chuong 2 nguyen lý STH

Theo nghĩa kỷ nghệ nghiã rộng: Lên men công nghệ là quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm sinh học trong tế bào VSV từ các chất dinh dưỡng của môi trường trong điều kiện hiếu khí.. Bản

Chương 2

CÁC NGUYÊN LÝ VỀ HOẠT

ĐỘNG LÊN MEN VÀ SINH TỔNG

HỢP CỦA VSV

I Định nghĩa về lên men

II Phân loại sản phẩm của CNLM.

III Đặc điểm trao đổi chất - sinh tổng hợp ở VSV.

VI Nguyên lý về khả năng tự điều hoà STH ở VSV.

V Nguyên tắc tạo nên sự tổng hợp thừa ở VSV

I Định nghĩa về lên men (fermentation)

Từ fermentation bắt nguồn từ tiếng Hy lạp là từ Fervea có nghiã là sự sủi bọt của dịch

nước trái cây

“Lên men” được bao gồm 2 nghĩa khác nhau :

a Theo nghĩa sinh hóa ( nghiã hẹp): lên men

truyền thống là quá trình phân giải chât

dinh dưỡng ( hydratcarbon) thành năng lượng, mà trong đó Hydro được tách ra từ cơ chất

(thường là glucid) và được chuyển đến chất nhận điện tử cuối cùng là chất hữu cơ trung gian

Đây là quá trình lên men kị khí, sự có mặt

oxy sẽ ức chế quá trình lên men Thuộc loại này ta có các kiểu lên men như: lên men

rượu, lên men lactic, lên men butyric …

Quá trình này được áp dụng để chế biến

các loại thực phẩm lên men truyền thống như làm rượu vang, bia, lên men chua rau quả, sưa chua.

b Theo nghĩa kỷ nghệ (nghiã rộng):

Lên men công nghệ là quá trình sinh

tổng hợp các sản phẩm sinh học trong tế bào VSV từ các chất dinh dưỡng của môi trường trong điều kiện hiếu khí Bản chất của quá trình này là hoạt động hô hấp

hiếu khí của VSV để tạo năng lượng dùng cho các hoạt động sinh tổng hợp các chất hữu cơ Sự hiện diện của oxy là rất cần thiết

Thuộc loại này ta có lên men tạo: sinh

khối (biomass), các sản phẩm trao đổi

chất thứ cấp và sơ cấp của tế bào vi

sinh vật.( a.amin, nucleotide, kháng sinh,

enzime, hormone……)

Như vậy , đối với công nghệ lên men chúng ta nên hiểu có thể bao gồm cả 2 quá

Cơ chất tế bào

Cơ chất Sản

phẩm + tế bào

II Phân loại sản phẩm của công

nghệ lên men

b/Các sản phẩm trao

* Sản phẩm cuối của trao đổi năng lượng : ethanol,

acid lactic, acid butyric, acid propionic

* Các enzim nội bào và ngoại bào: amilase, proteiase,

invertase

a/Sinh khối vi sinh vật (biomass) : Protein đơn bào, bánh men, giống khởi động…

c/ Các sản phẩm của sự chuyển hóa chất (transformation):

VSV Tiền sản phẩm Sản phẩm

EX: *Chuyển hoá a acetic từ rượu ethanol bởi VK

Acetobacter aceti.

Ethanol Acid acetic

*Chuyển hoá đường L-sorbose (tiền chất để tạo vitamin C, tức acid ascorbic) từ D- sorbit (sorbit được thu nhận từ tổng hợp hoá học).D- sorbit A suborxydans L-sorbose

Acetobacter aceti

* Các chất steroid, antibiotic….

d/Recombinant protein (protein tái tổ hợp):

Đây là sản phẩm của công nghệ di

truyền và Công nghệ vi sinh , các chủng

VSV được lấp những đoạn gen tái tổ hợp ở người và động vật, nhờ thế chúng có

khả năng sinh tổng hợp những sản phẩm sinh học có nguồn gốc của người và động vật được dùng trong điều trị bệnh EX:

- Insulin tri bệnh tiểu đường được tổng

hợp bởi E.coli được tái tổ hợp gen.

- Interferon một loại kháng thể có thể

dùng điều trị bệnh viêm gan do siêu vi,

bệnh ung thư….

-Kháng thể đơn dòng

- Vaccin tái tổ hợp

Khả năng trao đổi chất ở tế bào VSV

hoàn toàn khác với TĐC của cơ thể đa bào: 1.Cơ thể đa bào chiụ ảnh hưỡng trực tiếp và gián tiếp của môi trường ngoài, còn tế

bào VSV chịu ảnh hưỡng trực tiếp với môi trường sống.Do đo sư thay đổi môi trường

sống có thể gây biến dị ở VSV, tạo khả

năng thích nghi lớn ở VSV

2.Cơ thể đa bào, các chức năng của quá

trình sống do các mô chuyên hoá của cơ

thể (mô máu , mô gan , mô thận…) thực

hiện với sự điều khiển của hệ thần kinh , hệ dịch và hệ enzim Còn cơ thể đơn bào

như VSV , tế bào thực hiện tất cả các chức năng của quá trình sống Điều hoà chức năng nầy chỉ do hệ enzim bên trong tế

bào điều khiển.

III Các đặc điểm về trao đổi chất và sinh tổng hợp ở VSV

3.Cơ thể đa bào quá trình đồng hoá

và dị hoá chỉ xảy ra bên trong cơ

thể Còn ở VSV thì quá trình đồng

hoá xảy ra bên trong tê bào ,

nhưng quá trình dị hoá xảy ra bên

trong và cả bên ngoài tế bào

Đây là một trong những nguyên

nhân giúp VSV có khả năng

chuyễn hoá vật chất trong tự

nhiên rất lớn

III Các đặc điểm về trao đổi chất và sinh tổng hợp ở VSV

4.Quá trình đồng hoá giúp VSV tổng hợp các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động

sống, quá trình nầy tiêu tốn năng lượng Các chất hữu cơ nầy có thể được dùng

làm vật liệu xây dựng tế bào, tăng sinh khối (SP TĐC bậc 1), hay được phóng thích ra môi trường bên ngoài ( SP TĐC bậc 2)

Tuy nhiên quá trình STH ở VSV luôn luôn

được điều hoà bởi cơ chế kiềm chế và

cảm ứng các enzim xúc tác các phản ứng trong tế bào , giúp tế bào VSV tránh

trường hợp tổng hợp dư thừa các chất hữu

cơ Điều này là một trở ngại lớn trong

CNLM, khi dùng chủng VSV hoang dại để sản xuất các chất hữu cơ có giá trị.

@Trong CNLM thường phải dùng các chủng VSV được đột biến, mất khả năng tự điều hòa sinh tổng hợp

III Các đặc điểm về trao đổi chất và sinh tổng hợp ở VSV

5.Quá trình dị hoá bên trong tế bào giúp VSV phân giải các chất hữu cơ để cung cấp

năng lượng cho hoạt động sống và tạo sản phẩm trung gian, tiền chất để tế bào sinh tổng hợp các chất hữu cơ cần thiết khác.

• Lưu ý : Các SP TĐC này có thể được thải ra

môi trường bên ngoài làm thay đổi pH của môi trường làm môi trường trở nên độc

hại đối với VSV

@Trong quá trình lên men công nghệ

chúng ta cũng nên kiểm soát sự thay đổi

pH của môi trường nuôi cấy bằng các hệ thống điều chỉnh pH tự động

III Các đặc điểm về trao đổi chất và

sinh tổng hợp ở VSV

6.Quá trình dị hoá bên ngoài tế bào giúp VSV

phân giải các chất hữu cơ có trọng lượng phân tử lớn thành những chất có trọng lượng phân tử nhỏ để có thể thâm nhập qua màng tế bào nhờ enzim ngoại bào

Quá trình này chỉ cung cấp nguyên liệu, còn

năng lượng của phản ứng thuỷ phân không

được tế bào sử dụng mà chỉ làm phát sinh

nhiệt lượng, làm môi trường nóng lên

@Trong công nghệ lên men , chúng ta lưu ý hiện tượng pháp sinh nhiệt trong các nồi lên men do

quá trình dị hoá này , có thể gây ảnh hưỡng

không tốt đến năng suất , vì vậy phải có hệ

thống kiểm tra và điều chỉnh sự thay đổi nhiệt độ.

III Các đặc điểm về trao đổi chất và

sinh tổng hợp ở VSV

VI Nguyên lý về khả năng tự điều

hoà TĐC ở VSV

Trong môi trường tự nhiên, các

chủng VSV hoang dại luôn luôn chiụ

sự canh tranh thức ăn và sự thay đổi thường xuyên của điều kiện ngoại

cảnh Để tồn tại, VSV có cơ chế tự

điều hoà , điều chỉnh hoạt đồng trao đổi chất để giúp chúng có thể thích nghi và tiết kiệm tối đa nguồn năng lương và vật liệu trong tế bào Vì

vậy , ở VSV hoang dại, không có sự

tổng hợp dư thừa một chất hửu cơ

nào, chúng có khả năng tự điều

hoà các hoạt động TĐC

Có 3 cơ chế điều hoà TĐC:

1.Điều hoà hoạt tính của

enzim nhờ sự ức chế của

sản phẩm cuối :

Sản phẩm cuối tao ra

nhiều sẽ ức chế hoạt tính

xúc tác của enzim làm

thay đổi cấu hình ngăn

không cho cơ chất gắn vào

trung tâm hoạt động của

enzim

A a B b C C X

Enzim a là enzim dị lập thể, cĩ đặc điểm

thay đổi cấu hình khơng gian khi cĩ mặt

sản phẩm cuối X Khi sản phẩm cuối xuất

hiện ở mưc dư thừa thì sản phẩm này sẽ

gắn vào TTdị lập thể của enzim a làm cho

enzim a khơng thể hoạt động xúc tác được

Phản ứng tổng hợp cơ chất X sẽ dừng lại

2.Điều hoà cơ chế kiềm chế sự tổng hợp enzim :

Sản phẩm cuối tạo ra nhiều sẽ ức chế gen chiụ trách nhiệm tổng hợp

enzim

Trong quá trình tổng hợp ra enzim tham gia tạo sản phẩm là do gen phiên mã

ra ARNtt chiụ trach nhiệm tổng hợp

enzim tại ribosome Nếu sản phẩm

cuối nhiều sẽ phong bế việc phiên

mã ARNtt, quá trình tổng hợp enzim bị ngừng lại Nếu SP cuối ít, sẽ phục

hồi sự phiên mã ARNtt Quá trình

tổng hợp enzim được thực hiện

Triptophan tạo ra nhiều sẽ ức chế gen chiụ trách nhiệm sản xuất enzim tổng hợp triptophan

3.Điều hoà tổng hợp enzim cảm

ứng bằng sự hiện diện của cơ chất cảm ứng:

Chất mà enzim tham gia phân giải là cơ chất cảm ứng

Nếu môi trường có hiện diện

cơ chất cảm ứng hàm lượng cao thì enzim cãm ứng sẽ được tổng hợp , ngược lại nếu cơ chất cảm ứng không còn trong môi trường thì sự tổng hợp enzim cảm ứng

sẽ dừng lại.

Sự cảm ứng và ức chê quá trình

sinh tổng hợp enzim

• Khi trong môi trường nuôi cấy VSV có một chất khó đồng hoá , VSV phải tiết vào môi trường một hoặc vài enzim tương ứng để phân hủy cơ chất đó thành những chất có thể đồng hoá được Enzime được hình thành này gọi là enzim cảm ứng

• Sự cảm ứng và ức chế quá trình tổng hợp enzime ở VSV

được F Jacob và J Monod giải thích dựa trên cơ sở của học thuyết Operon Học thuyết Operon làm sáng tỏ cơ chế

điều hoà của gen đối với quá trình sinh tổng hợp protein- enzime Theo Jacob và Monod , phân tử ADN cuả nhiễm sắc thể được phân hóa về mặt mặt chức năng hình thành một số gen như sau:

• 1 Nhóm gen cấu trúc : nhóm gen này đảm nhận việc

mã hoá cấu trúc của các phân tử protein –enzime Các gen này thường xếp liền nhau.Ví dụ gen cấu trúc gồm 3 gen A-B-C Cả 3 gen cấu trúc tạo thành một đơn vị phiên mã.

• 2 Gen điều khiển ( operator) : là đoạn DNA nằm kề

bên nhóm gen cấu trúc, kí hiệu là O Nhờ tác dụng gắn với chất ức chế, Operator làm việc như một công tắc

phụ trách việc đóng mở hoạt động của nhóm gen cấu trúc.

• 3 Gen khởi động ( Promoteor - kí hiệu là P): là đoạn DNA nằm kề phía trước Operator, là nơi gắn với

enzime polimerase Enzime polimerase xúc tác cho quá trình tổng hợp RNA thông tin ( mRNA) của nhóm gen cấu trúc Khi chất ức chế gắn vào Operator thì

phân tử RNApolimerase bị cản trở, không di chuyển dọc theo mạch khuôn ADN, dẫn đến các gen cấu

trúc bị kiềm chế và không tạo được protein cũng như enzime tương ứng Do vị trí và chức năng như vậy nên người ta gọi là gen Promotor ( gen khởi động

nhiệm mã hóa việc tổng hợp nên một protein đặc biệt đóng vai trò chất ức chế, Thường nó chỉ

được tổng hợp với một lượng không đáng kể trong tế bào ( khoảng 10-20 phân ửt / tế bào) Đặc

điểm của chất ức chế là một prtein biến cấu

oligomer, có 2 tâm đặc thù, 2 tâm này làm cho

chất ức có khả năng gắn được với chất chất

cảm ứng hoặc gắn với Operator.Chất ức chế có ái lực lớn đối với Operator, thông thường nó hay

gắn vào Operator.

• Nhóm gen cấu trúc , gen Operator và gen Promotor

được tổ hợp thành một đơn vị gọi là OPERON Mỗi OPERON tương ứng với một gen điều hoà , chiụ sự kiểm soát nghiêm ngặt của gen này.

• R = Regulatory gene that encodes for the trp Repressor

protein that is concerned with regulating the synthesis of the 5 gene products An active repressor binds to a

specific nucleotide sequence in the operator region and thereby blocks binding of RNAp to the promoter to

initiate transcription O = Operator specific nucleotide

sequence on DNA to which an active Repressor binds

• P = Promoter specific nucleotide sequence on DNA to

which RNA polymerase binds to initiate transcription If the repressor protein binds to the operator, RNAp is

prevented from binding with the promoter and initiating transcription Therefore, none of the enzymes concerned with tryptophan biosynthesis are synthesized

• A = Attenuator DNA sequence which lies between the

operator and the structural genes for trp biosynthesis

The attenuator is a barrier that RNA polymerase must

traverse if it is to transcribe the genes for tryptophan

biosynthesis In the presence of trp, most RNAp

molecules fall off the DNA before transcribing the trp

genes In the absence of trp, RNAp is able to traverse the attenuator region to successfully transcribe the trp

genes

• Trp A, B, C, D, E = Trp Genes structural genes for enzymes

involved in tryptophan biosynthesis

• Trp = tryptophan end product of the tryptophan

biosynthetic pathway When combined with the repressor

• Khi trong môi trường xuất hiện chất cảm ứng Chất này có ái lực

với chất ức chế, nó tác dụng với chất ưc chế làm chất ức chế bị bất họat Cụ thể: khi chất cảm ứng gắn với chất ức chế, nó làm thay đổi cấu hình không gian của chất ức chế, do đó làm giảm ái lực của tâm gắn chất ức chế với Operator Từ đó giúp Operator tự giải hoát khỏi chất ức chế Lúc này, Operator sẽ được giải phóng , liên đới gen promotor cũng được giải phóng Phân tử RNA polimerase không bị cản trở và nó được di chuyển dọc theo mạch DNA Quá trình tổng hợp RNA thông tin sẽ được bắt đầu Các gen cấu trúc sẽ làm việc để tiến tới tổng hợp protein Enzime sẽ được hình thành Chính enzime được tạo thành này sẽ có trách nhiệm phân hủy cơ chất khó đồng hoá ( chất cảm ứng ) nói trên Đó chính là enzime cảm ứng

• Người ta có hể khái quát hóa những điều kiện tổng hợp enzime

cảm ứng như sau:

• Trên nhiễm sắc thể của tế bào phải có những gen tương ứng với

các enzime sẽ được hình thành

• Các nguyên liệu xây dựng phân tử enzime: các acid amin và các hợp

phần của nhóm ngoại ( nếu enzime cần có nhóm này trong phân tử).

• Năng lượng cần thiết cho việc hình thành các liên kết.

• Chất cảm ứng

• Theo sơ đồ của Jacob và Monod, dù có ba điều kiện trên mà không

có chất cảm ứng thì enzime cảm ứng cũng không được tạo thành Như vậy, để hình thành một enzime cảm ứng phải hội đủ bốn điều kiện : gen- nguyên liệu xây dựng –năng lượng và chất cảm ứng

V Nguyên tắc tạo ra sự tổng hợp thừa ở VSV

Có 2 nguyên tắc:

1 Gây đột biến gen làm thay đổûi cấu

trúc lập thể của trung tâm kiềm chế của enzim , khiến sản phẩm cuối không thể kết hợp được với enzim để gây ức chế hoạt tính enzim.

2 Làm thay đổi tính thấm của màng tế bào chất, khiến màng cho phép sản

phẩm cuối (chất kiềm hãm) được thoát môi trường ra ngoài Do đó không gây sự ức tổng hợp sản phẩm

Tóm lại : muốn phá vở cơ chế điều hoà TĐC để có sự tổng hợp thừa , có 2 cách :

1 Tác động làm thay đổi cấu trúc

lập thể của trung tâm dị lập thể để chúng không còn khả năng kết hợp với chất ưc chế (SP cuối).

2 Tác động vào chất ức chế (SP

cuối) để chúng không có khả

năng tương tác với trung tâm dị lập thể.( bằng cách cho SP cuối thấm ra màng tế bào ra môi trường ngoài)