Thực phẩm biến đổi gen cây trồng chịu hạn

Thực phẩm biến đổi gen cây trồng chịu hạn

CHÀO THẦY VÀ CÁC BẠN ĐẾN VỚI BUỔI THUYẾT TRÌNH

CỦA NHÓM 3

Đề Tài:

Thực Phẩm Biến Đổi Gene

Cây Trồng Chịu Hạn

GVHD: Hoàng Anh HoàngNhóm 3

•

Đôi tư ơng ng hiê

n c ưu

2

•

Cơ chê

biê

u h iê

3

•

Phư ơng

ph

ap ngh iên cư u

4

•

Kêt qu a

5

•

Kêt lu âên

Nội dung chính

1 Đối tượng nghiên cứu

Basmati là giống lúa dạng hạt dài được trồng phổ biến ở Ấn Độ

Giống lúa này là có mùi thơm, hương vị đặc trưng và có chất lượng tốt

Giống lúa Pusa Basmati – 1 sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện khí hậu ở Việt Nam, có tiềm năng về năng suất và chất lượng

Các chủng vi khuẩn và các vector

Chuyển gene OsNAC6 nhờ tế bào khả biến của vi khuẩn A

Tumefaciens

Vector chuyển gene pBCKH

Vector nhân dòng pSK II, pUC19-Ubi

Vi khuẩn nhân dòng E.Coli DH5

Hóa chất

Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gene bao gồm:

MS, LB, YEM.

Thiết bi

Tủ cấy vô trùng.Tủ sinh trưởng.Máy PCR

Máy giải trình tự.Máy quang phổ kế.Máy đo pH

Máy ly tâm

Bể ổn nhiệt

Các thiết bị khác

2 Cơ chế biểu hiện

Thay đổi về hình thái, sinh lí, sinh hoá và phân tử

Về hình thái, sinh lí: đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô.Mức độ phân tử: gia tăng mức độ biểu hiện và tích luỹ của các gene/protein chống chịu stress

2 Cơ chế biểu hiện

Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật được chia làm 2 loại:

Nhóm protein chức năng trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol )

Nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gene chức năng liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase )

2 Cơ chế biểu hiện

• * Nhân tố phiên mã OsNAC6

Họ NAC chứa trình tự đồng nhất (được phát hiện từ petunia NAM và từ Arabidopsis ATAF1, ATAF2 và CUC)

- Có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi

- Phản ứng với điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công

- Tăng cường tính chịu hạn

2 Cơ chế biểu hiện

• * Nhân tố phiên mã OsNAC6

Không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn

Sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gene chức năng khác

Bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gene của các gene chức năng => hoạt hóa sự biểu hiện của các gene này => tăng cường tính chịu hạn

2 Cơ chế biểu hiện

• * Nhân tố phiên mã OsNAC6

Các nhân tố phiên mã Nhận, truyền tín hiệu

Thực vật tăng cường tính chịu hạn

Các gene điều khiển biểu hiện

Điều kiện hạn hán

Các gene chức năng biểu hiện

Các gene chức năng

Nuôi trong LB

Xử lý CaCl2

Sốc nhiệt

Sàng lọc bẳng PCR

Sản phẩm PCR gene OsNAC6 lần 1

Sản phẩm PCR gene OsNAC6 lần 2

Các dòng E.Coli chứa plasmid

1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene

OsNAC6

Trải đĩa LB.amp.X-gal Cắt RE + Tinh sạch

SƠ ĐỒ THỰC HIỆN

SƠ ĐỒ THỰC HIỆN

1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene OsNAC6

Thiết kế vector chuyển gene mang OsNAC6

NHÂN GENE OsNAC6 TỪ THƯ VIỆN BẰNG KỸ THUẬT PCR

: 34.5 μl : 5 μl : 2 μl : 2 μl : 5 μl : 0,5 μl : 1 μl

Chu trình Nhiệt độ

( oC )

Thời gian ( phút )

Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng

cột GeneluteTM Minus Etbr (Sigma Cat # G-2166)

• Băng DNA sau khi điện di xác định đúng kích thước sẽ được cắt và chạy qua kim tiêm 1ml để làm nhỏ trước khi chuyển qua cột

• Ly tâm cột chứa agarose và DNA ở 12.000 rpm, 10 phút

• Sản phẩm thu được chính là DNA đã được tinh sạch có thể sử dụng cho các phản ứng tiếp theo

1 2 M 4 5

926 bp

900 - 1000 bp

KẾT QUẢ

Hình : Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gene OsNAC6 từ thư viện

M- Thang ADN chuẩn 1kb (invitrogene);

Giếng 1, 2 - Sản phẩm ADN khuếch đại lần 1;

Giếng 4, 5 - Sản phẩm PCR lần 2.

T4 LigaseCắt RE + Tinh sạch

Phản ứng cắt được tiến hành ở 37oC trong 1 giờ

• B1: Cắt lấy mẩu gel chứa đoạn DNA có kích thước cần kiểm tra cho vào ống tiêm 1 ml, dùng áp lực đẩy gel agarose chứa DNA qua ống

tiêm 1 ml, sản phẩm được thu trong ống eppendorf 1,5 ml.

• B2: Thêm 800 µl phenol (pH = 8,0), trộn đều bằng vortex, ủ ở -80oC,1h

• B3: Làm tan hỗn ở nhiệt độ phòng, ly tâm 12.000 rpm, 5 phút

• B4: Hút dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung một lượng tương đương dung dịch chloroform : isoamyl alcohol với tỷ lệ

24 : 1 Lắc đều và tiếp tục hút dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới

• B5: Thêm 1/10 thể tích CH3COOK, pH = 5,2 và 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối, giữ lạnh Ủ hỗn hợp ở -20oC, 1 giờ

• B6: Ly tâm 12000 rpm trong khoảng 30 phút, thu kết tủa và làm sạch DNA bằng cồn 70% Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút, thu kết tủa,

làm khô và hoà tan DNA trong thể tích nước hợp lý.

TINH SẠCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHENOL LẠNH

T4 LigaseCắt RE + Tinh sạch

dH2O

: 1 μl: 1 μl: 1 μl: 1 μl: 6 μl

Phản ứng gắn được tiến hành ở 250C trong thời gian 1 giờ

BIẾN NẠP GENE OsNAC6 VÀO TẾ BÀO E coli

1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene OsNAC6

• Dịch tế bào DH5α giữ ở -800C được cấy trải trên môi trường LB đặc, nuôi qua đêm ở 370C, sau đó chọn một khuẩn lạc

đơn để nuôi lắc 200 rpm qua đêm ở 37oC trong 5 ml môi trường LB lỏng

• 500 ml môi trường LB lỏng được bổ sung vào 5 ml dung dịch nuôi qua đêm và tiếp tục nuôi lắc 200 rpm ở 370C khoảng

• 10 μl vector nhân dòng pSK II mang gene OsNAC6 đã chuẩn bị ở trên (mục 2.2.1.3) được bổ sung vào tế bào khả biến DH5α

• Hỗn hợp được trộn nhẹ và ủ trong đá 20 phút tạo điều kiện cho các vector bám lên thành tế bào

• Sau đó, được thực hiện phản ứng sốc nhiệt bằng việc chuyển hỗn hợp phản ứng trên vào bể ổn nhiệt

ở 420C trong 60 giây, ngay lập tức ủ hỗn hợp vào đá trong 5 phút

• Hỗn hợp phản ứng sau đó được trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 μg/ml ampicilin, nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm

Biến nạp gene OsNAC6 vào tế bào E coli bằng phương pháp sốc nhiệt

• Sản phẩm PCR và vector pSK II chỉ được gắn với nhau bởi một vị trí enzym giới hạn BamH I nên sản phẩm PCR có

thể gắn vào vector theo chiều xuôi (forward) hoặc ngược (reverse)

