CHUẨN BỊ CHẤT CHO PHÂN TÍCH

Các cấu tử cần quan tâm và chất cản trở nằm trong pha lỏng → cho chảy qua cột nhồi chất hấp lưu: cấu tử quan tâm được lưu lại, chất cản trở được thải loại ra khỏi cột → rửa giải chất cần

CHƯƠNG I:

CHUẨN BỊ CHẤT CHO PHÂN TÍCH

Để tiến hành nghiên cứu các tính chất (vật lí, hóa học, sinh học), đặc biệt là khảo sát cấu trúc phân tử cần phải có chất tinh khiết

Từ các nguồn thiên nhiên (động vật, thực vật, khoáng vật) hoặc bằng con đường tổng hợp thường người ta không có ngay những hợp chất hữu cơ tinh khiết, mà chỉ có được hỗn hợp chất.

Phân lập, tách các chất tinh khiết hoặc loại bỏ tạp chất để thu được chất tinh khiết.

VD: dung dịch muối ăn NaCl đồng nhất

- Chất tinh khiết: là chất đồng nhất, được cấu thành nên chỉ từ một loại phân tử

- Độ tinh khiết: khi chất được làm sạch đến một mức độ ý nghĩa nào đó gọi là độ tinh khiết.

- Hệ số phân bố: K=

Với CB, CA là nồng độ của chất S trong pha A và B ở TTCB.

 Là hằng số ở nhiệt độ xác định.

 Đặc trưng cho một chất tan và một cặp dung môi xác định A và B.

 Phụ thuộc: nhiệt độ, áp suất, tính chất của chất tan và

dung môi.

 K càng lớn, quá trình chiết càng hiệu quả.

a Chiết đoạn

- Cách thực hiện: Lắc mẫu với dung môi trong phễu chiết.

- Trường hợp sử dụng: Hệ số phân bố lớn, có thể bỏ qua mất mát của chất nào đó.

- Sơ đồ:

- Hệ số phân bố:

Mẫu nước Vnc, mnc Dung môi chiết Vch, mch

 Các phương trình mô tả quá trình chiết phân đoạn:

b Chiết liên tục

- Trường hợp sử dụng: Hệ số phân bố nhỏ, không thể bỏ qua sự mất mát chất (chiết phân tích).

- Quá trình chiết liên tục: Dùng dung môi chiết chiết liên tục dòng mẫu trong các thiết bị riêng.

- Sơ đồ:

1 Chiết lỏng - lỏng

- Cân bằng khối lượng trong buồng chiết, tách:

Fnc.Ccn=Fch.C*ch+Fnc.C*nc (1)

- Hằng số phân bố lỏng - lỏng:

- Cân bằng khối trong bình hứng dung môi chiết chảy ra:

- Từ (1)(2)(3), lượng chất được chiết:

 Các phương trình mô tả quá trình chiết liên tục:

- Quá trình này kéo dài cho đến khi mẫu được chuyển toàn bộ vào buồng chiết, nên khi t= thì quá trình chiết dừng.

- Độ thu hồi:

- Độ làm giàu:

E=

 Cột (polietilen hoặc thủy tinh) nhồi đất chịu lửa có lỗ rộng, trơ, làm việc được ở pH từ 1-13.

 Mẫu nước chứa chất phân tích được đưa vào cột → tự phân bố trên bề mặt chất nhồi (pha tĩnh).

 Rửa giải bằng các dung môi hữu cơ không trộn lẫn nước.

 Chất ưa dầu đi vào pha hữu cơ và tách ra khỏi cột → bốc hơi dung môi để tiến hành phân tích tiếp.

d Chiết đối dòng (chiết phân đoạn)

- Tách được các chất có hệ số phân bố bằng nhau.

- Nhược điểm: thiết bị chuyên dụng đắt tiền, không tách được hỗn hợp phức tạp.

 Ít sử dụng.

2 Chiết lỏng - rắn

- Được dùng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu rắn (thực vật, đất, ) bằng dung môi thích hợp (từ kém phân cực đến phân cực)

a Chiết đoạn (đơn hoặc lặp)

- Hiệu quả thấp hơn chiết liên tục.

