Cong nghe Proteinenzyme

Mặc dù không nhiều nhưng cũng đã có những ghi nhận bước đầu như việc sản xuất thành công một số loại vaccine phòng bệnh của Viên vệ sinh dịch tễ Trung ương như vaccine virus viên gan Bkh[r]

Công nghệ Enzyme –

Protein

Mục lục

1.3.1 Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử 7 1.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử 8 1.3.3 Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động 9

2.2.3.1 Các chất kìm hãm không thuận nghịch 9 2.2.3.2 Các chất kìm hãm thuận nghịch 12

2.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

4.1 Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme 52

4.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 56

5.2.1 Điều hòa theo kiểu đóng mở gen tác động 64 5.2.2 Điều hòa tương tác giữa RNA – polymerase với gen promotor 64

6.2 Ứng dụng 69

6.2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 111

6.2.6 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 113 6.2.7 Ứng dụng trong nông nghiệp

Chương 1 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME

1.1 Định nghĩa enzyme

Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đóphản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần Chất cho thêm vào này được gọi làchất xúc tác

Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng cóchất làm tăng các phản ứng, chất đó được gọi là enzyme Enzyme được các cơ thể

sinh vật sinh tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ thể Enzyme

là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ Saunày, các nhà khoa học xác định chúng là protein

Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóahọc trong và ngoài cơ thể Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứngsinh hóa có thể tóm tắt như sau:

- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinhhóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóarất cao

- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phảnứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzymeđược tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ratrong cơ thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởienzyme

- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng

Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chấtprotein Hay nói cách khác, enzyme học là khoa học nghiên cứu những tính chấtchung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme

1.2 Thành phần cấu tạo của enzyme

Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton (cókích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton)

Enzyme được cấu tạo từ các L – α – axitamin kết hợp với nhau bởi liên kếtpeptit Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các enzyme bị thủyphân hoàn toàn tạo thành các L – α – axitamin Trong nhiều truờng hợp ngoài axitamin còn thu được những thành phần khác, người ta chia thành hai nhóm:

 Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo một thànhphần hóa học duy nhất là protein

 Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành phần:

- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme Apoenzyme thường quyếtđịnh tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme.

- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”: như ion kim loại,vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat củamonosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần “apoenzyme” (khi chothẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn có tênriêng là coenzyme Phần agon quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, trựctiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tốgây biến tính

Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử Hiện nay người ta cũng đã xác địnhđược rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu trúc bậc bốn Ởnhững điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly thuận nghịch tạo thànhcác phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ enzyme bị giảm hoặc bị mất hoàntoàn Ở những điều kiện thích hợp các phần dưới đơn vị lại có thể kết hợp lại vớinhau và hoạt độ xúc tác của enzyme được phục hồi

1.3 Trung tâm hoạt động của enzyme

Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kếthợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme.Trung tâm của enzyme được tạo nên do một số axit amin đảm trách Các axit aminkhác trong protein không tham gia gắn với cơ chất mà chỉ làm nhiệm vụ như mộtchiếc khung cấu trúc không gian của chiếc khung đó

1.3.1 Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử

Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp cácnhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính của sợipolypeptit

Các nhóm chức của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzymelà:

- Nhóm SH (sunfidryl) của Cysteine

- Nhóm  - NH2 (amin) của Lysine

- Nhóm OH (Hydroxyl) của Serine, Threonine và Tyrosine

- Nhóm COOH (Cacboxyl) của axit Glutamic, Aspactic

- Vòng imidazol của Histidine

- Vòng indol của Tryptophan

- Nhóm guanilic của Acginine

Khi tạo thành trung tâm hoạt động các nhóm này phải ở vị trí gần nhau và đượcđịnh hướng trong không gian sao cho

chúng có thể tương tác với nhau trong

quá trình phản ứng

Ví dụ, Trung tâm hoạt động của

Colinesteraza bao gồm các nhóm: -OH

của serine, tyrosine, -COOH của

glutamic, imidazolit của histidine

Hình 1.1 : Trung tâm hoạt động của enzym colinesteraza

Các trung tâm hoạt động có thể hình thành dễ dàng khi các nhóm chức ở gầnnhau trên Apoenzyme Nhưng có khi chúng ở xa nhau thì phải hoạt hóa bằng cáchcắt đi một đoạn peptide nào đó, chúng xích lại gần nhau và tạo thành trung tâm hoạtđộng

Ví dụ, Tripxinogen là trạng thái không hoạt động, nhưng khi dưới tác dụng củaenzyme Enterokinaza thì 6 axit amin bị loại ra, các nhóm chức lúc này xích lại gần

và trung tâm hoạt động được dễ dàng

1.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử

Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử thường bao gồm nhóm ngoại(vitamin, ion kim loại ) và các nhóm định chức của các axit amin ở phầnapoenzyme

Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là những kimloại hóa trị 2: Fe, Co, Mn, Zn, Cu…các kim loại này có thể trực tiếp tham gia trongphản ứng xúc tác, liên kết bền với các phân tử enzyme Enzyme bị mất hoạt động saukhi loại bỏ ion kim loại, tuy nhiên hoạt động có thể được phục hồi lại hoàn toàn ngaysau khi thêm ion kim loại vốn có trong phân tử của nó Một số enzyme có thể đượctái hoạt hóa dưới tác dụng của các ion kim loại khác Tuy nhiên sự thay thế nàythường làm thay đổi hoạt độ và tính đặc hiệu của enzyme

1.3.3 Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động

Dựa vào vai trò của trung tâm hoạt động các nhóm chức năng có thể phân thànhcác nhóm sau đây:

- Các nhóm xúc tác: là những nhóm trực tiếp tham gia trong phản ứng kết hợpvới phần phân tử cơ chất bị chuyển hóa, kết hợp với cofacto

- Các nhóm tiếp xúc: kết hợp với phần cơ chất không bị chuyển hóa có vai tròtương tự dây neo buộc cơ chất lại

- Các gốc cấu tạo hay cố định: không trực tiếp kết hợp với cơ chất, nhưngtương tác với các nhóm xúc tác và tiếp xúc, cố định các gốc này trong những vị tríkhông gian nhất định và giữ chúng ở trạng thái hoạt động xúc tác Sự liên hệ giữatrung tâm hoạt động với phần còn lại của cơ chất được thực hiện qua gốc này

1.3.4 Sự tạo thành trung tâm hoạt động

Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có cấu trúckhông gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất cũng giống như ổ khóa tươngứng với chìa khóa (Hình a)

Hình 1.2 Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b)

Từ đó có thể suy ra rằng enzyme có hình thể tương đối vững chắc, cố định, kếthợp với cơ chất như một khuôn nào đó Tuy nhiên dần dần người ta thấy quan niệmcủa Fisher đã không giải thích thỏa đáng được nhiều dẫn liệu thực nghiệm Đến năm

1958, Kosland đã đề ra thuyết “tương ứng cảm ứng” cho rằng phân tử enzyme cũngnhư trung tâm hoạt động của nó không có cấu tạo rắn chắc mà có tính mềm dẻo, cấuhình không gian của nó có thể thay đổi khi tiếp xúc với cơ chất…Theo Kosland thì

trong phân tử enzyme có sẵn các nhóm định chức của trung tâm hoạt động nhưngchúng chưa được sắp xếp ở dạng thích hợp cho hoạt động xúc tác.

Khi tương tác với cơ chất, các nhóm định chức ở phần trung tâm hoạt động củaphân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể cơchất (Hình b) Trong trường hợp này cơ chất và enzyme có sự tương tác yếu Do đó,chúng rất dễ bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩmphản ứng

Các chất có cùng kiểu cấu trúc với cơ chất thực nhưng có sự thay đổi ở một phầnnào đó trong phân tử có thể vẫn kết hợp với enzyme nhưng tạo thành phức chấtkhông hoạt động vì các nhóm định chức của trung tâm hoạt động không được địnhhướng đúng đắn

Ở những enzyme alosteric (enzym dị lập thể, enzym điều hòa) còn có trung tâm

dị lập thể (trung tâm điều hòa) Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chấtkhác Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa alosteric Khitrung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa alosteric sẽ làm thay đổi cấu trúckhông gian của trung tâm hoạt động Do đó hoạt tính xúc tác của enzyme sẽ bị thayđổi theo

Nếu quá trình này làm tăng hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric nàygọi là chất điều hòa dương Ngược lại, nếu quá trình này làm giảm hoạt tính củaenzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa âm Chất điều hòa nàyhoàn toàn không bị biến đổi khi chúng tương tác với enzyme

1.4 Tính đặc hiệu của enzyme

1.4.1 Khái niệm chung

Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữaenzyme với các chất xúc tác khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sựchuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Sự tácdụng có tính lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme

1.4.2 Các hình thức đặc hiệu

Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất

1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng

Đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong cáckiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định

Ví dụ, amino axit có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khửamin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng

ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase,aminoacid oxydase và aminotransferase

1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất

Mỗi một cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng Các enzyme có thểphân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng Mức độ đặc hiệu của các enzymekhông giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức sau:

 Đặc hiệu tuyệt đối

Enzyme chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụngvới chất nào khác Ví dụ, urease hầu như chỉ tác dụng với ure, thủy phân nó thànhkhí cacbonic và amoniac:

Tuy nhiên, ure cũng tác dụng được với các chất khác có cấu trúc gần giống ure(hydroxyure) nhưng với vận tốc bé hơn 120 lần

Các enzyme khác như arginase, glucooxydase cũng thuộc loại có tính đặc hiệutuyệt đối, vì arginase chỉ xúc tác thủy phân L- arginin tạo thành L-ornitin và ure màkhông tác dụng lên este metylic của arginin

Những enzym có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng chínhxác cơ chất của nó

 Đặc hiệu nhóm tương đối

Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân

tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liênkết đó

Ví dụ, lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este.Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptide

 Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)

Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất

Ví dụ, phản ứng khử nước của axit malic để tạo thành axit fumaric dưới tác dụngcủa fumarathydratase chỉ xảy ra đối với axit L - malic mà không tác dụng lên

Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổgiữa các cặp đồng phân không gian tương ứng

Ví dụ, lactatracemase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhaugiữa axit D - và L – lactic, aldo - 1 - epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

 - D - glucose thành  - D – Glucose, v.v Các enzyme này có vai trò quan trọngkhi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyểncác chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấp thụ

Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giốngnhau hoàn toàn về mặt hóa học

Ví dụ, hai nhóm - CH2OH trong phân tử glycerin, glycerophosphatkinase xúc táccho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không phảiC1)

1.5 Cơ chế tác dụng của enzyme

Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gianenzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do kếtquả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kếttham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng,kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng

dễ dàng

Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều sovới trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất xúctác thông thường

Ví dụ, trong phản ứng phân hủy H2O2 thành H2O và O2 nếu không có chất xúctác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là platin thì nănglượng hoạt hóa là 11,7 Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì năng lượnghoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol.

Sự tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sảnphẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:

- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡcác liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng;

- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dướidạng tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là cáctương tác:

- Tương tác tĩnh điện (liên kết ion, liên kết muối, cầu muối, cặp ion): Liên kếtnày được tạo thành giữa nhóm tích điện của cơ chất (S) với nhóm tích điện traisdaaus trong phân tử enzym (E)

- Liên kết hydro: Liên kết này được tạo thành theo kiểu A – H…B, trong đóhydro kết hợp với A bằng liên kết cộng hóa trị, đồng thời tạo liên kết yếu với B Liênkết này được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B là 3A0

- Tương tác VanderWaals: Tương tác này yếu hơn tương tác tĩnh điện và liênkết hydro Tương tác này thể hiện rất rõ khi nhiều nguyên tử của cơ chất có thể đồngthời tiếp cận với nhiều nguyên tử của enzym Nó chỉ xảy ra khi có sự ăn khớp về cấutrúc không gian giữa cơ chất và enzym

Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khácnhau khi có nước.

Chương 2 ĐỘNG HỌC ENZYME 2.1 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme

Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ

cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng

do enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho ta biết được các vấn đềsau đây:

- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme

- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme

- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn cácđơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạtđộng của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độngcủa chúng

- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì người tacần phải kiểm tra về mặt lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động của chếphẩm enzyme trong các giai đoạn tinh chế

2.2 Động học các phản ứng enzyme

2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì vận tốc phản ứng phụ thuộctuyến tính vào nồng độ enzyme

Đường biểu diễn có dạng: tốc độ phản ứng v= K[E] có dạng y=ax

Khi thừa cơ chất thì khi nồng

độ enzyme tăng vận tốc tăng Khi

nồng độ enzyme bão hòa với nồng

độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng

vận tốc không thay đổi

Hình

2.1 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Giả sử phản ứng chỉ có một cơ chất S và tạo thành sản phẩm P, phản ứng xảy ranhư sau:

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES

Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S

Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P

Với k1, k -1, k2 là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng

[E0] = [E] + [ES] => [E] = [E0] - [ES] (3)Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:

(k -1 + k2)[ES] = k1([E0] - [ES])[S]

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis - Menten

Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme Km đặc trưngcho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với

cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn

Hình 2.2 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

Khi tăng [S] thì V phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì V đạt đếngiá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]

Khi Km = [S] thì V0 =1/2 Vmax

Để thuận tiện hơn Lineweaver và Burk (1934), trên cơ sở của phương trình (5)

đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối vớiviệc nghiên cứu kìm hãm enzyme

sản phẩm P) mà nó cũng đúng trong những trường hợp phức tạp hơn, phản ứng gồmhai hay nhiều cơ chất tạo thành nhiều sản phẩm

2.2.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitior)

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tínhcủa enzyme Nó có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, và cả protein Cơchế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch2.2.3.1 Các chất kìm hãm không thuận nghịch

