Các phương pháp định lượng vi sinh vật trong hệ sinh thái

Vi sinh vật bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử để quan sát. Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật... Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinhđịahoá học (biogeochemical cycles) như vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòng tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe... Trong nước, vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải, vùng nước nông và ngay cả ở vùng nước sâu, vùng đáy ao hồ. Trong không khí, càng lên cao số lượng vi sinh vật càng ít. Số lượng vi sinh vật trong không khí ở các khu dân cư đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực... Hầu như không có hợp chất carbon nào (trừ kim cương, đá graphít...) mà không là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên, formol. dioxin...). Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dưỡng khác nhau : quang tự dưỡng (photoautotrophy), quang dị dưỡng (photoheterotrophy), hoá tự dưỡng (chemoautotrophy), hoá dị dưỡng (chemoheterotrophy).tự dưỡng chất sinh trưởng (auxoautotroph), dị dưỡng chất sinh trưởng (auxoheterotroph)... Chính vì sự phong phú và đa dạng như vậy nên việc tìm hiểu, nghiên cứu sự có mặt và số lượng của chúng cũng như cấu trúc và chức năng và sự phân bố của chúng là vấn đề vô cùng quan trọng. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp định lượng vi sinh vật trong hệ sinh thái bao gồm các phương pháp truyền thống và các phương pháp hiện đại. Chính vì vậy, tôi thực hiện tiểu luận:“Các phương pháp định lượng vi sinh vật trong hệ sinh thái”

mở đầu

Vi sinh vật bao gồm tất cả các sinh vật có kích thớc hiển vi, không thấy rõ

đ-ợc bằng mắt thờng m phải sử dụng kính hiển vi thà phải sử dụng kính hiển vi th ờng hoặc kính hiển vi điện tử

để quan sát

Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất,trên núi cao, dới biển sâu, trên cơ thể, ngời, động vật, thực vật, trong thực phẩm,trên mọi đồ vật

Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn hoá học (biogeochemical cycles) nh vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòngtuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe

Trong nớc, vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải, vùng nớc nông và ngay cả

ở vùng nớc sâu, vùng đáy ao hồ

Trong không khí, càng lên cao số lợng vi sinh vật càng ít Số lợng vi sinh vậttrong không khí ở các khu dân c đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khítrên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực

Hầu nh không có hợp chất carbon nào (trừ kim cơng, đá graphít ) mà không

là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên,formol dioxin ) Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dỡng khác nhau :quang tự dỡng (photoautotrophy), quang dị dỡng (photoheterotrophy), hoá tự d-ỡng (chemoautotrophy), hoá dị dỡng (chemoheterotrophy).tự dỡng chất sinh tr-ởng (auxoautotroph), dị dỡng chất sinh trởng (auxoheterotroph)

Chính vì sự phong phú và đa dạng nh vậy nên việc tìm hiểu, nghiên cứu sự cómặt và số lợng của chúng cũng nh cấu trúc và chức năng và sự phân bố củachúng là vấn đề vô cùng quan trọng

Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp định lợng vi sinh vật trong hệ sinh thái baogồm các phơng pháp truyền thống và các phơng pháp hiện đại Chính vì vậy, tôithực hiện tiểu luận:

“Các phơng pháp định lợng vi sinh vật trong hệ sinh thái”

nhằm cung cấp những sự lựa chọn thích hợp trong việc phân tích và định lợng visinh vật của từng mẫu sinh thái cụ thể

I các phơng pháp định lợng vi sinh vật

trong mẫu sinh thái

là 600 – 1000 dơn vị Từ số lợng này tính đợc số tế bào trung bình trong một ô: Xtb = ∑x ⁄n

n là số lợng các ô vuông đã đếm của lới

I.1.2 Phơng pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu

- Dùng buồng đếm 0,1mm 1/25mm2 thì số tế bào trong canh trờng sẽ là:

X = a x 0,1 x 1/25 x 1000 x f = 1/4 x a x 10 6 x f

Trong đó, a là số tế bào có trong một ô

f là hệ số pha loãng của canh trờng thí nghiệm

- Dùng buồng đếm 0,1mm deft 1/400mm2 thì số tế bào trong canh trờng sẽ là:

X = 4 x a x f x 10 6

Trong đó, X là số tế bào/ml canh trờng

a là số tế bào trong một ô

f là hệ số pha loãng canh trờng

Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:

 Tốn sức lao động khi sử dụng kính hiển vi

 Không có khả năng phân biệt và định lợng đợc tế bào sống và tế bào chết

 Không thích hợp để định lợng vi sinh vật trong mẫu sinh thái do trongmẫu sinh thái có chứa nhiều loại quần thể khác nhau ngoài ra còn có rấtnhiều cặn bẩn nên có thể không phân biệt đợc với vi sinh vật

ứng dụng:

 Phơng pháp đếm trực tiếp hiện nay vẫn đợc sử dụng trong việc xác địnhtạp nhiễm trong qua trình lên men bia do nó đa ra kết quả ngay và khá đơngiản để thực hiện

 Nó thích hợp để định lợng các vi sinh vật trong một canh trờng thuất khiếtvới quần thể đã biết

I.1.3 Nhuộm huỳnh quang bằng thuốc nhuộm DEFT (Direct Epifluorescent)

Nguyên lý:

DEFT là một phơng pháp phân tích vi sinh vật trong đó các vi sinh vật đợc bắtgiữ vào trong một màng lọc, ở đó chúng đợc nhuộm thuốc nhuộm đặc hiệu (đặchiệu DNA, RNA ) có khả năng phát huỳnh quang nh arine orange Quan sát dớikính hiển vi cho phép định lợng nhanh các vi sinh vật có trong mẫu (bai DEFT)

Acridine Orange:

Acridine orange là 1 loại thuốc nhuộm huỳnh quang chọn lọc acid nucleic sửdụng để phát hiện tế bào Acridine orange có tính thấm tế bào và tơng tác vớiDNA và RNA bằng việc cài vào hoặc bằng lực hút tĩnh điện Khi liên kết vớiDNA, nó rất giống với fluorescein với sự kích thích lớn nhất ở bớc sóng 520nm

và phát xạ lớn nhất ở 525nm (màu xanh lá cây) Khi liên kết với RNA, nó thay

đổi bớc sóng kích thích thành 460 (màu xanh da trời) và bớc sóng phát xạ lớn

Hình I.2 Tế bào Bacillus subtilis trớc và sau khi xử lý nhiệt và nhuộm

đánh dấu DNA vi khuẩn bằng sự phát huỳnh quang màu xanh lá cây sáng HIchỉ thấm vào màng tế bào vi khuẩn Gram dơng và liên kết DNA với ái lực lớnhơn so với SYTO9 Do đó, HI thích hợp để đánh dấu DNA vi khuẩn Gram dơngvới huỳnh quang màu vàng sáng Hệ thống Baclight đòi hòi phải có màng tế bàosống và còn nguyên để đảm bảo tính thấm màng vi khuẩn Gram dơng và Gram

âm (3)

H×nh I.3 TÕ bµo S epidermidis sau khi xö lý víi kh¸ng sinh vµ nhuém

H×nh I.3 Vi khuÈn dÞ dìng nhuém DAPI

¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông:

thực phẩm Ví dụ, DEFT đợc sử dụng trong phát hiện các vi sinh vật có trong sữanguyên liệu trong thời gian 20 phút.

I.1.4 Phơng pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp (Direct Fluorescent Antibody Test)

Phơng pháp sử dụng để phát hiện sự có mặt của một phân tử kháng nguyên(protein đặc hiệu điển hình trên bề mặt của virus, vi khuẩn hoặc các vi sinh vậtkhác) Các chất phát huỳnh quang đợc gắn vào vùng bảo thủ của kháng thể Nếukháng nguyên có mặt, kháng thể sẽ liên kết để tạo thành những protein phức đặchiệu và rất nhạy

individual Legionells cells labeled

with FITC-tagged antibody

Cryptosporidium oocysts (smaller

green spheres) labeled with tagged antibody

FITC-Hình I.4 Mô tả phơng pháp kháng thể

huỳnh quang trực tiếp

Ưu điểm:

 Nhạy và đặc hiệu khi sử dụng kháng thể đơn dòng cũng nh kháng thể đa dòng

 Có thể sử dụng đối với các vi sinh vật không thể nuôi cấy dễ dàng

 Có thể đánh dấu, phát hiện đợc từng tế bào

 Có thể quan sát đợc các tế bào trong môi trờng tự nhiên

 Có thể sử dụng nhiều dạng nhiều loại kháng thể đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau để quan sát đợc nhiều loại tế bào trong một mẫu

Kĩ thuật này đã đợc áp dụng rộng rãi, ví dụ định lợng nhanh vi khuẩn E coli

O157: H7 trong thịt bò Mẫu đợc nhuộm kháng thể đa dòng kháng O157 đợc

đánh dáu hùynh quang và kiểm tra trên kính hiển vi huỳnh quang Độ nhạy đợc

so sánh với các phơng pháp chuẩn và cho thấy nó có khả năng phát hiện đợc sự

có mặt của mầm bệnh ở mức 16 CFU/g và thời gian cho kết quả là 1h (DEFT)