- Cách tiến hành: Mẫu rắn được ngâm vào dung môi (có thể khuấy, lắc) → dịch chiết được tách ra → gạn, lọc hoặc ly tâm.

cặn đem chiết thêm một vài lần với dung môi mới.

→ các dịch chiết được gộp lại và cho bay hơi.

b Chiết liên tục

- Được thực hiện trong một thiết bị riêng (thường là bộ chiết Soxhlet)

Bếp đun

Viên bi thủy tinh

Ống B Túi vải chứa bột cây

3 Chiết pha rắn

a Cơ sở lý thuyết

Chiết pha rắn là quá trình chiết gồm một pha rắn và một pha lỏng.

Các cấu tử cần quan tâm và chất cản trở nằm trong pha lỏng → cho chảy qua cột nhồi chất hấp lưu: cấu tử quan tâm được lưu lại, chất cản trở được thải loại ra khỏi cột → rửa giải chất cần quan tâm bằng dung môi thích hợp, hoặc ngược lại.

Nguyên tắc: tương tự sắc ký lỏng.

b Chất hấp lưu

- Thường là silicagel biến tính, silicagel không biến tính, nhôm oxit, các polime, và được chia thành:

 Pha tĩnh ngược (octadexyl, octyl, butyl, phenyl, ): không phân cực, giữ lại các chất phân tích không phân

cực → chiết các chất không phân cực và phân cực vừa từ các mẫu nước.

 Pha tĩnh thường (amino, diol, ): phân cực, giữ các chất phân cực → chiết các chât phân cực vừa và phân cực từ các mẫu không nước.

 Chất hấp phụ (cũng thuộc loại pha tĩnh thường ví dụ như than, polime): chiết các chất phân tích phân cực

từ các mẫu không phân cực.

 Nhựa trao đổi ion (amin bậc 4, amin, axit cacboxylic, ): tách các chất phân tích ion từ các mẫu phân cực

và không phân cực)

3 Chiết pha rắn

c Dung môi rửa giải

- Nguyên tắc: dung môi rửa giải phải làm yếu đi liên kết giữa chất phân tích và chất hấp lưu; sự phân bố của chất

phân tích trong khắp dung môi rửa giải được xảy ra.

 Đối với sắc ký pha ngược:

- Dãy dung môi rửa giải có độ phân cực giảm dần.

- Dung môi hoạt hóa cột: metanol hoặc axetonitrin, sau đó là nước hoặc nước có đệm hoặc dung dịch hữu cơ có cùng pH với mẫu.

- Dung môi rửa chất cản trở: sử dụng dung dịch hoạt hóa cột sau cùng.

- Dung môi pha mẫu: cần tạo cho môi trường mẫu càng phân cực càng tốt.

 Đối với sắc ký pha thường:

- Dãy dung môi rửa giải: có độ phân cực tăng dần.

- Dung môi hoạt hóa cột: dung môi không phân cực, thường là dung môi của mẫu.

- Dung môi rửa chất cản trở: sử dụng dung dịch hoạt hóa cột sau cùng hoặc dung dịch hoạt hóa cột có chứa 5-25% dung môi phân cực hơn.

- Dung môi pha mẫu: cần tạo cho môi trường mẫu càng không phân cực càng tốt.

3 Chiết pha rắn

 Đối với sắc ký trao đổi ion:

- Dãy dung môi rửa giải: lựa chọn dựa vào sự biến đổi pH hoặc lực ion của đệm: rửa giải các chất phân tích đầu bằng đệm mạnh hơn đệm rửa các chất cản trở, rửa giải các chất phân tích khác bằng các đệm mạnh hơn liên tiếp + Anion hoặc cation: sử dụng các axit loãng (HCl, CH3COOH, H3PO4) hoặc các bazơ loãng (NH4OH, NaOH); dùng riêng hoặc với dung dịch đệm, hỗn hợp các dung môi trộn lẫn với nước.

