THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN, SỰ KIỆN CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN GA21

Cây trồng biến đổi gen là một thành tựu lớn của công nghệ sinh học hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích to lớn cho ngành nông nghiệp tuy nhiên tính an toàn của cây trồng biến đổi gen và thực phẩm biến đổi gen đang là vấn đề được cả thế giới quan tâm. Việt Nam cũng là một trong những nước rất chú trọng đến vấn đề quản lý an toàn sinh học và an toàn thực phẩm đối với cây trồng và thực phẩm biến đổi gen, ở nước ta vấn đề nay đã được đưa vào các luật nhằm đảm bảo tính an toàn cho con người, động thực vật, hệ sinh thái và đa dạng sinh học nói chung. Ở nước ta đã có một số cây trồng được cấp phép cho trồng và sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi trong đó sự kiện về cây ngô GA21 là một trong những sự kiện tiêu biểu. Do đó, nhóm em xin phép chọn đề tài về “Sự kiện cây trồng biến đổi cây ngô GA21” để tìm hiểu trong tiểu luận này.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI.

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM.

TIỂU LUẬN MÔN HỌC: THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN.

SỰ KIỆN CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN GA21

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Tiến Thành.

Nhóm sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Liên – 20132244

Nguyễn Thị Hồng - 20131685 Lại Ngọc Dung – 20130574 Nguyễn Thị Thảo – 20131229 Nguyễn Thu Hà – 20131169 Nguyễn Thị Hưng - 20131955

HÀ NỘI, THÁNG 12 - 2016

PHẦN MỞ ĐẦU.

Cây trồng biến đổi gen là một thành tựu lớn của công nghệ sinh học hứa hẹn mang lại nhiều lợiích to lớn cho ngành nông nghiệp tuy nhiên tính an toàn của cây trồng biến đổi gen và thựcphẩm biến đổi gen đang là vấn đề được cả thế giới quan tâm Việt Nam cũng là một trong nhữngnước rất chú trọng đến vấn đề quản lý an toàn sinh học và an toàn thực phẩm đối với cây trồng

và thực phẩm biến đổi gen, ở nước ta vấn đề nay đã được đưa vào các luật nhằm đảm bảo tính antoàn cho con người, động thực vật, hệ sinh thái và đa dạng sinh học nói chung Ở nước ta đã cómột số cây trồng được cấp phép cho trồng và sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi trong

đó sự kiện về cây ngô GA21 là một trong những sự kiện tiêu biểu

Do đó, nhóm em xin phép chọn đề tài về “Sự kiện cây trồng biến đổi cây ngô GA21” để tìm hiểutrong tiểu luận này Nhóm em có sáu thành viên và phân công nội dung tìm hiểu cho từng thànhviên như sau:

1 Nguyễn Thị Liên 20132244 Tổng quan về sự kiện

2 Nguyễn Thị Hồng 20131685 Thông tin chung về phương pháp chuyển gen

3 Lại Ngọc Dung 20130574 Vector chuyển gen

4 Nguyễn Thị Thảo 20131229 Đánh giá hiệu quả chuyển gen

5 Nguyễn Thu Hà 20131169 Đánh giá nguy cơ của cây trồng biến đổi gen

với môi trường và đa dạng sinh học

6 Nguyễn Thị Hưng 20131955 Đánh giá an toàn thực phẩm và thức ăn chăn

nuôiQuản lý rủi ro và phòng ngừa

Trong quá trình tìm hiểu để hoàn thành bài tiểu luận này, chúng em đã nhận được rất nhiều sự giảng dạy, chỉ bảo của thầy Nguyễn Tiến Thành, chúng em xin chân thành cảm ơn!

