ky thuet xet nghiem: may sinh hoa

Quang phổ vạch được ứng dụng trong các máy đo đốt quang trong xét nghiệm để xácđịnh định tính của một số chất trong dung dịch.. Được dùng trong máy xét nghiệm để đựng mẫu khi đo, vì vậy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

TIỂU LUẬN

KỸ THUẬT SIÊU ÂM :MÁY QUANG

PHỔ

MỤC LỤC

1) K h á i

n i ệ m

q u a n g

p h ổ

Khi phân tích một nguồn sáng ra thành các ánh sáng đơn sắc gọi là quang phổ Có baloại: quang phổ liên tục, quang phổ vạch phát xạ và quang phổ vạch hấp thụ

- Quang phổ liên tục là quang phổ gồm nhiều dải sáng, màu sắc khác nhau, nối tiếpnhau một cách liên tục ví dụ: ánh sáng ngoài trời, bóng đèn dây tóc nóng phát ra

ánh sáng…… Quang phổ liên tục do các chất rắn, lỏng và khí có tỷ khối lớn phát

ra khi bị nung nóng

- Quang phổ vạch phát xạ là quang phổ các vạch màu riêng lẻ, ngăn cách nhau bằngnhững khoảng tối Nguồn phát quang phổ vạch là các chất khí, hay hơi có tỷ khốinhỏ phát ra khi nóng sáng Quang phổ vạch do các nguyên tố khác nhau là khácnhau cả về màu sắc lẫn số lượng vạch Ví dụ, hơi natri bị đốt nóng sẽ cho quangphổ là hai vạch màu vàng, quang phổ của hơi hiđrô cho 4 vạch là đỏ, lam, chàm,tím…

- Quang phổ liên tục thiếu vạch màu do bị chất khí hay hơi hấp thụ được gọi làquang phổ vạch hấp thụ của khí hay hơi đó

Việc ứng dụng quang phổ liên tục trong xét nghiệm là rất cần thiết, nguồn sáng dùngtrong đó phải có dải phổ rộng để có thể lọc ra được các bước sóng cần thiết trong cả bamiền: tử ngoại, vùng khả kiến và vùng hồng ngoại

Quang phổ vạch được ứng dụng trong các máy đo đốt quang trong xét nghiệm để xácđịnh định tính của một số chất trong dung dịch Tuy nhiên, hiện nay phương pháp nàykhông còn được dùng vì phức tạp và kết quả không định lượng

2) M ộ t

s ố

d ụ n g

c ụ

q u a n g

h ọ c

c ơ

b ả n

Phần này giới thiệu một số dụng cụ quang học cơ bản có ứng dụng trong các máy xétnghiệm sinh hóa hiện nay

Gương là dụng cụ quang học phản xạ hoàn toàn khi có ánh sáng chiếu tới gương chialàm 3 loại: gương phẳng, gương cầu lồi, gương cầu lõm

Trong máy sinh hóa thường dùng gương cầu lõm để tập trung được cường độ ánh sáng,tạo thành chum sáng song song

Cấu tạo của gương thường gồm 3 lớp:

- Lớp trên cùng là thủy tinh trong suốt để ánh sáng đi qua Ngoài ra nó còn có tácdụng tạo bề mặt phẳng để phủ lớp phản xạ

- Lớp ở giữa được phủ lên lớp thủy tinh có tác dụng phản xạ ánh sáng, lớp nàythường là bạc hoặc nhôm

- Lớp cuối cùng thường là lớp sơn bảo vệ cho lớp phản xạ

Thấu kính là một môi trường trong suốt giới hạn bởi hai mặt cầu hoặc một mặt phẳng,một mặt cầu