+ Hợp chất axit, muối anion: điều chỉnh pH thấp hơn 1-2 đơn vị so với pH của chất phân tích.

+ Hợp chất bazơ, muối cation: điều chỉnh pH cao hơn 1-2 đơn vị so với pH của chất phân tích.

+ Cacbohidrat: sử dụng nước để rửa giải.

 Đối với sắc ký trao đổi ion:

- Dung môi hoạt hóa cột: nước không ion hoặc đệm yếu:

+ Các anion hoặc cation: dùng dung dịch có cùng pH, lực ion và lượng dung môi hữu cơ khi điều chỉnh mẫu phân tích.

2 Các phương pháp làm sạch chất phân tích:

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Nguyên tắc:

Trong số các phương pháp tách và làm sạch chất, phương pháp hiện nay có thể coi là hiệu lực hơn cả

Nó cho phép tách được những hỗn hợp phức tạp gồm hàng chục, thậm chí hàng trăm cấu tử

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

- Dựa vào cách lưu giữ pha tĩnh:

+ Sắc kí cột: Pha tĩnh được lưu giữ trong ống nhỏ, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng

lực

+ Sắc kí lớp mỏng: Pha tĩnh được cố định trên một mặt phẳng (giấy, bản mỏng), pha động di chuyển

qua mặt đó nhờ mao dẫn hoặc tác động của trọng lực

2 Các phương pháp làm sạch chất phân tích:

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Nguyên tắc:

Ví dụ 1: Tách carotene trong mẫu rau quả bằng sắc kí bản mỏng:

Lấy 10g mẫu đã nghiền nhỏ vào bình chiết, thêm 25g Na2SO4 khan, 40mL THF, lắc chiết 10 phút, lọc lấy dung dich THF, cất quay chân không còn bã, hòa tan bã này trong 5mL n-Hexan Lấy dung dịch mẫu này chạy sắc kí lớp mỏng trên bản silica

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Nguyên tắc:

- Dựa vào cơ chế tách:

+ Sắc ký hấp phụ: pha tĩnh thường là chất rắn có khả năng hấp phụ (lực tĩnh điện), pha động có thể là

chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn) hoặc khí (sắc kí khí – rắn) Sự tách ở đây phụ thuộc vào sự hấp phụ chọn lọc của các cấu tử của hỗn hợp trên bề mặt chất rắn

+ Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là màng mỏng chất lỏng được gắn trên bề mặt của chất mang rắn trơ, chất

lỏng này không tan được với pha động, pha động có thể là chất lỏng (sắc kí phân bó lỏng – lỏng) hoặc chất khí (sắc kí phân bố khí lỏng) Sự tách ở đây phụ thuộc chủ yếu vào sự phân bố của chất giữa hai pha

2 Các phương pháp làm sạch chất phân tích:

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Nguyên tắc:

- Dựa vào cơ chế tách:

+ Sắc ký trao đổi ion: pha tĩnh là nhựa trao đổi ion (đó là các chất hữu cơ cao phân tử có chứa những

nhóm chức chứa các ion có khả năng trao đổi với các ion của hỗn hợp mẫu) Chất có khả năng trao đổi anion cation gọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Lực tĩnh điện giữ vai trò chủ yếu trong quá trình tách (phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích )

Ví dụ2: phản ứng trao đổi ion giữa cationit axit mạnh và Ca2+ có thể viết như sau: 2R-SO3H + Ca2+

= (R-SO3)Ca + 2H+

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Nguyên tắc:

- Dựa vào cơ chế tách:

+ Sắc ký loại cỡ (hay sắc ký rây phân tử): pha tĩnh là chất rắn có độ xốp tuỳ thuộc vào kích thước

phân tử cần tách Trong kĩ thuật này, sự tách đạt được qua sự khuếch tán khác nhau đi vào trong lòng chất rắn (những đường đi trong lòng chất rắn này còn gọi là mao quản có kích thước cở phân tử) Các chất phân tích có kích thước lớn không thể đi vào sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh và được loại trừ hoàn toàn còn các phân tử chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị rửa giải chậm

Với mục đích tách và làm sạch (sắc kí điều chế), các phương pháp sắc kí cột có ý nghĩa hơn cả

2 Các phương pháp làm sạch chất phân tích:

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Nguyên tắc:

Ví dụ 3: Tách các alcaloit từ củ bình vôi bằng sắc kí hấp phụ: Lấy 10g mẫu đã nghiền mịn vào

bình nón, thêm 20-25 g Na2SO4 khan, thêm 40mL n-Hexan (hay acetonitril…), lắc mạnh 10 phút, để lắng, lọc lấy dung dịch Sau đó lấy cả dung dịch hay chỉ một thể tích nhỏ nhất định dội vào cột sắc kí hấp phụ có pha tĩnh là oxit nhôm, để chất phân tích được pha tĩnh hấp phụ và giữ lại trên pha tĩnh Sau đó, dùng dung dịch n-Hexan (pha động) hay hỗn hợp (n-hexan + Cl2CH2 với tỉ lệ 1:1), để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc kí Như vậy, chất phân tích sẽ tan vào pha động rửa giải, và tiến hành xác định các alcaloit này trong pha động rửa giải

2.2 Phương pháp sắc kí:

b) Cách tiến hành:

- Đưa hỗn hợp nạp vào pha tĩnh: các chất tan sẽ được giữ trên pha tĩnh Tuy nhiên pha tĩnh có ái lực

liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau

- Cho pha động chạy qua pha tĩnh: dung môi pha động sẽ kéo các cấu tử di chuyển đi xuống với tốc

độ khác nhau và tạo thành sắc ký đồ Giai đoạn này được gọi là khai triển sắc ký.

Có ba phương pháp:

+ phương pháp tiền lưu

+ phương pháp rửa giải

+ phương pháp rửa đẩy

2 Các phương pháp làm sạch chất phân tích:

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Cách tiến hành:

+ phương pháp tiền lưu:

Hình 3: Sắc đồ phương pháp tiền lưu

C B

Nồng độ

A

B A

Phương pháp tiền lưu ít dùng

do không thực hiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, đặc biệt

là khi sử dụng vào mục đích phân tích

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Cách tiến hành:

+ phương pháp rửa giải:

Phương pháp rửa giải thường được dùng hơn cả do hiệu quả tách cao

Detector

Hình4: Tách sắc ký và sắc ký đồ phương pháp rửa giải

B

C

Hình 5: Sắc đồ phương pháp thế đẩy (phần đậm là phần hai cấu tử xen kẽ)

D

t, V Nồng độ

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Cách tiến hành:

- Phát hiện các chất: Trong các thiết bị sắc ký hoàn chỉnh, dung dịch rửa giải khỏi cột sắc ký cho đị

qua bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột sắc ký

Nếu chất tách là có màu thí có thể phát hiện qua màu đặc trưng

Nếu chất tách không có màu thì thường được xác định bằng một trong số các phương pháp sau:

*Có thể sử dụng phương pháp đo phổ tử ngoại, đo độ hoạt động quang học,… và dung các thuốc thử tạo màu để phát hiện các phân đoạn rửa giải

* Mỗi phân đoạn riêng biệt thu được có thể kiểm tra trực tiếp bằng sắc kí lớp mỏng (sử dụng một trong

số những thuốc thử không chọn lọc như hơi iot)

2.2 Phương pháp sắc kí:

a) Cách tiến hành:

Đối với phương pháp sắc kí khí điều chế, sắc kí cột lỏng - lỏng và sắc kí cột phân bố lỏng

- lỏng, người ta đặt giữa đầu ra của cột và detecto một thiết bị chia dòng, thiết bị này chia một phần lớn dòng rửa giải cho đi vào bẫy lạnh, ở đây các cấu tử riêng biệt ngưng tụ lại Trường hợp sử dụng các cột thông thường thì ta thu được các phân đoạn của các cấu tử riêng biệt vào các bình hứng khác nhau và cô đuổi dung môi để thu hồi chất tinh khiết

PHƯƠNG PHÁP KẾT TINH:

* Việc làm sạch các chất rắn bằng kết tinh là dựa vào sự khác nhau về tính tan của chất quan tâm và của tạp chất trong một dung môi hoặc một hệ dung môi chọn.

* Ta có thể gặp hai trường hợp sau:

1 Chất quan tâm tan tốt trong dung môi ở nhiệt độ cao, tan ít ở nhiệt độ thường, còn tạp chất thì ngược lại.

 Trường hợp này ta sử dụng kết tinh nóng để làm sạch chất

 Lưu ý : Dung môi chọn sao cho có thể tạo được dung dịch bão hòa chất kết tinh ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của

dung môi (khoảng 100C ) để thuận tiện cho việc lọc nóng khi cần thiết.

2 Chất quan tâm tan tốt trong dung môi ở nhiệt độ thường, tan ít ở nhiệt độ nóng, còn tạp chất thì ngược lại.

 Trường hợp này ta sử dụng kết tinh lạnh ở nhiệt độ rất thấp

(từ -100C đến -400C) để làm sạch chất rắn Kết tinh lạnh có thể tinh chế các chất lỏng.

 Trường hợp này ta cũng có thể kết tinh nóng để làm sạch chất bằng cách thêm dung môi thứ hai tan được trong dung môi đầu, nhưng hầu như không hòa tan chất kết tinh ở nhiệt độ thường, theo một tỉ lệ thích hợp (đến vẩn đục) để chuyển hệ về tương tự như trường hợp đầu.

Việc sử dụng hỗn hợp dung môi trên cũng được áp dụng để làm sạch những chất kém bền nhiệt

PHƯƠNG PHÁP KẾT TINH:

Trong phương pháp làm sạch chất bằng phương pháp kết tinh, ngoài việc lựa chọn hệ dung môi thích hợp, những tạp chất thường có mặt với những lượng nhỏ có thể đuổi khỏi dung dịch kết tinh bằng việc xử lí với các chất hâp thụ như than hoạt tính, đất chịu lửa, silicagen

 Kết tinh càng nhanh tinh thể càng bé, càng khó lọc và hấp phụ nhiều chất bẩn; kết tinh càng chậm tinh thể càng

to càng dễ lọc và sạch

Trong một số trường hợp đặc biệt, chẳng hạn chất bị phân hủy hoặc bị biến đổi cấu trúc khi tiếp xúc với không khí, việc kết tinh chúng được tiến hành trong bầu khí quyển khí trơ (nitơ, heli, ).

 Để thu được chất tinh khiết, quá trình tinh khiết thường lặp đi lặp lại nhiều lần, tốt nhất trong các dung môi khác nhau.

Phương pháp làm sạch chất bằng phương pháp kết tinh không được áp dụng nếu chất quan tâm tạo được tinh thể trộn lẫn với các tạp chất

I PHƯƠNG PHÁP THĂNG HOA

a Định nghĩa

Thăng hoa là một quá trình biến đổi pha của một chất từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà

không qua trạng thái lỏng

b Cơ sở lý thuyết

Một số chất như: naphtalen,menton…có khả năng thăng

hoa, vì vậy người ta có thể dùng phương pháp thăng hoa ở áp suất thường hoặc áp suất thấp để tinh

chế chúng

nằm lại ở đáy bình

Phương pháp thăng hoa có ưu điểm hơn các phương pháp khác là thu được chất tinh khiết hơn và có thể dùng một lượng nhỏ chất Ngược lại, phương pháp này cũng có nhược điểm là các chất bẩn phải có tính bay hơi khác nhiều so với chất tinh chế, quá trình thăng hoa thường chậm và hao phí nhiều chất hơn các phương pháp khác

Tốc độ thăng hoa tỉ lệ thuận với áp suất hơi của chất ở nhiệt độ xác định, tỉ lệ với độ lớn bề mặt chất bay hơi và tỉ lệ nghịch với áp suất trong bình