ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

Các phương pháp định lượng vi sinh vật - Phương pháp định lượng trực tiếp bằng buồng đếm - Phương pháp định lượng gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc - Phương pháp MPN - Phương pháp xác đ

Các phương pháp định lượng

vi sinh vật

Các phương pháp định lượng vi sinh vật

- Phương pháp định lượng trực tiếp bằng buồng đếm

- Phương pháp định lượng gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc

- Phương pháp MPN

- Phương pháp xác định sinh khối

- Phương pháp đo độ đục

-Plaque assay

4.1 Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm

Vi sinh vật có thể được xác định số lượng bằng cách đếm trực tiếp trên kính hiển vi.

 Phương pháp này cho phép xác định nhanh số lượng vi sinh vật và thường được ứng dụng với các loại vi sinh vật có kích

thước lớn như nấm men, tảo, protozoa ….

 Hạn chế của phương pháp này là không phân biệt được tế bào sống hay chết , dễ nhầm lẫn tế bào với các mảnh vỡ, các tạp chất trong vật mẫu.

 Có nhiều loại buống đếm được sử dụng trong việc xác định

số lượng tế bào vi sinh vật

4.1 Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm

Ví dụ:

Đếm 16 ô nhỏ

Số lượng tế bào : 200 tế bào Xác định số lượng tế bào ban đầu (OCD)?

4.1 Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm

OCD: original cell density

4.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng phương

pháp đếm khuẩn lạc cho phép đánh giá mật độ của vi sinh vật trong mẫu lỏng bằng cách trãi mẫu trên đĩa Petri ở các độ pha loãng khác nhau với 1 thể tích xác định Các khuẩn lạc xuất

hiện sau thời gian nuôi ủ được ghi nhận và dùng để xác định

mật độ vi sinh vật ban đầu

Phương pháp này dùng để đánh giá mật độ tế bào sống trong mẫu

4.1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

4.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

4.1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

4.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

CFU (colony forming units) is

actually the number of colonies

that develop on the plate CFU is the preferred term because

colonies could develop from single cells or from groups of cells, depending on the typical

cellular arrangement of the

organism.

 D is the dilution as written on

the dilution tube from which the inoculum comes

V is the volume transferred to

the plate.

4.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

4.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (standard plate count- viable count)

4.3 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc xác xuất thống kê

sự phân hoá vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.

Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi trường được chọn lọc, thường 3-10 lần tại 3 nồng độ

pha loãng liên tục.

Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có kết quả dương tính và âm tính

Kết quả âm tính hay dương tính được ghi nhận và đối

chiếu với bảng thống kê (bảng MPN) sẽ được giá trị ước

đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu

4.3 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

4.4 Phương pháp đo độ đục

Đây là phương pháp gián tiếp để xác định nồng độ tế bào bằng cách đo sự thay đổi độ đục Khi vi sinh vật được nuôi ủ trong môi trường lỏng, sự phát triển của vi sinh vật sẽ làm môi trường đục (turbidity), độ đục của môi

trường được đo bằng máy quang phổ (spectrophotometer)

Dựa vào kết quả mật độ quang (OD value) thu được, mật độ tế bào được

ước đoán và xác định.

4.5 Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật

 Trong một số trường hợp, trọng lượng khô của tế bào

được xác định để tính toán mật độ tế bào vi sinh vật (dry weight/ml).

 Tuy nhiên, hạn chế phương pháp này là chỉ dùng cho

những mẫu có chứa hơn 10 8 bacteria/ml

 Cân phân tích có thể dò được 10 -4 grams

 Giả sử trọng lượng khô trung bình của 1 vi khuẩn là

10 -12 grams

 Do đó, mẫu phải chứa >10 8 bacteria/milliliter mới có

thể sử dụng phương pháp này

Các qui trình phân tích

vi sinh vật tiêu biểu

Các chỉ tiêu vi sinh thường được kiểm nghiệm

5.1 Qui trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí

Tổng vi sinh vật hiếu khí?

 Các vi sinh vật sống trong môi trường có O 2

Tại sao phải phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm?

 Xác định mức độ vệ sinh của thực phẩm.

Phương pháp dùng để phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí?

 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Đơn vị : CFU/ml,g

5.1 Qui trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí

Môi trường Plate

Count Agar (PCA)

5.2 Qui trình định lượng tổng nấm men, nấm mốc

Phương pháp dùng để phân tích tổng nấm men, nấm mốc?

 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Môi trường dùng để phân tích tổng nấm men, nấm mốc?

 Phương pháp DRBC Agar (Dichloran rose

Bengal Chloramphenicol Agar)

Đơn vị : CFU/ml,g

5.3 Qui trình định lượng tổng Coliforms

Coliforms là gì?