Chất kìm hãm (I) kết hợp với enzyme (E) tạo thành phức chất Enzyme – chấtkìm hãm (EI) theo phản ứng sau:

Nếu K2 = 0 phức chất

EI hoàn toàn không phân ly Sự kìm hãm ở đây là không thuận nghịch

Dưới tác dụng của các chất kìm hãm không thuận nghịch, mức độ kìm hãm tăngtheo thời gian tác dụng, nếu nồng độ chất kìm hãm đủ lớn để bão hòa enzyme thìcuối cùng phản ứng enzyme sẽ ngừng hoàn toàn Hơn nữa khi loại bỏ chất kìm hãmhoạt tính của enzyme cũng không được phục hồi

2.2.3.2 Các chất kìm hãm thuận nghịch

Phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cânbằng Dưới tác dụng của chất kìm hãm thuận nghịch, hoạt tính của enzyme có thểđược phục hồi sau khi loại bỏ chất kìm hãm

Các chất kìm hãm có thể tác dụng với enzyme theo các cách khác nhau:

 Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition)

Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự cấu trúc của cơchất Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Chúngchiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động, kết quả là enzym không thể kếthợp được với cơ chất để tạo thành phức ES

Ví dụ, Malonic (HOOC – CH2 – COOH) là chất kìm hãm cạnh tranh của enzymesuccinatdehydrogenaza, vì nó cấu tạo gần giống với cơ chất succinic (HOOC – CH2

– CH2 - COOH)

K1

E + I EIK2

Hình 2.4 Kiểu kìm hãm cạnh tranh (competitive inhibition)

Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng củachất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tácdụng kìm hãm hoàn toàn

Trường hợp đặc biệt của kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản phẩm và xảy

ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động ởphân tử enzyme

 Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition)

Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ kết hợp với phức chất ES

mà không kết hợp với enzyme tự do

Hình 2.6 Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh

Tác dụng kìm hãm không bị loại trừ khi tăng nồng độ cơ chất Kiểu kìm hãmnày thường gặp đối với phản ứng nhiều cơ chất trong đó có sự tạo thành nhiều phứcchất trung gian khác nhau

Hình 2.8 Kiểu kìm hãm hỗn tạp

Ngoài ra, chất kìm hãm không những kết hợp với enzyme tự do mà còn kết hợpvới cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P Mức độkìm hãm chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm mà không phụ thuộc vào nồng độ

cơ chất Tốc độ cực đại đo được khi không có mặt chất kìm hãm là cao hơn khi cómặt chất kìm hãm Giá trị Km thay đổi không giống như trong trường hợp cạnhtranh

Tương tự như trên ta có phương trình :

Hình 2.9 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm hỗn tạp

Các giá trị , ’ được định nghĩa như trên Trường hợp  = ’ gọi là kìm hãm

không cạnh tranh (noncompetitive)

Hình 2.10 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm không cạnh tranh

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của kiểu kìm hãm lên Vmax và Km

Trường hợp kìm hãm enzyme bằng nồng độ cao của cơ chất gọi là “kìm hãm cơchất” như kìm hãm urease khi nồng độ ure cao Nguyên nhân của những hiện tượngnày còn chưa được biết rõ Đó có thể là:

- Tồn tại nhiều trung tâm kết hợp với cơ chất bằng các ái lực khác nhau Khinồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ kết hợp với một phân tử cơ chất, còn khi

ở nồng độ cơ chất cao nó kết hợp với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ESkhông hoạt động

- Cơ chất cũng có thể được kết hợp nhờ những vị trí đặc biệt của enzyme Đó

là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác còn

có trung tâm điểu chỉnh

- Cơ chất có thể kết hợp với một chất hoạt hóa và bằng cách này nó tách khỏiE

- Cơ chất có thể choán chổ (ngăn cản) một cofactor hay một coenzyme

- Cơ chất có thể ảnh hưởng đến ion lực của môi trường và qua đó làm mất đitính chuyên hóa của enzyme

2.2.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Là chất làm tăng khả năng xúc tác của enzyme, thường có bản chất hóa học khácnhau có thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của Bảng tuầnhoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc hóa học khác nhau như các vitamin tantrong nước

Ví dụ, Tác dụng của anion clo, brom, iot đến hoạt độ của α – amilaza động vật;tác dụng của một số ion kim loại như Mn2+, Zn+,… đối với hoạt độ của các proteaza.Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quágiới hạn này có thể làm giảm hoạt tính enzyme

2.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứngenzyme càng tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đókhi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do

sự biến tính của protein

Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, thường ở trong khoảng

từ 40-600C Tuy nhiên, mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụthuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phảnứng…

Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt tới hạnthường vào khoảng 700C Ở nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tính, ít ki có khả năngphục hồi Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C hoạt tính của enzyme tuy bị giảm nhưng lại

có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường

Trong hệ thống sống, hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng pháttriển.