Nếu thấu kính có độ hội tụ D>0 ta có thấu kính hội tụ, D<0 ta có thấu kính phân kỳ tỏngmáy xét nghiệm, người ta chỉ sử dụng thấu kính hội tụ để tập trung ánh sáng hoặc tạochùm sáng song song Chùm sáng tới song song sẽ hội tụ tại tiêu điểm F của thấu kính

hoặc chùm sáng tới tại tiêu điểm F sẽ tạo chum sáng song song

c) L ăng kính

Ngày nay, lăng kính không được sử dụng phổ biến trong các máy đo màu và quang phổ

kế nhưng về mặt lịch sử lại có ý nghĩa vô cùng quan trọng lăng kính tách ánh sáng trắngthành ánh sáng đơn sắc do góc khúc xạ của các bước sóng khi đi qua lăng kính là khônggiống nhau, nên đầu ra của lăng kính sẽ là phổ liên tục của ánh sáng trắng như hình vẽ

Độ rộng của dải quang phổ liên tục thu được qua lăng kính phụ thuộc chủ yếu vào nănglượng khuếch tán, bản chất của lăng kính và góc ở đỉnh lăng kính Lăng kính sử dụng

trong các máy đo màu được làm từ thủy tinh và có thể cho ánh sáng đơn sắc có bướcsóng nằm trong dải 350 – 800nm Nếu phép đo yêu cầu thực hiện trong vùng cực tím thì

sử dụng lăng kính thạch anh vì thạch anh có sự hấp thụ bức xạ yếu trong vùng này nêncường độ chùm sáng tốt hơn

d) Bộ lọc Gelatin

Bộ lọc loại này có thành thấp, có thể tạo ra hoặc truyền dài bức xạ rộng 20nm Cấu trúccủa kính lọc giống như một chiếc bánh sandwich, kẹp giữa hai tấm kính mỏng là một lớpmỏng gelatin nhuộm màu sắc mong muốn Hạn chế của bộ lọc gelatin là:

- Chúng có dải thông rộng là nguyên nhân gây ra sự không tuyến tính cho cácđường chuẩn

- Bộ lọc này hấp thụ gần 30-40% bức xạ tới, vì thế làm giảm năng lượng ánh sáng

đi vào bộ phận phát hiện quang

Tuy nhiên, các bộ kính lọc này lại thích hợp với hầu hết các ứng dụng thông thường đểđảm bảo tất cả các bước sóng nằm trong dải quang phổ nhìn thấy được, có thể ghép nhiềukính lọc Gelatin khác nhau

Được dùng trong máy xét nghiệm để đựng mẫu khi đo, vì vậy cuvét phải được làm vớicác đặc tính

- Cho qua tất cả các bước sóng dùng trong xét nghiệm

- Có bề mặt quang học đảm bảo song song và phẳng tuyệt đối để tránh sự phản xạcủa ánh sáng chiếu tới

- Phải có độ bền hóa học, không bị các hóa chất làm hỏng

Trong thực tế có nhiều loại cuvet phụ thuộc vào chất liệu chế tạo cuvet thường được làm

từ thạch anh, thủy tinh hoặc nhựa trong, có chiều dày quang học chuẩn là 1cm để đảmbảo các tính chất trên

Đ ị n h

l u ậ t

đ o

m à u

Phương pháp đo màu là một trong những phương pháp phân tích thành phần dung dịchdựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ của dungdịch chuẩn ( dung dịch có nồng độ đã biết trước)

Người ta dùng phương pháp đo màu chủ yếu là để xác định lượng nhỏ của các chất cótrong dung dịch Phân tích bằng phương pháp đo màu tốn ít thời gian hơn so với phươngpháp khác, nó cho kết quả chính xác mà không cần phải tách riêng các chất cần xác định

ra khỏi thành phần dung dịch Phương pháp đo màu được thực hiện bằng hai cách cơ bản:

- Phương pháp đo màu chủ quan (Quan sát bằng mắt)

- Phương pháp đo màu khách quan ( Đo màu quang điện)

Phương pháp đo màu chủ quan hiện nay không còn được dùng do tính chính xác chỉmang tính tương đối, phụ thuộc vào người quan sát Phương pháp đo màu quang điện chokết quả chính xác, khách quan nên được ứng dụng phổ biến trong xét nghiệm

a) Sự hấp thu ánh sáng của dung dịch

Nếu rọi một chùm sáng có cường độ I0 vào một cuvet đựng một dung dịch nào đó thì mộtphần Ir bị phản xạ trên bề mặt của cuvet, một phần khác Ia bị dung dịch hấp thụ, phần cònlại It đi qua cuvet ngoài, giữa các đại lượng cường độ ánh sáng này có các hệ thức sau