I.2 Phơng pháp đếm trực tiếp trên đĩa (1)

Nguyên lý:

Phơng pháp định lợng tế bào dựa trên sự hình thành khuẩn lạc trên môi trờng đặctrng Khi đó, coi mỗi khuẩn lạc là kết quả cảu sự phát triển từ một tế bào

Hình I.5 Xác định vi sinh vật tổng số bằng phơng pháp đĩa thạch

Tiến hành:

Tùy từng loại mẫu sinh thái và tùy mục đích nghiên cứu mà có phơng pháp cũng

nh môi trờng đặc hiệu riêng

- Các mẫu đợc pha loãng ở nồng độ thích hợp sau đó cấy trải lên đĩa môi trờng

- Nuôi cấy ở các điều kiện hiếu khí, kị khí, nhiệt độ và thời gian khác nhau tùythuộc điều kiện sinh trởngvà phát triển của từng loại vi sinh vật và tùy mục đích

- Xác định mật độ vi sinh vật tổng số trong mẫu: Chọn các đĩa khuẩn lạc có sốkhuẩn lạc nằm trong phạm vi đáng tin cậy 25-250 khuẩn lạc Số lợng vi sinh vật

sẽ đợc xác định bằng công thức:

N = C / [ (1 * n 1 ) + (0.1 * n 2 ) ] * (d)

N là số khuẩn lạc trên một đĩa

C = Tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa

n1 = Số đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên

n2 = Số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ 2

d = Nồng độ pha loãng đầu tiên xuất hiện khuẩn lạc

Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:

Ưu điểm:

 Phơng pháp này tơng đối đơn giản, dễ thao tác

 Chi phí máy móc, thiết bị thấp

Nhợc điểm:

Phơng pháp này không thích hợp cho việc định lợng vi sinh vật trong mẫu sinhthái vì:

 Chỉ có khả năng phát hiện và định lợng những vi sinh vật sống có khảnăng nuôi cấy đợc mà không xác định đợc những vi sinh vật sống không

có khả năng nuôi cấy đợc

 Cần có môi trờng chọn lọc đối với từng loại vi sinh vật để phân lập

 Cần kết hợp sử dụng các phơng pháp làm giàu, các thử nghiệm sinh lýsinh hóa để phát hiện từng loại vi sinh vật.

 Tốn thời gian và công sức

ứng dụng:

Phơng pháp này hiện nay vẫn đợc áp dụng để định lợng các vi sinh vật trong cácmẫu nớc, mỹ phẩm, thực phẩm Tuy nhiên, phơng pháp thích hợp nhất đối vớiviệc đinh lợng những canh trờng thuần khiết 1 loại vi sinh vật cụ thể đã biết và

có khả năng nuôi cấy Ví dụ, định lợng coliform

I.3 Phơng pháp FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) (15,16).

ở các sinh vật đa bào, tất cả tế bào đều giống nhau về DNA nhng protein thì lạirất khác nhau Do đó, sẽ rất hữu ích nếu chúng ta có thể tách những tế bào cókiểu hình khác nhau ra Ngoài ra, việc biết có bao nhiêu tế bào biểu hiện protein

và mức độ biểu hiện protein của tế bào cũng đợc quan tâm FACS là một phơngpháp có thể đạt đợc tất cả những mục đích trên

Nguyên lý:

FACS là phơng pháp xác định đặc tính và phân biệt các tế bào trong quần thểkhông đồng nhất dựa trên sự phát xạ ánh sáng đặc hiệu và những đặc tính phátquang của mỗi tế bào)

Tiến hành:

- Đầu tiên, các tế bào đợc đa vào khuôn và đẩy để cho 1 tế bào có thể đi qua một

lỗ nhỏ Tế bào di chuyển xuống dới lỗ trong trạng thái đợc làm rung ở điều kiệntối u để tạo thành các giọt ở một khoảng cách cố định so với lỗ Khi các tế bàochảy xuống theo dòng của chất lỏng, chúng đợc quét tia lase (ánh sáng xanh).Một vài tia lase bị phân tán bởi tế bào (tạo thành hình nón đỏ từ tế bào đỏ) và nó

đợc sử dụng để đếm tế bào Những tia bị phân tán này còn có thể đợc sử dụng để

đo kích thớc của tế bào

- Nếu muốn tách các tế bào của từng quần thể, thì có thể thực hiện bằng cáchgắn những tế bào quan tâm vào kháng thể gắn huỳnh quang Kháng thể chỉ đợcliên kết với những protein đợc biểu hiện trong tế bào cần tách Tia lase kích thíchthuốc nhuộm phát ra màu của ánh sáng đợc phát hiện bởi bộ thu quang, hoặcthiết bị dò ánh sáng (dectector) Bằng cách thu thập thông tin từ ánh sáng (bị tánsắc và phát huỳnh quang), máy tính có thể xác định những tế bào nào cần phảitách rời và thu thập

Hình I.6 Sơ đồ máy FACS

(Các tế bào đợc đánh dấu với kháng thể huỳnh quang màu đỏ hoặc xanh)

- Bớc cuối cùng là phân loại các tế bào đã đợc tích điện Máy tính xác định làmthế nào mà các tế bào sẽ đợc phân loại trớc khi hình thành giọt ở cuối dòng chảy.Khi đã giọt hình thành, một dòng điện sẽ đợc đa vào dòng chảy và giọt mớimang điện sẽ đợc hình thành Các giọt mang điện này đợc cho di chuyển lệchsang phải hoặc trái bởi điện cực tích điện và đi vào trong các ống thu mẫu Cácgiọt không chứa tế bào đợc chuyển đến ống chứa dịch thải Kết quả cuối cùng có

3 ống với những tế bào dới quần thể (loài) thuần khiết Số lợng tế bào trong mỗi

ống có thể xác định đợc và mức độ phát huỳnh quang cũng đợc ghi lại cho mỗiloại tế bào.

- Số liệu FACS đợc ghi lại bởi máy tính có thể đợc hiển thị bằng 2 cách:

Cách 1 (Hình I.7.A): Có thể thấy cờng độ huỳnh quang xanh hoặc đỏ đợc thểhiện trên trục X và số lợng tế bào của mỗi một mức độ huỳnh quang đợc thể hiệntrên trục Y Trong VD này, các tế bào màu đỏ đợc phân loại gấp 2 lần tế bàomàu xanh hoặc tế bào không màu nhng cờng độ ánh sáng của tế bào xanh lại lớnhơn của tế bào đỏ Phơng pháp này là tốt nhất khi tất cả các tế bào đều màuxanh, đỏ hoặc không màu và không tế bào nào có cả 2 màu

Cách 2 (Hình I.7.B): Ngoài cách biểu diễn số liệu nh trên, có một cách khácnhau để xử lý số liệu thu đợc Trục X biểu thị cờng độ của huỳnh quang xanhtrong khi trục Y lại biểu hiện cờng độ của huỳnh quang đỏ Những chấm đennhỏ miêu tả các cá thể tế bào và chúng ta không thể đếm đợc hết những chấm

đen đó nhng có thể quan sát mức mật độ tơng đối của chấm đen ở các góc khác

Từ đồ thị này, có thể thấy không tế bào nào có cả màu xanh và đỏ (trên cùng bênphải) và rất nhiều tế bào không màu (dới cùng bên trái) Số lợng tế bào màu xanh(dới cùng bên phải) tơng đơng với số lợng tế bào không màu nhng số lợng của tếbào màu đỏ (trên cùng bên trái) gấp 2 lần hai tế bào màu xanh và không màu.Mặt khác, chúng ta có thể thấy mức độ phát huỳnh quang của tế bào màu xanhcao hơn so với tế bào màu đỏ Phơng pháp vẽ đồ thị số liệu này đợc sử dụng khicác tế bào có mặt có cả màu đỏ và xanh

A

Hình I.7 Biểu đồ biểu diễn số liệu FACS thu đợc

(Cờng độ ánh sáng phát ra tằng theo chiều mũi tên)

Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:

FACS đợc sử dụng để phân biệt tế bào sống với tế bào chết, phân biệt các dạngkhác nhau của tế bào, phân lập các tế bào sử dụng cho tách dòng hoặc PCR, táchcá tế bào tinh trùng phục vụ cho phân loại hoặc cho việc nhận dạng các tế bàoapopototic Ngoài ra, có thể tách đợc tế bào sống ra khỏi tế bào chết bằng FACS.Các tế bào chết có khả năng thấm ethidium monoazide (EMA), 1 loại hóa chất

có thể xâm nhập vào tế bào và liên kết với DNA dới đèn huỳnh quang KhiFACS hoạt động, các tế bào có chứa EMA (các tế bào chết) đợc tách riêng (15)

I.4 Phơng pháp FCM (Flow Cytometry) (17,20,21)

