Phân tích các biến đổi hình thái học và sinh lý học trong các quá trình phát sinh cơ quan và phôi thể hệ ở một số giống chuối (Musa sp.)

Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự hình thành và phát triển chồi từ khúc cắt chồi cây in vitro chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy... Hàm lượng các chất điều hòa

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS BÙI TRANG VIỆT

2 GS.TS FENG TENG-YUNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

MỤC LỤC

Trang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây chuối 3

1.2 Các nghiên cứu nhằm cải tiến giống chuối trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.2.1 Sự nuôi cấy chồi và mô phân sinh ngọn chồi 5

1.2.2 Sự thu nhận phôi soma 6

1.3 Phát sinh hình thái thực vật, phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử 8

1.3.1 Phát sinh hình thái thực vật 8

1.3.2 Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi 8

1.3.3 Mô phân sinh ngọn rễ và sự phát triển rễ 11

1.3.4 Sự phát triển phôi hợp tử 13

1.4 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử 14

1.4.1 Auxin 15

1.4.2 Cytokinin 18

1.4.3 Gibberellin và acid abscisic 19

1.5 Cơ sở phân tử của sự phát sinh hình thái 20

1.6 Sự phát sinh hình thái in vitro và các ứng dụng của vi nhân giống 23

1.6.1 Sự phát sinh cơ quan 23

1.6.2 Sự phát sinh phôi soma 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU 31

2.1.1 Vật liệu nuôi cấy 31

2.1.2 Vật liệu được dùng trong các sinh trắc nghiệm 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP 34

2.2.1 Quan sát các biến đổi hình thái học, giải phẫu học 34

2.2.2 Đo cường độ hô hấp 35

2.2.3 Đo hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 35

2.2.4 Nuôi cấy khúc cắt chồi và khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi 39

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát triển chồi 40

2.2.6 Áp dụng phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và sự hủy mô phân sinh ngọn chồi 40

2.2.7 Áp dụng phương pháp nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi trong vi nhân giống 41

2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt chồi 41

2.2.9 Tạo mô sẹo và dịch treo tế bào 42

2.2.10 Tạo phôi soma từ dịch treo tế bào 44

2.2.11 Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển phôi 47

2.2.12 Sự chuyển cây ra vườn ươm 48

2.2.13 Thử dùng dịch treo tế bào để cô lập, dung hợp và nuôi cấy tế bào trần 48

2.2.14 Xử lý thống kê kết quả thu được 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT QUẢ 51

3.1 Sự hình thành và phát triển chồi 51

3.1.1 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển chồi 51

3.1.2 Mối liên hệ giữa kiểu gen, kích thước mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi 62

3.1.3 Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát triển chồi 65

3.1.4 Sự thay đổi cường độ hô hấp của chồi 68

3.1.5 Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển chồi 70

3.1.6 Áp dụng phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và sự hủy mô phân sinh ngọn trong sự phát triển chồi 73

3.1.7 Áp dụng phương pháp nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi trong vi nhân giống 77

3.2 Sự hình thành rễ bất định từ các khúc cắt chồi 79

3.2.1 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển rễ bất định 79

3.2.2 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển rễ bất định 86

3.3 Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào 86

3.3.1 Sự hình thành mô sẹo từ hoa đực non 86

3.3.2 Sự hình thành dịch treo tế bào từ mô sẹo có nguồn gốc hoa đực non 86

3.3.3 Sự hình thành dịch treo tế bào từ cụm chồi tăng sinh cao 86

3.3.4 Ảnh hưởng của pH và sự loại 2,4-D trên sự hình thành tế bào có khả năng sinh phôi 93

3.4 Sự sinh phôi soma ở chuối 96

3.4.1 Các thay đổi hình thái trong quá trình phát triển phôi 96

3.4.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu trên sự phát sinh phôi 104

3.4.3 Ảnh hưởng của pH và sự loại các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong các môi trường Ma2, Ma3 trong sự phát sinh phôi 105