I0 = Ir + Ia + It

Trên thực tế, trong một loại phân tích ta chỉ sử dụng một loại cuvet nên cường độ ánhsáng phản xạ Ir là không đổi mặt khác bề mặt cuvet được làm rất phẳng và ánh sangchiếu vào được tập trung gần như vuông góc với bề mặt cuvet nên Ir là rất nhỏ Vì vậy cóthể bỏ qua thành phần phản xạ ta có hệ thức đơn giản như sau:

I0 = Ia + It

Bằng cách đo cường độ ánh sang tới I0 và cường độ ánh sang ra khỏi cuvet It , ta có thểtìm được cường độ ánh sáng bị hấp thụ Ia

b) Định luật Bouguer – Lambert

Giả sử có một lớp môi trường có bề dày x được một chum sang đơn sắc chiếu tới màcường độ sáng trước khi vào môi trường là I0, sau khi đi qua môi trường cường độ sáng là

Ix trường hợp này yếu tố phản xạ và khúc xạ coi như là rất nhỏ có thể bỏ qua

là hệ số hấp thụ của môi trường, phụ thuộc vào bản chất, mật độ môi trường và vào bướcsong của ánh sáng chiếu tới

c) Định luật Bouguer – Lambert – Beer

Beer thiết lập được mối quan hệ giữa hệ số tắt K với nồng độ của chất hấp thụ ánh sangnhư sau

C nồng độ chất tan trong dung dịch: hệ số không phụ thuộc vào nồng độĐịnh luật Bouguer – Lambert khảo sát sự thay đổi độ hấp thụ ánh sang với dung dịch cónồng độ xác định khi thay đổi chiều dày của lớp dung dịch hấp thụ, còn định luật Beer lạikhảo sát sự thay đổi độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch với sự thay đổi nồng độ của lớpdung dịch có chiều dày không đổi kết hợp hai định luật này lại ta có định luật Bouguer –Lambert – Beer

“ Độ hấp thụ cường độ ánh sáng của một lớp dung dịch phụ thuộc vào bản chất, nồng độ

và bề dày của lớp dung dịch có ánh sáng rọi qua”

Định luật được biểu diễn bằng phương trình:

C là nồng độ chất tan

L chiều dày lớp dung dịch

hệ số tắt không đổi, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan

và bước sóng của ánh sáng rọi vào dung dịchTrong xét nghiệm chúng ta thường sử dụng một số thông số gián tiếp từ định luậtBouguer – Lambert – Beer

Tỷ số giữa cường dộ chum sang sau khi qua dung dịch Ix với cường độ chùm sáng chiếutới Io được gọi độ truyền qua, ký hiệu là T

Nếu đặt sau cuvet thứ nhất một cuvet thứ hai giống cuvet thứ nhất và cũng chứa dungdịch có nồng độ như vậy, cường độ ánh sáng I2 sau khi đi qua cuvet thứ hai là:

Như vậy, ánh sáng truền qua các cuvet đặt liên tiếp nhau giảm theo cấp số nhân Với lý

do này có thể biểu diễn độ truyền như một phép đo logarit Phép đo này là độ hấp thụ A

hay gọi là mật độ quang D hay O.D (Optical Density):

Trên thực tế, trong các máy xét nghiệm , người ta không thể tính toán trực tiếp trên tínhiệu quang mà phải tính trên tín hiệu điện, vì vậy cần phải có những linh kiện chuyển đổicác tín hiệu quang thành tín hiệu điện và dòng điện do linh kiện này tạo ra phải tỷ lệ vớicường độ ánh sáng chiếu tới các linh kiện này gọi là linh kiện quang điện, hiện tượngbiến đổi quang thành điện gọi là hiện tượng quang điện