- Hình que, Gram (-), không tạo bào tử

- Lên men lactose và sinh hơi

5.3 Qui trình định lượng tổng Coliforms

Tại sao phải định lượng tổng Coliforms

Phương pháp định lượng tổng Coliforms

 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Đơn vị : MPN/ml,g

Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn của một môi

trường, một sản phẩm, hay một qui trình sản xuất

5.3 Qui trình định lượng tổng Coliforms

5.3 Qui trình định lượng Coliforms

Định lượng Coliforms phân trong nước bằng màng lọc

5.3 Qui trình định lượng Coliforms

Định lượng Coliforms phân trong nước bằng màng lọc

5.3 Qui trình định lượng Coliforms

Định lượng Coliforms phân trong nước bằng màng lọc

5.3 Qui trình định lượng Coliforms

Định lượng Coliforms phân trong nước bằng màng lọc

- Escherichia coli

- Hình que, không tạo bào tử

- Gram (-), catalase (+), oxidase (-),

Xác định sự hiện diện của E coli

Tăng sinh chọn lọc trong môi trường EC

5.4 Xác định sự hiện diện của E coli

Xác định sự hiện diện của E coli

Phân lập trong môi trường EMB

Xác định sự hiện diện của E coli

Phản ứng IMViC (++ )

Indol test Methyl Red test

Citrate test

VP test (Voges-Proskauer)

Xác định số lượng E coli trong mẫu bằng phương pháp

MPN như thế nào?

5.4 Xác định sự hiện diện của E coli

5.5 Qui trình phân tích Salmonella

- Salmonella

- Trực khuẩn gram (-), không tạo bào tử

- Có tiên mao (trừ S gallinarum)

- Gây tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn,

chủng Sal typhy, Sal paratyphi gây sốt thương hàn

5.5 Qui trình phân tích Salmonella

Tăng sinh 25g mẫu trong 225ml BPW Phân lập Salmonella trong môi trường XLD

Kiểm tra các đặc tính sinh hoá

Salmonella trên môi trường KIA

5.5 Qui trình phân tích Salmonella

Kiểm tra các đặc tính sinh hoá

Kiểm tra khả năng di động

5.5 Qui trình phân tích Salmonella

Kiểm tra các đặc tính sinh hoá

Kiểm tra khả năng Urea hoá (Urease)

Các kỹ thuật phân tích nhanh và hiện

đại vi sinh vật

7.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP

ATP (adenosine triphosphosphate) hiện diện trong tất cả

các tế bào sống (eukaryote, prokaryote) nên sự phát hiện ATP

có thể nhận biết được vật chất sống đang tồn tại.

ATP được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ máy đo ánh sáng

7.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP

Luciferase là một thuật ngữ để chỉ nhóm enzyme oxy hoá có thể sản sinh ra bioluminescence

Luciferase được sử dụng trong các phòng thí nghiệm thường

được tái tổ hợp từ các loại đom đóm (Photinus pyralis)

từ Photinus pyralis

7.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP

Sơ đồ phản ứng phát quang sinh học ATP nhờ luciferase

7.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP

Phương pháp phát quang sinh học ATP có thể phát hiện được 1 pg ATP (10 -12 g), tương ứng 1000 tế bào vi khuẩn (10 -15 ATP/tế bào)

Phương pháp này sử dụng rộng rãi để đánh giá chất

lượng vệ sinh bề mặt thiết bị được sử dụng trong chế biến, sản xuất, đánh giá chất lượng mỹ phẩm, thực phẩm

Qui trình thực hiện đơn giản, cho kết quả nhanh trong vài phút và dễ dàng tự động hoá.

7.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP

Câu hỏi: trong kỹ thuật phát quang sinh học ATP, vấn

đề nào chưa được đề cập mà có thể dẫn đến thu được kết quả sai?

7.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay)

Nguyên tắc của phương pháp ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ lên bề mặt các giếng microplate Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng

Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng các kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase

(HRP), mà xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất (TMB) tạo ra

sản phẩm phát sáng hay có màu

Theo dõi sự phát sáng hay đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện hay định lượng kháng nguyên.

7.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

7.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay)

ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hoá chất

thương mại dùng để phát hiện Salmonella, E coli gây bệnh,

Listeria, độc tố Staphylococcus, thuốc trừ sâu

7.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay)

Câu hỏi: theo bạn, yếu tố quan trọng nhất trong kỹ thuật ELISA dùng để phân tích và nhận diện vi sinh vật là gì?

7.3 Phương pháp lai phân tử

Phương pháp này sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật dựa trên sự phát hiện một đoạn gene đặc trưng của vi sinh vật đó

Câu hỏi: theo bạn, yếu tố mấu chốt cho kỹ thuật này trong nhận diện vi sinh vật là gì?

7.3 Phương pháp lai phân tử

7.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng PCR là một kỹ thuật trong sinh học phân tử dùng

để khuếch đại một trình tự DNA lên hàng ngàn, hay hàng triệu lần nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho trình tự DNA này.

Các ứng dụng của PCR: tạo dòng DNA cho việc giải trình tự, phân loại học dựa trên trình tự DNA, phân tích hoạt động của gene, chẩn đoán các bệnh di truyền, dò tìm và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm

7.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

7.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Câu hỏi: Khuyết điểm của phương pháp này trong sự phát hiện vi sinh vật?

Câu hỏi: thiết kế các bước phát hiện một vi khuẩn gây bệnh lạ bằng cách ứng dụng các kỹ thuật đã học?