PHẦN NỘI DUNG

I Tổng quan

- Tên sự kiện: Sự kiện chuyển gen GA21

- Cây trồng BĐG: Ngô

- Sự kiện chuyển gen: GA21, có gen biến đổi 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase

(mepsps) là từ enzyme EPSPS từ ngô được biến đổi, enzyme này là enzyme phổ biến có trongthực vật và vi sinh vật nhưng không xuất hiện ở động vật enzyme m PSPS là enzyme được biếnđổi với các đặc tính nhận biết là giống với enzyme gốc trong ngô tới 99,3%

- Tính trạng đưa vào: kháng thuốc trừ cỏ với đặc tính biểu hiện: Ngô GA21 mang đặc tính có

lợi là chống chịu được thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất glyphosate, với tính năng sử dụng linh hoạtkhi chúng ta có thể phun thuốc trừ cỏ glyphosate trùm lên cây ngô GA21 trong khoảng 16 đến

40 ngày sau gieo hoặc trước khi khép tán (tùy vào mùa vụ và giống ngô) Sau khi phun cỏ sẽchết còn cây ngô mang sự kiện GA21 vẫn sống và sinh trưởng bình thường

- Đơn vị khảo nghiệm: Công ty TNHH Syngenta Việt Nam Trung tâm khảo kiểm nghiệm

giống, sản phẩm cây trồng và phân bón Nam Bộ và Viện Bảo vệ Thực vật Khả năng khángthuốc trừ cỏ Glyphosate của ngô NK66GA21trong khảo nghiệm diện rộng tại: Hưng Yên, Sơn

La, BRVT và Đăk Lăk

- Những tính trạng và đặc điểm mới của ngô biến đổi gen so với ngô thông thường

Giống Ngô biến đổi gen GA21 có 1 tính trạng khác biệt so với ngô truyền thống khả năng khángthuốc trừ cỏ: Glyphosate, có khả năng phòng trừ cỏ dại trên ngô

- Đặc điểm giống nền sử dụng khảo nghiệm ở Việt Nam Giống nền NK66 :

 Ngô hay còn gọi là bắp có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo(Poaceae hay gramineae), bộ hoà thảo (Poales hay Graminales), lớp một lá mầm(Monocotylens), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), phân giới thực vật bậc cao(Cosmobionia)

 Được tạo từ tổ hợp lai giữa 2 dòng ngô có nguồn gốc nhiệt đới NP5024/NP5063

 Dạng hình cây gọn sinh trưởng phát triển rất khoẻ, bộ lá xanh lâu tàn, cứng cây và ít đổ ngã

 Không chống chịu được thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất glyphosate

- Giống đã được thương mại hóa vào năm 2006, với một số đặc điểm nông sinh học và chế độ

canh tác:

 Giống thích nghi rộng, có thể trồng trến tất cả các

 vùng sinh tái và mùa vụ khác nhau

 Cho năng suất cao, ổn định

 Thời gian sinh trưởng: 95-100 ngày

 Nồng độ m EPSPS trên mẫu đo còn tươi trên cây nhận được từ ngô GA21

II Thông tin phương pháp chuyển gen

- Muốn tạo một sinh vật biến đổi gen (genetically modified organism-GMO) cần phải có phươngpháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào trong tế bào của chúng

- Ở vi khuẩn, tế bào được xử lý bằng dung dịch muối calcium chloride +Ở tế bào nấm men, sựtiếp nhận DNA tăng lên khi tế bào tiếp xúc với lithium chloride hoặc lithium acetate

- Tuy nhiên, đối với phần lớn sinh vật bậc cao cần phải có các phương pháp khác tinh vi hơn

- Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tếbào thực vật Nó đã trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thựcvật Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng, các kỹ thuậtnày còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen

 Mô tả quá trình tạo ra sinh vật biến đổi gen gồm mô tả sơ bộ phương pháp chuyển gen