Ngày nay người ta dùng các máy phân tích sinh hóa để có được định lượng các chất cầnphân tích một cách chính xác và đơn giản dựa vào sự xuất hiện các chất dị thường, tănggiảm của các chất thông thường người ta có thể chẩn đoán nhiều bệnh liên quan đến các

cơ quan trong cơ thể con người

1) M ộ t

s ố

t h ô n g

s ố

t r o n g

m á y

x é t

n g h i ệ m

s i n h

h ó a

Khi làm xét nghiệm cần chú ý các kết quả xét nghiệm chỉ là khách quan, cần phân tíchbiện chứng các kết quả, tránh ỷ lại vào máy, nhìn kết quả phiến diện mà dẫn đến kết luậnkhông chính xác Mỗi thông số đo được phản ánh nhiều kết quả bệnh lý khác nhau, cụthể:

Creatinine(CRE),Protein toàn phần (PRO), Ure, cholesterol(CHO), gluco (GLU),Bilirubil, Amylase, Creatininkinase (CK), Lactat dehydrogenase (LDH), phosphate,Tranramin,Triglycerides (PAP), axit uric(AU)…

2) C ơ

s ở

h ó a

s i n h

d ù n g

t r o n g

m á y

s i n h h

ó a

Để làm việc với một loại chất cần nghiên cứu trong dung dịch xét nghiệm, người ta sửdụng phương pháp đánh dấu màu Người ta sử dụng chất đó cho tác dụng với một chấthay một số chất nào đó, trong quá trình phản ứng,chất đó sẽ tạo ra một sản phẩm hấp thụánh sáng ở một bước sóng nào đó mạnh nhất sự hấp thụ mạnh hay yếu sẽ tỷ lệ với nồng

độ của chất đó trong dung dịch Từ đó ta có thể tính toán dễ dàng để có được các thông

số mong muốn

1) N g u y ê n

l ý

c á c

p h é p

đ o

q u a n g

t r o n g x é

n g h i ê m

h ó a

s i n h

Các máy xét nghiệm sinh hoá từ đơn giản đến hiện đại đều dựa trên nguyên tắc là phươngpháp đo màu Dung dịch cần đo được đưa vào cuvét Một nguồn sáng có ánh sáng trắng

đi qua bộ lọc để thu được một bước sóng phù hợp với dung dịch cần đo, Bộ phát hiệnquang thu cường độ ánh sáng đi qua cuvét chứa dung dịch cần đo chuyển thành tín hiệuđiện, từ tín hiệu điện này máy có thể tính toán và hiển thị kết quả

2) S ơ

đ ồ

n g u y ê n

l ý

c ủ a

m á y

x é t

n g h i ệ m s

i n h

h o á

Nguồn sáng

Nguồn sáng có nhiệm vụ phát ra ánh sáng trắng có cường độ đủ mạnh Lý do dùngnguồn sáng trắng ở đây như phần cơ sở hoá sinh ta đã biết, chính là do mỗi một xétnghiệm khi phản ứng sẽ cho một màu đặc trưng của xét nghiệm đó, và nó sẽ hấp thụmạnh nhất một dải bước sóng tương ứng, vì vậy khi đo sự hấp thụ ta chỉ dùng một bướcsóng cơ bản Với nhiều xét nghiệm ta sẽ dùng nhiều bước sóng khác nhau và nguồn sángtrắng sẽ cấp đầy đủ các bước sóng này cho tất cả các xét nghiệm

Trong thực tế người ta có thể dễ dàng tạo ra nguồn sáng trắng Hình 2 minh họa đầu racủa một đèn tungsten Chúng ta thấy rằng năng lượng giảm về phía tia cực tím gần nhưng

nó vẫn đủ mạnh để cấp năng lượng cho bộ phát hiện quang ở bước sóng gần 350nm Đểtăng cường độ ánh sáng đến dải vùng cực tím, người ta sử dụng một đèn halogentungsten Đèn này gồm một dây tóc tungsten đặt trong vỏ thạch anh chứa halogen như iốt

là các cách tử, kính lọc, lăng kính kết hợp với các thấu kính để thu được một dải rất hẹpbước sóng: 340nm, 405nm, 505nm, 546nm, 570nm, 600nm, 650nm, 700nm…

