Báo cáo thí nghiệm vi sinh

BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa:Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điềukiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra

BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa:

Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điềukiện có oxy phân tử

2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí:

Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệsinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hưhỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chếbiến và bảo quản thực phẩm

Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chấtlượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư

hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bịchua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm

cấu trúc

3.Quy trình kiểm tra:

1ml(10 -1 )+ 9ml nước 1ml(10 -1 )+ 9ml nước nước vô trùng nước vô trùng

trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30”thu được nồng độ 10-1

Bước 2 : pha loãng mẫu

Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùnglấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm Dùng micropipet 1ml vô trùnglấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất Tiến hành rung lắc

tương tự với các nồng độ kế tiếp

Lưu ý khi pha loãng mẫu:

-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thựcphẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểmnghiệm…

-Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải

vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiệntượng sai số

-Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều

Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu

Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp

Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2đĩa/nồng độ

các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đềudịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môitrường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert

Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.Ahoặc N.A

Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặcSabouraund

n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất

n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai

d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm

100 ).

120 105 125 113 (

4.2.Môi trường Plate Count agar

vâ ăt Trên thực tế kiểm nghiê ăm coliform phân được quan tâm nhiều hơncoliform Coliform phân có nguồn gốc từ ruô ăt người và các đô ăng vâ ăt máunóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater Khi coliform



phân hiê ăn diê ăn ở mô ăt số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng chứa các

vi sinh vâ ăt gây bê ănh hiê ăn diê ăn trong phân.Chỉ tiêu tổng coliform không thíchhợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân Tuynhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số visinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44oC Do

đó số lượng E coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lýnguồn nước

Trong các thành viên nhóm coliform phân thì E.coli là loài được quantâm nhiều về vê ă sinh an toàn thực phẩm

Loài vi sinh vâ ăt này phân bố ở mọi nơi, có trong ruô ăt người và các

đô ăng vâ ăt máu nóng

*mô ôt số hình ảnh về coliform:

297 x 300

2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu

Coliform được xem là nhóm vi sinh vâ ăt chỉ thị Số lượng hiê ăn diê ăncủa chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiê ăndiê ăn của các vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác Số lượng coliforms cao thì khảnăng hiê ăn diê ăn của vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác cao

Colifrorm chịu nhiê ăt( coliform phân):

đô ăng vâ ăt máu nóng

chế biến, bảo quản , vâ ăn chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉthị sự ô nhiễm phân trong môi trường

-3.Quy trình kiểm tra

Phương pháp MPN :

Nguyên tắc:

Mẫu được pha loãng thành mô ăt dãy thâ ăp phân , 2 nồng đô ă kế tiếpnhau khác nhau 10 lần Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ốngdurham Mỗi nồng đô ă pha loãng được lă ăp lại 3 ống Theo dõi sự sinh hơitrong từng ống nghiê ăm Xác định ống dương tính ở mỗi nồng đô ă pha loãng

và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vâ ăt tương ứng hiê ăndiê ăn trong 1g hoă ăc 1ml mẫu ban đầu

Sơ đồ quy trình kiểm tra :

1ml(10 -1 )+ 9ml nước 1ml(10 -2 )+ 9ml nước vô trùng nước vô trùng

Stomacher

10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoă ăc là nước vô trùng,stomacher thu được nồng đô ă 10-1 mục đích đồng nhất là để phân bố đều visinh vâ ăt

Bước 2:

Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vâ ăt có trong mẫu ban dầu.Lấy 1ml mẫu ở nồng đô ă 10-1 cho vào ống nghiê ăm thứ nhất, sau đó cho 9mlnước vô trùng Ta được ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-2 Sau đó lấy 1ml mẫu ở

nghiê ăm có nồng đô ă 10-3 tương tự như trên ta thu được các ống nghiê ăm cónồng đô ă 10-4, 10-5…

Bước 3:

Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nồng đô ăliên tiếp(10-1,10-2,10-3) như sau : Mỗi nồng đô ă lấy 3 ống nghiê ăm Cho vàomỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiê ăm saocho ngâ ăp ống durham Ghi 3 nồng đô ă liên tiếp bên ngoài ống nghiê ăm(mỗinồng đô ă 3 ống nghiê ăm) Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ở nồng đô ă 10-1

vào 3 ống nghiê ăm có ghi nồng đô ă 10-1(chứa môi trường LT),tương tự cho cácống nghiê ăm ở những nồng đô ă tiếp theo (hình 1.1) ủ ở 37oC/24h

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường LauryTrytose (LT):

- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trườngLaury Trytose

- Không lắc những ống có ống durham

Bước 4:

Đọc kết quả các ống Laury Tryptose Có 3 trường hợp xảy ra:

+ ống durham không thay đổi

+ ống durham nổi lên trên

+ ống durham sinh hơi

dương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấyvòng nhúng vào môi trường LT dương tính ở trên,rồi cho vào ống có môitrường BGBL Ghi nồng đô ă trên sản phẩm Ủ 37oC /24h

Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc cóbọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tíchống chuông)

Ống LT - : không có hiê ăn tượng gì xảy ra

+ ống BGBL âm tính: không có hiê ăn tượng gì xảy ra

Bước 6:

Tính kết quả:

n là số nguyên dương của nồng đô ă pha loãng đầu tiên được nuôi cấy

Mâ ăt bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram + và

vi khuẩn gram – không phải coliform Brilliant green có nồng đô ă đă ăc hiê ău

hiê ăn tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường vàsinh khí trong ống durham do lên men lactose

5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm

Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiê ăm ,nồi autoclave, tủ sấy,ống durham , micropipet, mẫu là tương ớt



_

_

_

10-3

Tỷ lê ă của BGBL dương tính ở 3 nồng đô ă (10-1:10-2:10-3) = (0,2,0)

Tra bảng Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g

= 6.2 101=62 (cfu/ml)

BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI

Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển

được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+),không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồncacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêuchảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân

và chất lượng vệ sinh thực phẩm

coliform

Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người :

- Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em

- Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên

có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột

- Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai

- Các chủng gây lây nhiễm đường ruột

1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm.

Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.

2 Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ

kế tiếp nhau khác nhau 10 lần Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp cóống durham Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống Theo dõi sự sinhhơi trong từng ống nghiệm Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ phaloãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứnghiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu

- Các bình chứa mẫu vô khuẩn

- Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy

- Mẫu thực phẩm kiểm tra

- Ống durham

3.2.Môi trường và hóa chất:

- Môi trường E.C broth

- Môi trường Lauryl tryptose( LT)

- Môi trường endo agar

- Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar)

- Môi trường N.A (nutrient agar)

4.Tiến hành thí nghiệm:

Bước 1: Lấy mẫu

Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khốilượng khác nhau cho phù hợp Khi lấy mẫu cần đảm bảo :

- Mẫu phải có tính đại diện

- Lượng mẫu vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý hóa,sinh học

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn

- Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ

- Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu, ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơithu mẫu

Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0.85%, stomacher thu được nồng độ

10-1

Bước 2: Pha loãng mẫu

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng:

(nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn:

10 -1 9ml NaCl 9ml NaCl 9ml NaCl

(nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng

Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác

Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu:

- Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môitrường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô trùng

vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trườngdinh dưỡng.

- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn Các dụng

cụ phải được vô trùng

- Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh vậtphân tán đều trong mẫu

- Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipetkhác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các

tế bào ở độ pha loãng sau

- Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc:

 Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảoquản, quy trình chế biến )

 Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác )

Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT)

10-2 10-3 10-4

Môi trường Laury Trytose( LT)

Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ trong tủ ấm Ủ ở 37oC trong24h

Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc, tính kếtquả

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường LauryTrytose (LT):

- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn

- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trườngLaury Trytose

- Không lắc những ống có ống durham

Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền

các ống LT(+) vào các ống môi trường E.C Ủ 44ºC/24h

E.coli phát triển ở 44ºC,ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bịhạn chế khả năng sinh trưởng Hơn nữa môi trường E.C muối mật ức chế cá

vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột

Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc cóbọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tíchống chuông)

Ống LT - : không có hiê ăn tượng gì xảy ra

Từ các ống E.C (+), cấy phân lập trên môi trường endo agar và E.M.Bagar Ủ 37ºC/24h

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar

và E.M.B agar:

 Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn

 Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn trênmôi trường endo agar và E.M.B agar

Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình:

- Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại

- Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánhkim

Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A Ủ

có khả năng sử dụng simon citrat

1 Đặc điểm của Stapylococcus aureus:

1.1 lịch sử:

Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có

mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu

1.2 Phân bố:

 Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như thịt,sữa…

 Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi

 Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh

 Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội(opportunist type) vì sự có mặtrộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi đểxâm nhập

1.3 Hình dạng tế bào:

Là vk gram+, hình cầu không bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý

Trong vết thương và máu thường thấy hình dạng giống chùm nho

1.4 Đặc điểm và điều kiện sinh trưởng:

Phát triển tốt ở các môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt ở môitrường thạch máu hoặc huyết thanh

Nhiệt độ tối thích là 37oC , pHop=7.2

Trên môi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ

Ở môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở bềmặt môi trường

1.5 Đặc điểm sinh hoá:

 Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol,manitol

 Không lên men salicin, raffinose,inulin

 Có khả năng chịu mặn cao

 Làm đông tụ sữa

 Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu

 Phản ứng indol-,NH3-, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương

1.6 Khả năng gây bệnh:

Gây ngộ độc thực phẩm:

Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thựcphẩm đó và bị ngộ độc Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sốngtrong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng Loại này thường có tínhchất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm

Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy cóvsv gây bệnh

Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thựcphẩm đó bị ngộ độc)

Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ

độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc

hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứngkháng nguyên – kháng thể

Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột Type A và D gây ngộ độc thựcphẩm cho người

Triệu chứng bệnh:

Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộcvào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắtbụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng,đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72 h, nạnnhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội

Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc

Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tốnày 100oC/30’; 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực.

Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp,nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuỷ sản, thựcphẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này

Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quátrình chế biến

Biện pháp phòng ngừa:

 Kiểm tra sức khoẻ công nhân

 Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú

 Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố

 Hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển

 toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ các tế bào, một số bị phân huỷ ở to= 80oC /0.5h

 Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt10%/10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương

trên da ở người và động vật do Staphylococcus gây ra dùng dung