- Ngô biến đổi gen mang sự kiện GA21 được tạo ra từ dòng bố mẹ ban đầu bằng phương pháp

bắn gen sử dụng plasmid pDPG434 mang gen 5’- enolpyruvylshikimate -3 Phosphate Synthase

cải biến (mepsps) là vật liệu ban đầu

- Plasmid pDPG434 được sử dụng để tạo ra dòng ngô GA21 qua biến nạp bằng súng bắn gen có

nguồn gốc từ vectơ pSK, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử

- Phân đoạn giới hạn NotI này còn chứa đoạn peptide vận chuyển tối ưu mang chức năng hướng

protein mEPSPS chuyển tới lục lạp

- Phân đoạn gen chuyển vào môi trường mô tế bào cây ngô không chứa ADN lẫn tạp bao gồm

gen chỉ thị kháng kháng sinh và đoạn khởi động sao mã ColE1cũng như gen bla hoặc trình tự gen lacZ

1 Thông tin gen chuyển

1.1 Đánh giá chung

- Trình tự chuỗi axit amin của protein mEPSPS giống đến 99,3% so với protein EPSPS là

enzyme quan trọng trong con đường axit shikimic và enzyme này được tìm thấy trong tựnhiên ở tất cả thực vật, nấm, vi khuẩn

- So sánh trình tự chuỗi axit amin của protein mEPSPS với trình tự của các protein độc tố

trong ngân hàng dữ liệu thông tin cho thấy mEPSPS không tương đồng với bất kỳ độc tố đãbiết nào

- Ngoài ra, các nghiên cứu còn chỉ ra rằng protein mEPSPS dễ dàng bị thủy phân trong môi

trường giống như ruột của người và mất hoạt tính ở nhiệt độ cao Đánh giá nguồn tác nhângây dị ứng không thấy có nguy cơ do trình tự protein không tương đồng với bất kỳ tác nhân

dị ứng nào đã biết Cùng với sự có mặt với nồng độ thấp của protein này trên ngô, mức phơinhiễm của người và động vật đối với chúng là thấp

1.2 Cấu trúc

gồm hai lĩnh vực mà sự tham gia của các sợi protein Sợi này đóng vai trò như một bản lề, và

có thể mang hai lĩnh protein gần nhau hơn Khi một chất nền liên kết với các enzyme, phối tử

liên kết gây ra hai phần của các enzyme để kiểm soát xung quanh các chất nền trong cáctrang web hoạt động.

+ Lớp tôi men, chứa trong nhà máy và trong một số vi khuẩn, ức chế ở nồng độ glyphosatemicromolar thấp

+ Trong khi lớp II enzyme được tìm thấy ở các vi khuẩn khác, có khả năng chống sự ức chế củaglyphosate

1.3 Đường Shikimate

thực vật EPSP synthase chỉ là sản phẩm của thực vật và vi sinh vật; các gen mã hóa cho nó không

Vị trí epsps

->The Roundup Ready gene uses the 35S promoter to give expression in all cells It also has the EPSPS (Roundup resistance) coding region with the addition of the CTP coding segment

to direct the EPSPS protein to the chloroplasts

2.Các bước tiến hành trong kỹ thuật chuyển gen

2.1 Một số nguyên tắc cơ bản của việc chuyển gen

- Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnhhưởng đến quá trình chuyển gen như sau:

 Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)

 Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoạilai

 Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhậngen biến nạp vào genome

- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau Cần xem xét một số vấn

đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây Ở các tế bào khác có haitrường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khảnăng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây

- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giaiđoạn phát triển của mô và cơ quan

- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyểngen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá

bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm

- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời củagen

- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết

ổn định với genome

- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó đượcđưa vào

- Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên kết với genome

mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem)

2.2 Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau :

- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm

- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện DNA hoặc từ thư viện genomic DNA)

- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp

- Biến nạp vào E coli

- Tách chiết DNA plasmid

- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đã kể trên

- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc

- Tái sinh cây biến nạp

- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiệncủa chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác )

-> Tóm lại, các bước chính tạo GMO:

Lựa chọn gen và sinh vật cho > Tách gen từ sinh vật cho > Thiết kế cấu trúc biểu hiện

gen-> Đưa gen lên các phương tiện vận chuyển-gen->Chuyển gen vào tế bào đích-gen->Sàng lọc tế bào đạt yêucầu