• Vì vậy, phản ứng PCR đặc hiệu với mồi xuôi là mồi của promoter T3 (T3-F) và mồi ngược là mồi đặc hiệu của gene

OsNAC6 (OsNAC6-R) được tiến hành để xác định sự có mặt xuôi chiều của gene OsDREB2A tái tổ hợp với vector

pUC19-Ubi trong khuẩn lạc

• Các khuẩn lạc cho sản phẩm PCR là các băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước của gene OsNAC6 được

tiếp tục nuôi để tách plasmid

Kiểm tra gene OsNAC6 trong khuẩn lạc bằng phản ứng PCR.

1 dòng E.Coli chứa plasmid mang gene

OsNAC6

Giải trình tự gene OsNAC6

Thiết kế vector chuyển gene mang

OsNAC6

• B1 : Nuôi cấy lắc 1 khuẩn lạc đơn trong 2ml môi trường LB lỏng, lắc 200 rpm qua đêm ở 370C.

• B2 : Chuyển dung dịch nuôi qua đêm vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm ở tốc độ 6.000 rpm trong 5 phút

• B3 : Thu cặn tế bào, hòa tan trong 150 μl dung dịch I để lạnh (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH = 8,0) và 10 mM EDTA)

• B4 : Bổ sung 300 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ

• B5 : Tiếp tục bổ sung 200 µl dung dịch III để lạnh (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml axit acetic đậm đặc; 28,5 ml nước), đảo

nhe

• B6 : Dung dịch tế bào được ủ trong đá khoảng 10 phút và ly tâm 12.000 rpm ở nhiệt độ phòng

TÁCH DNA PLASMID TỪ VI KHUẨN E coli DH5α

• B7 : Thu dịch trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml sạch và bổ sung 2 µl enzym RNase (10 µg/ml)

• B8: Bổ sung một lượng tương đương dung dịch phenol : chloroform : isoamyl alcohol theo tỷ lệ 25 : 24 : 1, ly tâm 12.000 rpm trong khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng.

• B9 : Chuyển pha trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới rồi bổ sung dung dịch chloroform : isoamyl alcohol theo tỷ lệ 24 : 1 với thể tích tương đương Ly tâm 12.000 rpm trong khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng

• B10 : Thu pha trên cùng và chuyển sang một ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung CH3COOK 3M (pH = 5,2) với tỷ lệ 1/10 thể tích Bổ sung

2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối giữ lạnh, kết tủa DNA ở -80oC trong 1 giờ Ly tâm 12.000 rpm khoảng 30 phút ở 4oC

• B11 : Rửa DNA bằng cồn 70%, sấy khô, hòa tan DNA trong 50 µl nước / TE.

TÁCH DNA PLASMID TỪ VI KHUẨN E coli DH5α

Hình : Sơ đồ tách dòng gene OsNAC6 trong vector nhân dòng pBluescript II ( PSK II)

KẾT QUẢ

• Mức độ tương đồng ở Nucleotide của đoạn DNA là 100% với gene mã hóa OsNAC6 lúa Japonica, 93% với NAC cây ngô, 91% với NAC bạc hà đắng.

• Mức độ tương đồng ở acid amine là 94% với nhân tố phiên mã NAC lúa mỳ, 94% với nhân tố phiên mã NAC bạc hà đắng và 87% với nhân tố phiên mã NAC cây ngô

• Dựa theo các kết quả thu được, có thể khẳng định đã phân lập thành công đoạn DNA mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 điều khiển tính chịu hạn, mặn ở lúa

KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE OsNAC6

 Tạo vector trung gian

Gene OsNAC6 trong vector tách dòng pSK II-OsNAC6 được thu nhận lại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu F/OsNac6-R để nhân trình tự nucleotide mã hóa gene OsNAC6 Phản ứng PCR được tiến hành như mô tả ở phân phân lập gene OsNAC6, chỉ khác

