Sinh Phôi Thể Hệ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP• Đối với việc kích thích sự sinh phôi soma, các mẫu cấy là các đỉnh chồi chứa 3 lá sơ khởi phân lập từ cây trưởng thành in vitro và từ các cành nhân giống.. Khảo

SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA Ở CÁC KIỂU GENE KHOAI MÌ

VÙNG ĐÔNG BẮC BRAZIL

NỘI DUNG

1 GIỚI THIỆU

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4 KẾT LUẬN

1 GIỚI THIỆU

• Khoai mì (Manihot esculenta), hay còn gọi là sắn, là một nguồn thực

phẩm thông dụng khắp các vùng nhiệt đới trải dài từ Châu Phi, Châu

Á đến châu Mỹ.

• Phương pháp phát sinh phôi soma và phát sinh cơ quan ở cây khoai

mì ở vùng Đông Bắc Brazil vẫn còn chưa phát triển.

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Các loại khoai mì trong nghiên cứu này: Água Morna, Amansa Burro, Aparecida, Mata Fome, Milagrosa, Rosa, Rosinha và

Sacai

• Các mẫu cấy sử dụng là các đỉnh chồi phân lập từ các cây

trưởng thành in vitro và từ các chồi mọc từ các cành cây nhân giống (stem cuttings) Sự phát sinh phôi soma đạt được tần số cao khi thêm vào môi trường chất kích thích auxin picloram ở khoảng rộng các nồng độ Các tử diệp (lá mầm) của phôi soma

sơ cấp được sử dụng làm các mảnh cấy cho sự hình thành phôi soma thứ cấp trong một môi trường kích thích bổ sung picloram

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Nhân giống in vitro sử dụng các đoạn cây giống tươi dài 20-30cm với 5-8 lóng được lấy từ các cây trưởng thành Các cành này được gieo vào khay plastic (50 x 30 x 8 cm), đổ đầy khoáng và tưới với môi trường ½ muối

MS, giữ trong điều kiện nhà kính Khi các chồi mới mọc cao 2 cm, chúng được cắt từ cây mẹ, đưa vào phòng thí nghiệm, khử trùng bằng cách ngâm vào 1.5% sodium hypochlorite, 0.01% dung dịch Triton X-100 trong 5 phút Các đỉnh chồi chứa 3 lá sơ khởi được tách vô trùng và chuyển vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MS rắn bổ sung BA 0,1mg/L Các ống nghiệm chứa mảnh cấy được ủ ở 26±2 ºC trong một một tủ tăng

trưởng cài đặt chương trình cho chu kỳ sáng – tối 16/8 giờ, dùng đèn

huỳnh quang trắng (25,3 µmol m-2 s-1) Việc nuôi cấy duy trì bằng cách cấy chuyền hàng tháng các mảnh cấy trong cùng điều kiện môi trường

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Đối với việc kích thích sự sinh phôi soma, các mẫu cấy là các đỉnh chồi chứa 3 lá sơ khởi phân lập từ cây trưởng thành in vitro và từ các cành nhân giống Các mảnh cấy được chuyển dưới điều kiện vô trùng vào đĩa petri chứa 25 ml môi trường

MS rắn bổ sung 2% sucrose, 0.5 mg/L đồng sulphate và

picloram nồng độ 1, 3, 6, 9 12 hay 15 mg/L tạo rắn nhờ 0.6% agar Sau 3 tuần ủ trong tối 26±2 °C, ghi nhận sự hiện diện của phôi soma

• Phương pháp mô tả bởi Zhang et al (2001) sử dụng cho giai đoạn trưởng thành của phôi soma Cụm gần 10 phôi được chuyển vào đĩa Petri chứa 25 ml môi trường muối MS và

vitamin, 2% sucrose, 0.5 mgL-1 đồng sulphate và 0.1 mgL-1

BA, pH 5.8, tạo rắn nhờ 0.6% agar, ủ từ 3 đến 4 tuần ở 26 ± 2ºC dưới chu kỳ sáng là 16h

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Các lá mầm xanh từ các phôi trưởng thành 2-3 tuần được sử dụng làm nguồn mẫu cấy kích

thích sinh phôi soma thứ cấp Lá mầm được cắt

ra thành các mảnh 4 mm2 và chuyển vào đĩa

petri chứa 25 mL môi trường MS rắn bổ sung

2% sucrose, 0.5 mgL-1 đồng sulphate và

picloram nồng độ 1, 3, 6, 9 12 hay 15 mgL-1, tạo rắn nhờ 0.6% agar Sau 3 tuần ủ trong điều kiện tối ở 28 ± 2 °C, kết quả được đánh giá theo sự hiện diện của phôi soma.

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Khảo sát sự ảnh hưởng của picloram lên sự kích thích sinh phôi soma

từ các đỉnh chồi phân lập từ cây in vitro trưởng thành trên 2 loại khoai mì là Água Morna và Rosinha

 Quan sát mẫu cấy sau 10 ngày ta thấy mô sẹo có khả năng sinh phôi

phân chia phát triển thành phôi ở giai đoạn hình cầu Từ ngày 14 cho đến ngày 21 của quá trình ủ, phôi soma ở giai đoạn thuần thục có

hình cá đuối và 2 lá mầm được nhìn thấy (Hình 1)

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

• B ng 1 - nh h ả Ả ưở ng c a n ng đ picloram lên s kích thích ủ ồ ộ ự

thành (Manihot esculenta Crantz) cvs Água Morn và Rosinha

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 Kết quả Bảng 1 cho thấy picloram có khả năng kích thích sinh phôi soma cao đồng thời cũng cho số lượng lớn các phôi soma trên một mẫu cấy.

 Đối với kiểu gen Água Morna, nồng độ picloram 1mg/L cho tần số phát sinh phôi soma cũng như số lượng các phôi trên mỗi mẫu cấy là thấp hơn rất nhiều so với nồng độ 12 hay 15 mg/L, nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ khác Đối với kiểu gen Rosinha, tần số phát sinh phôi soma cũng như số lượng các phôi trên mỗi mẫu cấy ở nồng độ picloram 1 và 3 mg/L thấp hơn so với các

nồng độ còn lại, không có sự khác biệt quan trọng thống kê nào được tìm thấy.

 Ngoài ra, Água Morna cho đáp ứng tốt hơn Rosinha cả trong tần số phát sinh phôi soma cũng như số lượng phôi trên mỗi mẫu cấy.

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

• 2 Khảo sát sự kích thích sinh phôi soma thứ cấp từ các đỉnh chồi

phân lập từ chồi mọc trên cành nhân giống ở 8 loại khoai mì nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung nồng độ picloram 4mg/L.

• B ng 2: S kích thích sinh phôi th c p t đ nh ch i phân l p t ả ự ứ ấ ừ ỉ ồ ậ ừ

cành nhân gi ng trong khoai mì ố (Manihot esculenta Crantz)

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 Kết quả Bảng 2 cho thấy phôi soma được kích thích trong tất cả các kiểu gen thử nghiệm Cả 2 kiểu gen Água Morna và Rosinha đều cho tần số phát sinh phôi soma cũng như số lượng phôi soma trên mỗi mẫu cấy thu được từ chồi đỉnh cây in vitro trưởng thành gần như không khác gì so với thu được từ các chồi mọc từ cành nhân giống (Bảng 1 và Bảng 2)

 Theo Chakrabarty et al., 2003; Fehér et al., 2003, không nên sử dụng cây trưởng thành in vitro là mẫu cấy cho kích thích sinh phôi soma vì thao tác lâu ngày có thể làm sản

sinh đột biến do các hoạt động của gen nhảy Vì vậy, sử dụng đỉnh chồi phân lập từ các chồi mọc trên cành nhân giống là nguồn thích hợp cho mẫu cấy cho kích thích sinh

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

• 3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ picloram lên sự kích thích sinh phôi

soma thứ cấp từ lá mầm của phôi soma sơ cấp

• Sử dụng lá mầm của phôi soma sơ cấp làm mẫu cấy giúp tiết kiệm

thời gian nhằm cung cấp đều đặn mẫu cấy cho quá trình kích thích sinh phôi soma

• B ng 3 ả - nh h ng c a n ng đ picloram lên s kích thích sinh Ả ưở ủ ồ ộ ự

phôi soma thứ cấp từ lá mầm của phôi soma sơ cấp cây khoai mì

(Manihot esculenta Crantz)

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 Kết quả trình bày trong Bảng 3 cho thấy nồng độ picloram không ảnh hưởng mạnh lên tần số phát sinh phôi soma và số lượng phôi trên mỗi mẫu cấy

 So sánh Bảng 1 và Bảng 3, sự kích thích phát sinh phôi soma dù phân lập từ đỉnh chồi hay từ các mảnh của lá mầm phôi soma sơ cấp đều

không có sự khác biệt lớn

 Từ mỗi lá mầm có ít nhất 4 mẫu cấy cho kích thích phát sinh phôi soma, tốt hơn phân lập từ đỉnh chồi, đặc biệt là thu được số lượng lớn các phôi soma

 Do đó, lá mầm của phôi soma sơ cấp là mục tiêu tuyệt vời cho thí

nghiệm chuyển gen vì nó không những có khả năng sinh phôi soma cao mà còn cho lượng lớn phôi oma trên một mẫu cấy

4 KẾT LUẬN

 Sau 10 ngày, mô sẹo có khả năng sinh phôi phân chia phát triển thành phôi ở giai đoạn hình cầu Từ ngày 14 cho đến ngày 21 của quá trình ủ, phôi soma ở giai đoạn thuần thục có hình cá đuối và 2 lá mầm.

 Số lượng phôi soma trên mỗi mẫu cấy thu được từ chồi đỉnh cây in vitro trưởng thành gần như không khác gì so với thu được từ các chồi mọc từ cành nhân giống nhưng thao tác lâu ngày có thể làm sản sinh đột biến do các hoạt động của gen nhảy Vì vậy, sử dụng đỉnh chồi phân lập từ các chồi mọc trên cành nhân giống là nguồn thích hợp cho mẫu cấy cho kích thích sinh phôi soma.

4 KẾT LUẬN

 Nồng độ picloram không ảnh hưởng mạnh lên tần số phát sinh phôi soma và số lượng phôi trên mỗi mẫu cấy.

 Sự kích thích phát sinh phôi soma dù phân lập từ

đỉnh chồi hay từ các mảnh của lá mầm phôi soma

sơ cấp đều không có sự khác biệt lớn

 Lá mầm của phôi soma sơ cấp là mục tiêu tuyệt vời cho thí nghiệm chuyển gen vì nó không những có khả năng sinh phôi soma cao mà còn cho lượng lớn phôi Soma trên một mẫu cấy.