2.2.2 Phân lập gen

2.2.2.1.Tách gen từ sinh vật cho

- Thu gen nguyên vẹn, không lẫn tạp chất, hiệu suất thu hồi cao

 Phương pháp:

+Phá màng TB, màng nhân( enzym, cơ học)

+Tách ADN khỏi các thành phần khác( trích ly, cột silica)

+Thu nhận ADN (kết tủa ly tâm, rửa giải trên màng silica)

2.2.2.2 Phương pháp nhân gen PCR

+PCR- Polymerasa Chain Reaction cho phép khuyeesch đại một số lượng rất lớn bản sao củagen trong một thời gian ngắn

+Nguyên tắc: dựa trên sự biến tính, hồi tính của ADN và nguyên lí tổng hợp ADN

+Cơ sở: trình tự ADN khuôn, mồi xuôi (PrimerF) và mồi ngược (PrimerR), enzym ADNpolymerase, các Nu tự do

*Primers and Probes

Chuỗi phản ứng liên tục

->Phương pháp chạy PCR gồm 3 giai đoạn:

- Biến tính ở 94-96oC

- Bắt cặp ở 55-65OC

- Kéo dài tại 72oC

*Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

- ADN khuôn: tinh sạch, kích thước<3kb

- Nu tự do: tỉ lệ G-C, nồng độ mõi loại

- Mồi: không quá ngắn, trình tự mồi có tính đặc hiệu cao, nồng độ,

- Nhiệt độ tiếp hợp mồi được tính toán theo công thức:

- Nhiệt độ tiếp hợp mồi = [(A + T ) x 2] + [(G + C) x 4]

- Enzym ADN Polymerase: đặc hiệu tùy loại, hàm lượng thích hợp

- Dung dịch đệm: đảm bảo cho hoạt động enzym( các muối ảnh hưởng khả năng bắt cặp, gắnmồi)

2.3Vector chuyển gen

- Gen sau khi được nhân lên với số lượng lớn bằng phương pháp PCR sẽ biến nạp vào vecto đểlưu trữ gen

- Vecto được sử dụng là pDPG434 với cấu tạo gồm 2 thành phần chính:

 Phần T-DNA chứa gen đã biến đổi và những vùng lân cận cần thiết

 Phần backbone có nguồn gốc từ vecto PUC19 của E.coli ER2272

- Phần backbone:

 Gen LacZ:

 Mã hóa enzyme β-galactosidase của vi khuẩn E.coli

 Khi có mặt chất cảm ứng IPTG (chất đồng đẳng của đường lactose) và X-gal,enzyme thủy phân X-gal có màu xanh, nếu cài đọan DNA vào giữa gen LacZ sẽlàm mất hoạt tính và các khuẩn lạc phát triển màu trắng

 Gen Bla:

 Mã hóa gen β-lactamase kháng ampicillin và các penicilen khác

 Khi môi trường được bổ sung các chất kháng sinh, các tế bào chứa vecto tái tổ hợp

có chứa gen kháng kháng sinh nên vẫn phát triển được, những tế bào không chứavecto tái tổ hợp không phát triển được

→ Kết hợp 2 gen để làm chỉ thị nhận biết những tế bào chứa vecto tái tổ hợp cho hiệu quả cao

 Là đầu 5’ của gen actin trong lúa

 Intron là những đoạn trong gen nhưng không tham gia vào quá trình mã hóa protein

 Promoter có vai trò khởi đầu phiên mã

 Đoạn gen này chính là terminater có nhiệm vụ kết thúc phiên mã

 Có nguồn gốc từ Agrobacterium tumefacines

- Sử dụng phương pháp bắn gen

 Sau khi tạo vecto tái tổ hợp sẽ được đưa vào tế bào vi khuẩn E.coli để giữ gen Khi sửdụng, chúng ta sẽ loại bỏ gen LacZ và Bla và sử dụng súng bắn gen để đưa gen vào tế bàocủa cây ngô