OsNac6-là thành phần phản ứng sử dụng sợi khuôn OsNac6-là 50 ng plasmid pSK II-OsNAC6

Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 1%, tinh sạch bằng cột GeneluteTM Minus EtBr, xử lý enzym giới hạn Bam HI, gắn vào vector pUC19-Ubi đã xử lý Bam HI và loại gốc phosphate trước đó để tạo vector trung gian pUC19-Ubi-OsNAC6 Chiều gắn của gene OsNAC6 trong vector pUC19-Ubi được kiểm tra bằng cặp mồi Ubi-F/OsNac6-R Vector pUC19-Ubi-OsNAC6 có chiều gắn xuôi được biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α, nuôi lỏng thu sinh khối, tách plasmid và giải trình tự trước khi gắn vào vector chuyển gene

Thiết kế vector chuyển gene mang gene OsNAC6 bằng kỹ thuật Gatewaya

 Tạo vector chuyển gene

LR clonase buffer Vecor cho (pUC19-Ubi) 100 ng/μl Vector nhận (pBCKH) 20 ng/μl TE

LR clonase

: 1 μl : 0,5 μl : 0,5 μl : 2,5 μl : 0.5μl

Việc gắn cấu trúc gene gồm promoter Ubiquitin, OsNAC6 và trình tự kết thúc phiên mã trong vector

pUC19-Ubi-OsNAC6 vào vector nhận pBCKH để tạo ra vector chuyển gene pBCKH-Ubi-pUC19-Ubi-OsNAC6 được thực hiện theo quy trình Gateway kit (Invitrogene).

Phản ứng gateway được tiến hành trong hỗn hợp phản ứng 5 μl với các thành phần phản ứng :

Thiết kế vector chuyển gene mang gene OsNAC6 bằng kỹ thuật Gatewaya

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 250C trong thời gian 1giờ, sau đó bổ sung 0,5 μl proteinase K ủ ở 370C trong 10 phút để loại

A CHUẨN BỊ TẾ BÀO KHẢ BIẾN

Tạo tế bào Agrobacterium tái tổ hợp có mang gen OsNAC6

Chuẩn bị tế bào khả biến

Bước 1: Nuôi cấy 5ml A.Tumefaciens trong 500ml YEM, lắc 200v/p, 280C, 8h, OD=0.5 – 0.8 ->Tăng sinh vi

khuẩn

Bước 2: Ly tâm lạnh 6000v/p, 5 phút, 40C -> Thu sinh khối tế bào(cặn)

Bước 3: Hòa tan bằng 5 - 10ml nước lạnh, trộn đều, them tiếp đến 500ml nước lạnh, ly tâm 6000v/p, 5 phút, 40C -> Thu cặn tế bào

Bước 4: Thêm 250 ml nước đá, ly tâm 6000v/p, 5 phút, 40C -> Thu cặn tế bào

Bước 5: Bổ sung 5ml glycerol 10% -> bảo vệ tế bào

Bước 6: Bảo quản trong Nitơ lỏng -800C

Biến nạp gene OsNAC6 vào tế bào khả biến

Bước 1: Trộn 100ng plasmid tái tổ hợp vào các tế bào khả biến Agrobacterium EHA105, trộn đều, để hỗn hợp trong đá 30 phút

Bước 2: Chuyển hỗn hợp vào cuvet điện, ủ đá 5 - 10 phút, tiến hành biến nạp bằng máy xung điện: Điện dung 25μF, Điện thế 2.4 KV, Điện trở

200 Ω, Thời gian 5s

Bước 3: Chuyển qua ống falcol, ủ 4h, 280C

Bước 4: Ly tâm, bỏ dịch nhưng giữ lại 50 - 100 μl, cấy trang lên môi trường LB đặc có bổ sung 50mg/l Kanamycin, ủ trong 2 ngày, 280C

Bước 5: Nuôi các khuẩn lạc đơn trong môi trường YEB lỏng có bổ sung 50mg/l Kanamycin, lắc 200v/p qua đêm