Chương 3 Cách gọi tên và phân loại enzyme

3.1 Cách gọi tên enzyme

Theo qui ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme thường gồm hai phần:

- Phần thứ nhất chỉ tên cơ chất (nếu có nhiều cơ chất thì tên các cơ chất cáchnhau bằng dấu hai chấm)

- Phần thứ hai chỉ tên kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, cộng thêm đuôi “ase”hoặc “aza” Hai phần trên cách nhau bằng một dấu nối ngang

Ví dụ, tên enzyme xúc tác sự oxy hóa glycolat thành axit glyoxylic có tên là:glycolat:oxy-oxydoreductase

Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hỗ thì ngườ ta còn thêm sauphâng thứ hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc

Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng:

có tên gọi là L – axitamin : oxydoreductase (deamin)

Ngoài ra hiện nay còn dùng tên thông dụng như amilase, papain, pepsin, Ví dụenzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có:

có tên hệ thống là: Carbamid – amidohydrodase, tên thông dụng: urease

3.2 Phân loại enzyme

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đãthống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1 đến 6 Các số thứ tự này là

2 Transferase:

Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển gốc, chuyển nhóm hóa học từ chấtnày sang chất khác Ví dụ, enzym acyltransferase, glucosyltransferase,aminotransferase, phosphattransferase, cacboxytransferase

3 Hydrolase:

Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ như: amylase,protease, peptidase, lipase

4 Lyase:

Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất

mà không cần nước, hoặc loại nước của phân tử tạo thành nối đôi, hoặc kết hợp nướcvào nối đôi

Ví dụ, hydratase, aldolase, decarboxylase

Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ Mỗi tổ lại chia thành nhiều nhóm Do đó, trongbảng phân loại đứng trước tên enzym thường có bốn con số:

Ethanol + NAD+  acetaldehyde + NADH + H+

có tên gọi là alcohol dehydrogenase (ADH), tên quốc tế theo khóa phân loại là:Alcohol: NAD oxydoreductase (EC 1.1.1.1), trong đó:

- mã số 1 đầu tiên biểu thị tên lớp enzyme là oxydoreductase (lớp 1)

- mã số 1 thứ hai biểu thị tổ 1: tác dụng lên nhóm CH - OH của các chất cho

- mã số 1 thứ ba biểu thị nhóm 1: chất nhận là NAD hay NADP

- mã số 1 cuối cùng chỉ số thứ tự của enzyme

Sau tên của enzyme là số của nó theo danh sách các enzyme do tiểu ban vềenzyme đề ra (enzyme commission, EC)

3.2.2 Các phản ứng enzyme

3.2.2.1 Lớp enzyme oxydoreductase

Lớp enzyme này gồm 14 lớp phụ, xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử Phản ứngoxy hóa tương ứng với sự tách điện tử ra khỏi cơ chất, phản ứng khử là phản ứng thunhận điện tử và thường đi kèm với nhau

Quá trình tổng quát có thể biểu thị như sau:

Trong đó:

+ AKh là cơ chất A ở dạng khử

+ Aox là cơ chất A ở dạng oxy hóa

+ e là điện tử, Box là cơ chất B ở dạng oxy hóa

+ BKh là cơ chất B ở dạng khử

Các enzyme thuộc lớp này là những enzyme 2 thành phần có các coenzyme nhưNAD+, NADP+, FMN, FAD, hem

 Dehydrogenase: xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất và chuyển đến

NAD+, NADP+, FMN, FAD

 Oxydase: xúc tác cho quá trình chuyển điện tử đến oxy do đó hoạt hóa oxy làm

cho nó có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường

 Oxygenase: xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử của hợp chất

hữu cơ (thường là các chất có vòng thơm) Có thể phân biệt hai loại: oxygenase vàhydroxylase

+ Oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử oxy

+ Hydroxylase chỉ kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạng OH)vào hợp chất hữu cơ

 Peroxydase: các peroxydase điển hình và catalase có coenzyme là hem, xúc tác

cho phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ khi có H2O2

3.2.2.2 Lớp enzyme transferase

Lớp này gồm tám lớp phụ Các enzyme lớp này cũng là những protein phức tạp,bản chất hóa học của các coenzyme rất khác nhau, tùy theo bản chất của nhóm đượcchuyển vị như các nhóm monocarbon, nhóm alkyl, nhóm glucosyl, các nhóm cóphosphore, các nhóm chứa lưu huỳnh

Ví dụ:

Trong đó:

+ A - R là cơ chất A có mang nhóm R

+ B - R là cơ chất B có mang nhóm R

 Acyltransferase: xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm acyl thường là thông qua

coenzyme A, tạo thành phức CoAS ~ acyl

 Glucosyltransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc đường (hexose,

pentose) từ chất cho đến các chất nhận khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH củamột gốc saccharide khác hoặc các gốc phosphate, nguyên tử N của nhân vòng

 Aminotransferase: các enzyme này có coenzyme là pyridoxal phosphate xúc tác

cho phản ứng chuyển vị nhóm amin Các phản ứng quan trọng như chuyển thuậnnghịch nhóm amin của amino acid đến  - cetoacid

 Phosphotransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc phosphoryl thường có

sự tham gia của ATP với ý nghĩa như một chất cho Gốc phosphate được chuyển từATP (hoặc có thể là NTP) đến nhóm hydroxyl của alcol hoặc saccharide Các enzyme

này thường có tiếp vị ngữ “kinase” Ví dụ, hexokinase xúc tác cho phản ứng sau:

ATP + D – hexose = ADP + D – glucose – 6 - P3.2.2.3 Lớp enzyme hydrolase

Lớp enzyme này bao gồm 10 lớp phụ, xúc tác cho phản ứng thủy phân Phảnứng này làm đứt liên kết đồng hóa trị giữa hai nguyên tử của cơ chất gắn các phần tửcủa phân tử H2O vào các hóa trị được tạo nên do sự đứt liên kết kể trên Có thể đượcbiểu thị như sau:

Các phản ứng do enzyme lớp này xúc tác luôn có nước tham gia Đặc điểm khác

là các hydrolase thường không cần coenzyme cho hoạt động xúc tác của chúng

 Amylase: xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và các

polysaccharide tương tự Có 3 loại amylase khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đốivới liên kết glucoside và một số tính chất khác

+  - amylase phân giải các liên kết 1,4 - glucoside ở giữa chuỗi mạchpolysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo - amylase” tạo thành cácdextrin phân tử thấp

+  - amylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 - glucoside kể từđầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn.+ Glucoamylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết 1,4 - 1,6-glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide Sảnphẩm chủ yếu được tạo thành dưới tác dụng của enzyme này làglucose và dextrin

 Peptide hydrolase: xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide tạo thành

peptide phân tử thấp, axitamin Các peptide hydrolase khác nhau có tính đặc hiệu

khác nhau đối với liên kết peptide Một số enzyme phân giải các liên kết peptide ởgiữa chuỗi mạch polypeptide gọi là endopeptide hydrolase hay proteinase (pepsine,trypsin, chimotrypsin ); một số khác lại thủy phân các liên kết ở đầu mút của chuỗimạch, gọi là exopeptide hydrolase hay peptidase.

 Lipase: xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động

vật) tạo thành các acid béo tự do và glycerol (thủy phân lần lượt từng liên kết este)3.2.2.4 Lớp enzyme lyase

Lớp enzyme này gồm 5 lớp phụ, tác động vào các liên kết C - C, C - O, C - N,

C - S, C - Halogen Có thể biểu thị như sau:

 Pyruvat decarboxylase: xúc tác cho phản ứng loại CO2 khỏi phân tử axitpyruvic, tạo thành aldehyde tương ứng là acetaldehyde Coenzyme của nó làthiamine pyrophosphase

 Fumarathydratase: xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử H2O khỏiaxit malic, tạo thành axit fumaric (có một nối đôi)

3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase

Lớp enzyme gồm 5 lớp phụ, trong quá trình này có sự sắp xếp lại trong phân tử

cơ chất Có thể biểu thị như sau:

 UDP - glucose - 4 – epimerase: xúc tác cho sự chuyển hóa tương hỗ phức tạp

giữa galactose và glucose, tức là làm xoay nhóm OH xung quanh nguyên tử carbon ở

vị trí thứ tư của đường galactose Enzyme có coenzyme NAD+, xúc tác cho phảnứng:

3.2.2.6 Lớp enzyme ligase

Lớp enzyme này có 4 lớp phụ và chúng thường tạo nên các liên kết C - O, C - S,

C - N, C - C

Các enzyme ligase xúc tác cho việc tạo thành aminoacyl - tRNA từ amino acid

và tRNA ở giai đoạn đầu tiên trong sự sinh tổng hợp protein Ngoài ra chúng còn xúctác cho sự sinh tổng hợp amiono axit, tạo ra những dẫn chất acyl - CoA

 Pyruvatcarboxylase: xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa axit pyruvic acid tạo

thành axit oxaloacetic Enzyme này có chứa nhóm phụ là biotin, cần acetyl - CoA và

Mg++ cho phản ứng xúc tác

Chương 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME

4.1 Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme

Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn định.Trong những điều kiện bất lợi, chúng không bền, dễ bị biến tính và mất hoạt độ Do

đó, khi nghiên cứu enzyme cần chú ý tránh những điều kiện sau:

- Đa số enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính(pH = 7  2) Vì vậy các yếu tố axit mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme

- Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ

và rất thận trọng các axit hoặc kiềm nên tiến hành ở 00C

- Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân và các điều kiện vềnhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme

- Khi tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, thường từ 00Cđến 50C Đối với các enzyme không bền thì được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn (từ -

50C đến - 200C) Người ta hay sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặcnước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng cả hỗn hợp nước đá với axit sulfuricđậm đặc

- Khi cắt, thái, xay nhỏ các mẫu thực vật và động vật (lá cây, thịt, các cơ quannội tạng ) không dùng các dụng cụ dao kéo, dụng cụ xay đã han rỉ để tránh tác dụngcủa các ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe ) mà nên dùng dụng cụ inox

- Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cần tiếnhành ở nhiệt độ thấp

- Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hànhnhanh hơn, và cần thực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quãng để tránh giảmhoạt độ của enzyme

- Khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme, nếu đã xác định trongkhoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phản ứng phải được giữ ở

nhiệt độ ấy (dùng máy ổn định nhiệt) Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt độcần thiết thì mới tiến hành đo và pH cần giữ ổn định, chính xác.

- Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xác lượngdịch enzyme, thường dùng các loại micropipette

- Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi enzyme vào dung dịch nghiêncứu Ví dụ, đang làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn thì không nói chuyện nhiều

- Khi đã có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ở nhiệt độ thấp, giữ các kếttủa ở dạng huyền phù trong dung dịch ammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm rabằng cách ly tâm

- Sấy khô chế phẩm enzyme ở điều kiện chân không hoặc dùng phương phápđông khô

4.2 Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme

4.2.1 Nguồn nguyên liệu

Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật Một sốnguyên liệu thường dùng làm nguồn nguyên liệu để tách enzyme như:

4.2.1.1 Nguồn thực vật

Enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả, lá Cơ quan dự trữgiàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy

- Hạt thầu dầu (tách lipase)

- Hạt đậu tương (tách enzyme urease)

- Hạt lúa, thóc đại mạch nảy mầm (tách  - amylase)

- Củ khoai lang (tách  - amylase)

- Nhựa đu đủ xanh (tách papain)

- Các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa ( tách bromelain)

- Dịch ép thân và lá cây Ficus (tách fixin)

- Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đôngsữa trong sản xuất fomat Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật Nhưngkhác với pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắccasein Renin là chế phẩm enzyme có giá trị lớn trong công nghiệp

Nguyên liệu động vật dùng để tách enzyme phải tươi tốt lấy ngay sau khi độngvật vùa bị giết chết hoặc bảo quản ở nhiệt độ 200C

4.2.1.3 Nguồn vi sinh vật

Vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loài thuộcAspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấmmen

Trong các nguồn nguyên liệu, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất đểsản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp Dùng nguồn vi sinh vật cónhững lợi ích chính như sau:

- Có thể chủ động về nguồn nguyên liệu

- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) do đó có thể thuhoạch hàng trăm lần trong năm

- Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Vì vậychỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất

- Có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệukhác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme

- Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻtiền,

Tuy nhiên cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố, vì vậy cần cóbiện pháp xử lý thích hợp

Để sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếusau:

- Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống: người ta tiến hành phân lập từ môitrường nhiên hoặc gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý, hóa học để tạochủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme

- Lựa chọn môi trường nuôi cấy vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnhhưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật

- Nuôi cấy vi sinh vật: có hai phương pháp nuôi cấy khác nhau về nguyên tắc

+ Phương pháp nuôi cấy bề mặt: vi sinh vật phát triển và bao phủ trên

bề mặt môi trường dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm và vô trùng Chếphẩm thu được ở dạng rắn - thô

+ Phương pháp nuôi cấy bề sâu: vi sinh vật phát triển trong môi trườnglỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục, thu được canh trường lỏng -dạng thô

- Tách và tinh chế enzyme: để thu chế phẩm tinh khiết

4.2.2 Thu hồi chế phẩm enzyme

Enzyme có mặt trong mọi tế bào cơ thể sống Các enzyme có thể tiết ra ngoàimôi trường (enzyme ngoại bào) hoặc cư trú bên trong tế bào (enzyme nội bào)

 Đối với enzyme nội bào: muốn chiết rút enzyme ra khỏi tế bào cần:

- Phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp như cơ học (nghiền với bộtthủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa), dùng tác dụngcủa sóng siêu âm, của các dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethylacetate )

- Sau đó, enzyme được chiết bằng các dung môi khác nhau như nước cất, dungdịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính…

- Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein tạp và nhiều chất khác, đểloại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau

+ Để loại bỏ muối khoáng và các tạp chất có phân tử lượng thấp (cácloại đường…) thường dùng các phương pháp thẩm tích đối nước hayđối các dung dịch đệm loãng (cách làm: cho dung dịch enzyme vàotúi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophanetốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm phaloãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn).Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất cóphân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo địnhluật khuếch tán Còn lại trong màng là các chất protein có phân tửlớn) (Hình 4.1) hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex

+ Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các tạpchất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp các phươngpháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng củanhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạnbằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương phápsắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọcgel.

Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt hoặc pH của môi trườngchỉ dùng đối với trường hợp các enzyme bền với nhiệt hoặc bền với acid Dịchenzyme được giữ ở 50 - 700C hay ở pH = 5 trong một thời gian xác định sau đóprotein đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm

Hình 4.1 Thẩm tích để loại muối (NH 4 ) 2 SO 4 trong kết quả protein

 Đối với enzyme ngoại bào: để thu dịch enzyme thường tách sinh khối và các

chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm cácchất trợ lọc (diatomit, than hoạt tính…) hoặc các chất tạo kết tủa khi cần thiết(CaCl2 + (NH4)2SO4  CaSO4, chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối nêngiúp cho quá trình lọc sẽ dễ dàng hơn)

Cho đến nay vẫn chưa tìm được phương pháp tách và làm sạch chung cho cácenzyme Khi cần tách và làm sạch một enzyme nào đó cần chọn và phối hợp cácphương pháp khác nhau để xây dựng một phương pháp phù hợp nhất

Trong quá trình chiết rút, cần chú ý:

- Phải chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C)

- Các thao tác thí nghiệm phải nhanh

- Dùng chất điện ly thích hợp: (NaCl, ZnCl2, CaCl2) phụ thuộc vào phươngpháp dùng khi chiết rút Ví dụ, dùng máy nung thì cả ba chất trên đều có tác dụng,nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng.

- Ở động, thực vật, còn có ảnh hưởng của chất màu đến việc làm sạch hoặcxác định hoạt độ enzyme Vì vậy, người ta cho thêm vào chất khử để loại màu

ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) hoặcthan hoạt tính Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH Sau khiloại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme

Sau khi làm sạch cần sấy khô các chế phẩm enzyme (sấy chân không ở nhiệt độthấp hoặc sấy thăng hoa) để có thể sử dụng lâu dài Bằng các phương pháp làm sạchkhác nhau có thể thu được các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao hơn nhiều so vớichế phẩm ban đầu

Việc thu chế phẩm enzyme tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể rất khó khăn vàtốn kém do đó các chế phẩm enzyme loại này chỉ được dùng trong học và trong mụcđích nghiên cứu như xác định khối lượng phân tử enzyme, nghiên cứu về cấu trúcenzyme…

4.3 Hoạt độ enzyme

4.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp màthường xác định gián tiếp thông qua xác định mức độ hoạt động (hoạt độ) củaenzyme Trong phán ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểuhiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa họccủa hỗn hợp phản ứng Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức

độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩmđược tạo thành trong phản ứng

Về nguyên tắc, có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong mộtthời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chấthay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định

- Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được

sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

4.3.2 Đơn vị hoạt độ enzyme

- Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyểnhóa một micromol (1mol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 U = 1mol cơ chất (10-6 mol)/ phút

- Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơchất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cần phảiđánh giá độ sạch của nó Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme làhoạt độ riêng

- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc số đơn vịKatal) ứng với 1 ml dung dịch hoặc 1mg protein (nếu là bột khô) của chế phẩmenzyme Ví dụ:

+ một dung dịch enzyme chứa 10 UI (hoặc 166,7 nKat) trong 1ml

1 Kat = 1 mol cơ chất/giây

1 UI = 10-6/60 Kat = 16,67 nKat (nanoKat)

+ hoặc một bột enzyme chứa 10 UI (hoặc 166,7 nKat) trong 1mgprotein

Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ riêng phân tử

- Hoạt độ riêng phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tửenzyme trong một đơn vị thời gian Như vậy, hoạt độ riêng phân tử chính là khảnăng xúc tác của enzyme nghĩa là hoạt độ phân tử càng cao thì khả năng xúc táccàng lớn

Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số điểm sau:

- Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa

để bão hòa enzyme nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzyme

- Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho cácchất này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng

sự phát triển của vi sinh vật