3.4.4 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trên sự sinh phôi 105

3.4.5 Số lần cấy chuyền dịch treo tế bào và khả năng phát sinh phôi 109

3.4.6 Ảnh hưởng của acid abscisic trong sự trưởng thành của phôi 109

3.4.7 Ảnh hưởng của TIBA trong sự hình thành và phát triển phôi 111

3.4.8 Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển phôi 115

3.4.9 Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển phôi 116

3.5 Sự chuyển cây ra vườn ươm 123

3.6 Sự cô lập, dung hợp và nuôi cấy tế bào trần 126

THẢO LUẬN 131

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 152

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 154

TÀI LIỆU THAM KHẢO 156 PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHP : Cultures Hautement Proliférante TLT : Trọng lượng tươi

IAA : indol acetic acid

IBA : indol butyric acid

NAA : 1-naphtalene acetic acid

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid TIBA : 2,3,5-triiodobenzoic acid

TDZ : Thiadiazuron

BA : 6-Benzylaminopurine

KIN : kinetin

2-iP : 6-dimethylallylaminopurin

ABA : abscisic acid

GA3 : gibberellic acid

Fe-EDTA : Ferric Ethylen Diamintetraacetat PEG : Polyethylene glycol

TTC : 2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride SCV : Settled cell volume

SAM : Shoot apical meristem

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Kích thước của mô phân sinh ngọn chồi cây trong vườn thuộc một số

giống trồng có kiểu gene khác nhau, ở giai đoạn 1 tháng tuổi 62

Bảng 2 Kích thước của mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro 6 tuần tuổi, thuộc

một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, tăng trưởng từ khúc cắt chồi trên môi trường MS 63 Bảng 3 Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây trong vườn,

thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l 64

Bảng 4 Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro,

thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l 64 Bảng 5 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự hình thành

và phát triển chồi từ khúc cắt chồi cây in vitro chuối Cau Mẵn sau 4

tuần nuôi cấy 66 Bảng 6 Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin trong sự tăng sinh chồi

từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro, thuộc một số giống

trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy 67 Bảng 7 Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin trên sự phát triển chiều

cao chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro, thuộc một

số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy 67 Bảng 8 Cường độ hô hấp của khúc cắt chồi từ cây trong vườn một tháng tuổi,

thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau 68

Bảng 9 Cường độ hô hấp của khúc cắt chồi từ cây in vitro 6 tuần tuổi tăng trưởng

trên môi trường MS, thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau 68

Bảng 10 Cường độ hô hấp của mẫu cấy phát triển từ khúc cắt mô phân sinh ngọn

chồi cây in vitro, thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau

4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 69 Bảng 11 Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do (đo bằng

phương pháp sinh trắc nghiệm) trong khúc cắt chồi cây trong vườn một

tháng tuổi, thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau 71 Bảng 12 Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do (đo

bằng phương pháp sinh trắc nghiệm) trong khúc cắt chồi cây in vitro 6

tuần tuổi tăng trưởng trên môi trường MS, thuộc một số giống trồng

có kiểu gene khác nhau 71 Bảng 13 Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do trong

mẫu cấy phát triển từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l (đo bằngphương pháp sinh trắc nghiệm) 72 Bảng 14 Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng liên kết trong

mẫu cấy phát triển từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và

zeatin 1 mg/l (đo bằng phương pháp sinh trắc nghiệm) 72

Bảng 15 Hàm lượng IAA và zeatin tổng cộng trong mẫu cấy phát triển từ khúc

cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l (đo bằng phương pháp HPLC) 73 Bảng 16 Sự phát sinh chồi từ các mẫu cấy chịu các kiểu tác động lên mô phân

sinh ngọn chồi khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP*

có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 74

Bảng 17 Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi của một số

giống chuối sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1mg/l 77 Bảng 18: Ảnh hưởng của auxin trong sự hình thành sơ khởi rễ (quan sát dưới

kính hiển vi) từ khúc cắt chồi sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường MSK với IAA, NAA hay 2,4-D ở các nồng độ khác nhau 83 Bảng 19 Vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái rễ từ khúc cắt chồi

chuối Cau Mẵn sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MSK với IAA, NAA hay 2,4-D ở các nồng độ khác nhau 85 Bảng 20 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu trên sự phát sinh phôi của dịch

treo tế bào có nguồn gốc mô sẹo chuối Cau Mẵn sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường đặc Ma* với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và NAA 0,2 mg/l, ở pH 5,3 104 Bảng 21 Số phôi được tạo từ dịch treo tế bào có nguồn gốc mô sẹo chuối Cau

Mẵn trên các môi trường có pH khác nhau, trong mỗi hộp Petri với 0,5

ml dịch treo tế bào ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy 105 Bảng 22 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trong sự phát sinh phôi

(giai đoạn hình cầu) từ dịch treo tế bào có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn sau 28 ngày nuôi cấy 106 Bảng 23 Mối liên hệ giữa số lần cấy chuyền dịch treo tế bào và khả năng phát

sinh phôi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma* có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 109 Bảng 24 Vai trò của TIBA trong sự phát sinh phôi sau 21 ngày nuôi cấy tế bào

dịch treo chuối Cau Mẵn ở các thời điểm phát triển phôi khác nhau trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và TIBA ở các nồng độ thay đổi 111

Bảng 25 Tác động của TIBA trên phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát

triển khác nhau sau 42 ngày nuôi cấy trên môi trường MS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l 113 Bảng 26 Sự thay đổi hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật tổng cộng

trong quá trình hình thành và phát triển phôi soma từ tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao (đo bằng phương pháp HPLC) 116 Bảng 27 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trên sự phát triển phôi

sau 42 ngày nuôi cấy các phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát triển khác nhau 118

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ một cây chuối trưởng thành 4

Hình 1.2 Sự phân vùng chức năng của mô phân sinh ngọn chồi 10

Hình 1.3 Mối liên hệ giữa sự di chuyển của auxin và sự phát triển phôi 17

Hình 1.4 Mối liên hệ tương tác giữa WUS và CLV trong sự duy trì các tế bào gốc 23

Hình 2.1 Cây chuối Sứ 1 tháng tuổi được trồng trong vườn tại Tiền Giang 32

Hình 2.2 Các cây chuối in vitro 6 tuần tuổi tăng trưởng trên môi trường MS 32

Hình 2.3 Chồi đực (bắp chuối) của chuối Cau mẵn và chuối Hột 33

Hình 2.4 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 38

Hình 3.1 Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn qua lát cắt dọc sau 6 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l 53

Hình 3.2 Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Hột qua lát cắt dọc sau 6 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l 53

Hình 3.3 Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn qua lát cắt dọc sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 54

Hình 3.4 Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Hột qua lát cắt dọc sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 54

Hình 3.5 Chi tiết vùng trung tâm của mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 55

Hình 3.6 Chi tiết vùng ngoại vi của mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn

sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in

vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5

mg/l và zeatin 1 mg/l 55

Hình 3.7 Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro

sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* với IAA 0,17 mg/l, BA

2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 56 Hình 3.8 Vùng trung tâm mô phân sinh ngọn chồi hình thành ở nách lá 57 Hình 3.9 Vùng trung tâm mô phân sinh ngọn chồi hình thành từ trục thân 57 Hình 3.10 Sơ khởi chồi hình thành từ trục thân chuối Hột sau 6 tuần nuôi cấy

khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi trường

CHP* có bổ sung với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l 57 Hình 3.11 Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn qua lát cắt dọc sau

4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi

trường CHP* (quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt) 58 Hình 3.12 Chi tiết tế bào lớp L1 và L2 của mô phân sinh ngọn chồi chuối

Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây

in vitro trên môi trường CHP* có hay không bổ sung chất điều hòa

tăng trưởng thực vật 59 Hình 3.13 Sự phân chia ngẫu nhiên của các tế bào lớp L2 ở vùng ngoại vi của

mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy khúc

cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi trường CHP* 60

Hình 3.14 Sự phân chia theo hướng song song của các tế bào lớp L2 ở vùng

ngoại vi của mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi

cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi trường

CHP* có bổ sung IAA 0,17mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1mg/l 60 Hình 3.15 Hoa đực non với cụm chồi hình thành ở phần gốc sau 6 tuần nuôi cấy 61 Hình 3.16 Chi tiết một chồi cụm từ hoa đực non sau 6 tuần nuôi cấy 61

Hình 3.17 Lát cắt dọc qua phần gốc cuống hoa với sự hình thành trung tâm

mô phân sinh ngọn chồi sau 3 tuần nuôi cấy 61 Hình 3.18 Lát cắt dọc qua phần gốc cuống hoa với sự hiện diện của nhiều

trung tâm mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi cấy 61 Hình 3.19 Lát cắt dọc qua các chồi hình thành từ mẫu cấy hoa đực non sau 5

tuần nuôi cấy 61 Hình 3.20 Chi tiết các chồi hình thành từ mẫu cấy hoa đực non sau 5 tuần

nuôi cấy 61 Hình 3.21 Sự phát sinh chồi từ các mẫu cấy chịu ảnh hưởng bởi các kiểu tác

động khác nhau lên mô phân sinh ngọn chồi sau 3 tuần nuôi cấy

trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và

zeatin 1 mg/l 75 Hình 3.22 Sự hình thành chồi mới ở mẫu cấy cắt bỏ một phần mô phân sinh

ngọn chồi sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung

IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 74 Hình 3.23 Sự phát sinh chồi ở lát cắt dọc ở giữa chồi sau 10 ngày nuôi cấy

trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và

zeatin 1 mg/l 76 Hình 3.24 Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần

nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5

mg/l và zeatin 1mg/l (hình chụp ở lần cấy chuyền thứ ba) (A), La

Ba; (B), Chà Bột; (C), Lửa; (D), Tá Quạ; (E), W1; (F) W2 78

Hình 3.25 Cấu trúc tổng quát của thân cây chuối Già Hương in vitro 4 tuần

tuổi có nguồn gốc từ sự nuôi cấy mô phân sinh ngọn trên môi

trường CHP* với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1mg/l qua

lát cắt ngang 80 Hình 3.26 Nguồn gốc nội sinh của rễ bất định từ thân cây chuối Già Hương

sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường MSK qua lát cắt ngang 80

Hình 3.27 Các giai đoạn của sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt chồi chuối

Già Hương tăng trưởng trên môi trường MSK 81 Hình 3.28 Rễ kéo dài trên môi trường đối chứng (MSK) 84 Hình 3.29 Sơ khởi rễ hình thành với mật độ cao trên cùng một lát cắt ở mẫu

cấy phát triển trên môi trường với NAA 0,4 mg/l 84 Hình 3.30 Sơ khởi rễ hình thành với mật độ cao trên cùng một lát cắt và có

sự gia tăng bề rộng ở vài sơ khởi rễ ở mẫu cấy phát triển trên môi

trường với 2,4-D 0,05 mg/l 84 Hình 3.31 Nhiều trung tâm mô phân sinh rễ hiện diện cùng với các tế bào

mô sẹo ở mẫu cấy phát triển trên môi trường với 2,4-D 0,2 mg/l 84 Hình 3.32 Mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau Mẵn sau 4 tháng nuôi cấy trên

môi trường MS với 2,4-D 4 mg/l, NAA 1 mg/l và IAA 1 mg/l 87 Hình 3.33 Mô sẹo từ hoa đực non chuối Hột sau 4 tháng nuôi cấy trên môi

trường MS với 2,4-D 4mg/l, NAA 1mg/l và IAA 1mg/l 87

Hình 3.34 Lát cắt dọc qua vùng chồi đực với sự hiện diện của các hoa đực

non (mẫu cấy ngày 0) 88 Hình 3.35 Lát cắt dọc qua phần gốc của một hoa đực non sau 15 ngày nuôi cấy

trên môi trường MS với 2,4-D 4 mg/l, NAA 1 mg/l và IAA 1 mg/l 85 Hình 3.36 Dịch treo tế bào 14 ngày tuổi, hình thành từ mô sẹo chuối Cau