Bước 6: Tách chiết plasmid, điện di để kiểm tra

Bước 7: Bảo quản các khuẩn lạc có kết quả dương tính trong môi trường YEB, có bổ sung glycerol 15% trước khi làm lạnh đến -700C

Chuyển gene OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati thông qua vi khuẩn

Tạo callus

Hạt lúa bóc vỏ, rửa bằng nước cất 4-5 lần, ngâm và lắc nhẹ trong cồn 70%, 1 phút

Rửa lại bằng nước cất khử trùng, ngâm trong Javel 50% có bổ sung tween 20 trong

20 phút

Rửa lại bằng nước cất 4-5 lần Thấm khô

Đặt hạt vào môi trường MS có bổ sung 2,4-D, BAP, casein, L-proline , giữ trong tối

ở 280C, 15 ngày

Nhiễm callus với Agrobacterium EHA105

Bước 1: Tế bào Agrobacterium EHA105 chứa gene OsNAC6 được nuôi qua đêm và đo OD600, sau đó được đem

ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa và hòa tan vào môi trường MS lỏng, sau đó pha loãng tới nồng độ OD600 = 0,5, bổ sung Acetosyringone nồng độ 30 μg/ml

Bước 2: Các callus được cho vào ống fancol chứa dung dịch MS đã được hòa Agrobacterium EHA105 được

chuẩn bị, lắc trong máy lắc 30 phút

Bước 3: Callus được đổ ra tấm lưới đã khử trùng và được làm khô bằng cách đặt lên giấy thấm khử trùng để loại

bỏ Agrobacterium còn lại, sau đó callus được chuyển lên môi trường Đồng nuôi cấy có ngăn bởi giấy lọc Các callus sau khi được nhiễm Agrobacterium EHA105 chứa gene OsNAC6 được nuôi trong tối ở 280C trong 3 ngày

Chọn lọc và tái sinh

Sau quá trình lây nhiễm, Callus được rửa nhiều lần bằng nước đường khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim,

làm khô bằng giấy thấm để loại bỏ Agrobacterium EHA105

Chuyển Callus sang môi trường chọn lọc 50 mg/l hygromycin, nuôi cấy 2 tuần, 280C, hết tuần 1 chuyển sang đĩa mới

Chuyển Callus sang môi trường chọn tái sinh lọc, 250C, độ ẩm từ 50 - 70%, quang chu kỳ 16 giờ/ngày, 3.000 Lux

Các giai đoạn tạo chủng lúa Chứa gen OsNAC6

4 KẾT QUẢ

Từ 100 hạt lúa được đem vào nuôi cấy ở môi trường MS2, thu được 95 callus và sử dụng số lượng callus này

để tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium.

Sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, có 20 callus sống sót và được chuyển sang môi trường tái sinh

Sau 4 tuần tái sinh, kết quả thu được 12 callus có chồi sinh trưởng bình thường

Tổng số thu được 12 dòng lúa sinh trưởng và phát triển bình thường

Kiểm tra cây chuyển gene

A. Tách chiết DNA tổng số

Thực hiện theo phương pháp tách chiết plasmid

B Thực hiện pư PCR và điện di để kiểm tra

Hình Điện di sản phẩm nhân

gene mã hoá nhân tố phiên mã OsNAC6

ở các dòng lúa Pusa Basmati chuyển

gene

Kết quả:

Có 11 dòng lúa đã được chuyen gene OsNAC6 thành công

Có 1 dòng lúa không cho kết quả PCR

5 KẾT LUẬN

• Việc nghiên cứu thực hiện chuyển gene trên giống lúa Basmati thành công tạo ra một cơ sở, nguồn cung cấp

dữ liệu cho việc thực hiện tạo ra các giống lúa mới, có khả năng chịu hạn ở nước ta

• Góp phần vào khắc phục với tình trạng biến đổi khí hậu ảnh hưởng đến thời tiết, môi trường sống của cây

trồng hiện nay

• Tạo ra hướng nghiên cứu tích cực

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE