trong

180 phút

• 12,1% sau 210 phút: không có phôi nào sống sót

Cây con từ phôi bảo quản lạnh sau 60 ngày nuôi cấy trên

môi trường MS cơ bản

IV TÀI LIỆU THAM KHẢO

 STATUS OF CRYOPRESERVATION TECHNOLOGIES IN PLANTS (CROPS AND FOREST TREES) THE ROLE OF BIOTECHNOLOGY Villa Gualino, Turin, Italy – 5-7 March, 2005

•Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật _ Ngô Xuân Bình

• http://tailieu.vn

 Đề tài Vi nhân giống và bảo tồn cây Vani (Vanilla) trong phòng thí nghiệm http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-vi-nhan-giong-va- bao-ton-cay-vani-vanilla-trong-phong-thi-nghiem-10905/

 STATUS OF CRYOPRESERVATION TECHNOLOGIES IN PLANTS (CROPS AND FOREST TREES) THE ROLE OF BIOTECHNOLOGY Villa Gualino, Turin, Italy – 5-7 March, 2005

1 Tài liệu sách:

1 Tài liệu internet:

Công nghệ sinh học thực vật ,tập 1_ Dương Tấn Nhựt_

NXB Nông nghiệp_2007

Công nghệ sinh học thực vật ,tập 1_ Dương Tấn Nhựt_

NXB Nông nghiệp_2007

TRÒ CHƠI

28

1 Khi thực vật bị đông lạnh thường, vấn đề gặp

phải là…… sẽ khiến tế bào bị vỡ.

Trả lời: Tinh thể băng

2 Đơn vị cấu trúc của sự sống.

Trả lời: Tế bào

3 Sự hình thành tinh thể,không làm giảm nhiều

lượng nước trong tế bào,chỉ có thể được nhăn chặn

thông qua….

Trả lời: Đóng băng

4 Nhiệt độ trong môi trường bảo quản càng thấp

thì càng có tác dụng ức chế các quá trình … xảy ra

bên trong tế bào

Trả lời: Sinh hóa

5 Làm chậm các mẫu bảo tồn có mặt của …

Trả lời: Dung dịch bảo vệ đông lạnh

6 Nothapodytes nimmoniana là một cây thuốc …

có nhiều chất hoạt tính sinh học

Trả lời: Chống ung thư