Cytometry là việc xác định các đặc tính lý học và/ hoặc hóa học của tế bào hoặc của các hạt sinh học khác

Flow cytometry (FCM) là một quá trình trong đó việc xác định đó đợc thực hiện trong khi các tế bào và các hạt trải qua một loạt các thiết bị đo trong một dòng chảy Sự phân loại dòng bằng cách sử dụng các công cụ điện và cơ học để

chuyển và thu nhận những tế bào với một hoặc nhiều đặc tính đo đợc tạo thành một hoặc một loạt các giá trị do ngời sử dụng cài đặt (21)

Nguyên lý: FCM dựa trên nguyên lý tán sắc ánh sáng, kích thích ánh sáng, và

phát xạ ánh sáng của các phân tử thuốc nhuộm fluorochrome phát huỳnh quang

để tạo ra những thông số đặc hiệu từ những hạt và những tế bào có kích thớc từ0,5 đến 40μm Các tế bào đợc tập trung thủy động học trong một ống chứa PBStrớc khi bị chặn bởi một nguồn sáng thích hợp ánh sáng lase thờng đợc sử dụnglàm nguồn sáng trong FCM (17)

Hình I.8 Sơ đồ thiết bị FCM.

Thiết bị sử dụng nguyên lý thủy động học tập trung vào việc trình diện các tếbào trớc tia lase (hoặc bất cứ một nguồn sáng kích thích nào) Mẫu đợc đa vàogiữa ống Dòng kết hợp này sẽ đợc thu nhỏ và đẩy tế bào vào trung tâm của dòngchảy Khi tế bào hoặc các hạt quan tâm chặn nguồn sáng, chúng tán sắc ánhsáng và thuốc nhuộm fluorochrome phát huỳnh quang sẽ phân cắt chúng tạothành các trạng thái năng lợng cao hơn Năng lợng này đợc giải phóng là mộtphoton ánh sáng với đặc tính quang phổ đặc hiệu duy nhất với những thuốcnhuộm fluorochrome phát huỳnh quang khác nhau (Bảng I.1)

Bảng I.1 Phổ huỳnh quang của những fluorochromes thờng đợc sử dụng

Phổ kích thích đợc biểu diễn bằng màu xám trong khi phổ phát xạ đợc biểu diễnbằng màu đen Phần cuối của bảng tóm tắt bớc sóng phát xạ của những nguồnsáng khác nhau sử dụng trong Flow cytometry Bớc sóng 488nm của tia ionargon xuất hiện ở các phổ (From Practical Flow Cytometry, Third Edition,Howard M Shapiro P 245

ánh sáng đợc tán sắc và phát ra từ các tế bào và các hạt đợc chuyển thành xung

điện bằng các detector thích hợp ánh sáng đợc thu lại bằng thấu kính cùng tiêu

điểm tập trung ở điểm giao giữa tế bào và nguồn sáng ánh sáng đợc chuyển đến

những detector khác nhau sử dụng những tấm lọc ánh sáng quang học Ví dụ, dải

ánh sáng 525nm qua tấm lọc đặt trong luồng sáng trớc detector sẽ cho phép ánhsáng xanh đi vào detector Detector sử dụng phổ biến nhất trong FCM là bộ nhânquang (PMT)

Hình I.9 Mô hình sắp xếp các bộ phận quang học trong FCM

Các xung điện xuất phát từ ánh sáng đợc phát hiện bởi PMT đi qua một loạt các

bộ khuếch đại Sự khuếch đại loga thờng đợc sử dụng để đo sự phát quang trong

tế bào Loại khuếch đại này mở rộng phạm vi đối với các tín hiệu yếu và thu hẹpphạm vi đối với những tín hiệu phát huỳnh quang đặc hiệu và mạnh

Sau khi các tín hiệu khác nhau hoặc các xung khác nhau đợc khuếch đại, chúngtiếp tục đợc chuyển đổi thành tín hiệu điện tử cho phép vẽ đợc đồ thị số liệu và

đợc lu giữ trong máy tính

Xây dựng biểu đồ:

Biểu đồ có thể tạo thành bởi một thông số hoặc 2 thông số

 Biểu đồ một thông số:

Biểu đồ một thông số là biểu đồ đếm tế bào trên trục Y và thông số đo trên trục

X Tất cả các biểu đồ một thông số đều có 1024 vạch Những vạch này tơng ứng

H×nh I.10 BiÓu diÔn sè liÖu FCM

tÕ bµo Qu¸ tr×nh ph©n t¸ch c¸c tÕ bµo sö dông c¸c sè liÖu FCM lµ qu¸ tr×nh ph©nlo¹i