Bộ phát hiện quang

Bộ phát hiện quang có chức năng là biến đổi tín hiệu quang thu được khi ánh sáng đi quacuvét thành tín hiệu điện Bộ phát hiện quang là một trong các linh kiện quang- điện đãxét ở phần trước, trên thực tế hiện nay thường dùng là photo điốt hay photo tranzito dokích thước nhỏ, thích hợp cho các máy xách tay hoặc những máy có cấu trúc nhỏ Đồngthời lại có độ nhạy cao hơn các linh kiện khác

Hiển thị

Kết quả đo sẽ được hiển thị trên khối hiển thị Tuỳ từng loại máy mà có các cách hiển thịkết quả khác nhau, có thể chỉ đơn giản là hiển thị dưới dạng số trên led 7 thanh, hiển thịtrên màn hình CRT hoặc là hiển thị trên màn hình tinh thể lỏng (LCD) Từ đó, kết quảhiển thị có thể ở mức đơn giản là cường độ dòng điện thu được, hoặc được tính toán đểhiển thị chi tiết đến độ hấp thụ, nồng độ chất, tên bệnh nhân, số thứ tự, ngày tháng xétnghiệm…

3) C á c

p h ư ơ n g

p h á p

đ o

t r o n g

x é t

s i n h

h o á a) Phương pháp điểm cuối (Endpoint)

Phương pháp này chỉ đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng một lần, đó là lúc phản ứngtạo màu đã xảy ra hoàn toàn, và nồng độ các chất trong dung dịch sau phản ứng đã ổnđịnh Có thể đo độ hấp thụ ở một bước sóng (monochromatic) hoặc hai bước sóng(bichromatic) Sử dụng dung dịch chuẩn (Standard) để dựng đường chuẩn hay hệ số càiđặt trước

Chia theo số dung dịch chuẩn sử dụng khi đo ta có 3 loại:

– Phép đo chỉ sử dụng một dung dịch chuẩn: nồng độ của mẫu cũng được tính theo công

thức:

– Phép đo sử dụng nhiều dung dịch chuẩn (multistandard): nồng độ của mẫu được xác

định từ đường cong chuẩn Đường cong này dựng được từ các dung dịch chuẩn đã biếttrước nồng độ và độ hấp thụ đo được:

(Astandard– Ablank).TR

TR là chiều của phản ứng : +1 nếu chiều phản ứng tăng

-1 nếu chiều phản ứng giảm

Nồng độ của mẫu được nội suy từ đường cong chuẩn: (Asample– Ablank).TR

– Phép đo sử dụng hệ số:

Khi đo không sử dụng các dung dịch chuẩn mà sử dụng một hệ số cho trước để tính ranồng độ của dung dịch Nồng độ mẫu được tính theo công thức:

Csample = (Asample– Ablank).F

Với F là hệ số cho trước

Chia theo số bước sóng sử dụng khi đo ta có 2 loại:

– Phép đo một bước sóng: đo độ hấp thụ của dung dịch Trắng, Chuẩn và Mẫu tại một

bước sóng

– Phép đo hai bước sóng: đo độ hấp thụ của Trắng (Blank), Chuẩn và mẫu (Sample) tại

hai bước sóng, một bước sóng chính và một bước sóng phụ, độ hấp thụ của các dung dịchđược tính theo công thức sau:

Asample, Astandard, Ablank=Almain– Alref

– Phương pháp đo động học (K):

Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo n lần trong thời gian phản ứng t (Reactiontime), khoảng cách giữa n lần đo là t/n giây và tính giá trị chênh lệch của các độ hấp thụgiữa phép đo sau với phép đo trước, kết quả cuối cùng là tính được giá trị chênh lệchtrung bình/phút (DA/min)

Độ hoạt động của enzym được tính theo công thức:

Độ hoạt động của Enzym =DA/min.K.