 Súng bắn gen bao gồm 2 buồng thép không gỉ nối với 2 bơm chân không

 DNA được gắn vào các hạt vàng có kích thước rất nhỏ và đặt trên 1 cái đĩa ở mặt trongcủa súng Khi bắn, đĩa sẽ lao về phía trước với tốc độ của viên đạn và bị 1 tấm chắn giữlại còn các hạt vàng được phóng về phía tế bào đích, xuyên qua vách tế bào và phóngthích các phân tử DNA

 Sau khi bắn gen, gen sẽ được gắn vào các NST trong nhân

 Phân tích trình tự đoạn DNA trong ngô GA21 cho thấy đoạn gen mEPSPS dạng đầy đủ

và các vùng xung quanh hợp nhất vào hệ gen ngô GA21 có 6 vùng liên tục có nguồn gốc

từ đoạn cắt NotI của plasmid pDPG343 Tức là đoạn gen biến nạp có 6 bản sao

III Đánh giá hiệu quả chuyển gen

3.1 Khả năng di truyền

a Thí nghiệm chứng minh

- Tiến hành đo nồng độ protein mEPSPS trên lá cây ngô biến đổi gen GA21 qua ba thế hệ lai hồi

nghiệm đánh giá rủi ro ngô GA21 đối với môi trường và đa dạng sinh học” của Công ty Syngenta Việt Nam)

Phạm vi trung bình mEPSPS ( μg/g gam chất khô )

b Kết quả

Bảng 2: Nồng độ mEPSPS trên mẫu đo ngô còn tươi GA21(μg/g)

Bảng 3: Nồng độ mEPSPS trên mẫu đo khô trong cây ngô GA21(μg/g)

c Kết luận

- Hàm lượng protein mEPSPS biểu hiện trên các bộ phận khác nhau của cây ngô ở các giai

đoạn khác nhau là khác nhau khi phân tích ở cả mẫu tươi và mẫu khô của ngô chuyển genGA21

- Ở mẫu ngô tươi GA21

+ Nồng độ protein biến đổi trong lá chiếm tỷ lệ cao nhất so với các bộ phận khác của cây như

rễ hay thân cây trong 2 giai đoạn đầu trong quá trình phát triển của cây là giai đoạn ra lá và rahoa

+ Ở giai đoạn hạt chín và cây già, nồng độ protein biến đổi ở lá giảm mạnh, chiếm một tỷ lệrất nhỏ trong khi hàm lượng mEPSPS trong hạt lại cao nhất so với các bộ phận khác của câynhư rễ hay thân

- Ở mẫu ngô khô GA21

+ Nồng độ protein biến đổi trong lá cũng chiếm tỷ lệ cao nhất so với các bộ phận khác củacây như rễ hay thân cây trong 2 giai đoạn cây ra lá và ra hoa

+ Nồng độ protein biến đổi trong hạt lại chiếm tỷ lệ thấp hơn trong giai đoạn hạt chín và câygià so với rễ và thân cây Nồng độ protein biến đổi trong lá cũng giảm dần trong hai giaiđoạn này

3.3 So sánh tính trạng của cây ngô chuyển gen GA21 và cây ngô không chuyển gen cùngdòng

a Khảo nghiệm tiến hành

- Các tính trạng được nghiên cứu

Có tới 20 tính trạng khác nhau được đánh giá

+ Đặc điểm hình thái: Thời gian sinh trưởng, chiều cao, kích thước bắp, hình dạng lá, hìnhdạng hạt,

+ Thành phần dinh dưỡng: hàm lượng protein, chất béo, cacbonhydrat, các axit amin, axitbéo, các chất khoáng,…

+ Khả năng nhạy cảm về bệnh: khảo sát các bệnh thường gặp trên cây ngô như bệnh khô vằn,bệnh khảm, bệnh gỉ sắt, bệnh đốm lá,…

+ Khả năng kháng thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate

+ Năng suất

…