Mẵn sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma*2 có bổ sung 2,4-D 1

mg/l và zeatin 0,5 mg/l 89 Hình 3.37 Dịch treo tế bào 14 ngày tuổi, hình thành từ mô sẹo chuối Hột sau

2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma*

2 có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và zeatin 0,5 mg/l 89 Hình 3.38 Đặc tính của tế bào có khả năng sinh phôi trong dịch treo tế bào

14 ngày tuổi có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau Mẵn

sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma*2 với 2,4-D 1 mg/l và

zeatin 0,5 mg/l 90

Hình 3.39 Tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình thành từ mô sẹo chuối Hột sau 2

tháng nuôi cấy trên môi trường Ma với 2,4-D 1mg/l và zeatin 0,5 mg/l 90 Hình 3.40 Dịch treo tế bào 14 ngày tuổi hình thành từ cụm chồi tăng sinh

cao chuối Cau Mẵn sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma* với

2,4-D 1,2 mg/l và zeatin 0,5 mg/l 91 Hình 3.41 Sự phân chia cân xứng của tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình

thành từ cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn sau 2 tháng nuôi

cấy trên môi trường Ma*2 với 2,4-D 1,2 mg/l và zeatin 0,5 mg/l 91 Hình 3.42 Lát cắt qua các tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình thành từ cụm

chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn trên môi trường Ma* với 2,4-D

1,2 mg/l và zeatin 0,5 mg/l (nhân to, tế bào chất đậm đặc) 92 Hình 3.43 Lát cắt qua các tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình thành từ cụm

chồi tăng sinh cao chuối Hột trên môi trường Ma*2 với 2,4-D 1,2

mg/l và zeatin 0,5 mg/l (nhân nhỏ hơn, không bào lớn) 92 Hình 3.44 Các tế bào có khả năng sinh phôi bên cạnh các tế bào không có

khả năng sinh phôi 94 Hình 3.45 Chi tiết tế bào không có khả năng sinh phôi với nhân nhỏ nhưng

hạt tinh bột và không bào lớn 94 Hình 3.46 Chi tiết tế bào có khả năng sinh phôi với nhân to, hạt tinh bột và

không bào nhỏ hơn 94 Hình 3.47 Chi tiết tế bào có khả năng sinh phôi đang trong giai đoạn phân

bào với hạt tinh bột rất nhỏ 94 Hình 3.48 Tế bào dịch treo có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau

Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma* có bổ sung 2,4-D

1 mg/l, pH 3 và mật độ tế bào ban đầu 7,5 m/l 95 Hình 3.49 Các nhóm tế bào dịch treo có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non

chuối Cau Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma* có bổ

sung 2,4-D 1 mg/l, pH 5,3 và mật độ tế bào ban đầu 7,5 m/l tế

bào lắng/ml dịch treo tế bào 95

Hình 3.50 Các nhóm tế bào dịch treo có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau Mẵn sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*2 lỏng không có 2,4-D, pH 5,3 và mật độ tế bào ban đầu 7,5 m/l tế bào lắng/ml dịch treo tế bào 95

Hình 3.51 Sự phân chia không cân xứng của tế bào dịch treo sau 4 ngày nuôi cấy 98

Hình 3.52 Phôi hình cầu hình thành sau 8 ngày nuôi cấy 98

Hình 3.53 Phôi hình cầu với dây treo hình thành sau 14 ngày nuôi cấy 98

Hình 3.54 Phôi ở các trạng thái khác nhau hình thành sau 42 ngày nuôi cấy 98

Hình 3.55 Sự thành lập phôi thứ cấp xung quanh phôi xuất hiện trước (ở trạng thái núi lửa) sau 42 ngày nuôi cấy 98

Hình 3.56 Chi tiết tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 99

Hình 3.57 Tế bào với nhân to và tròn, tế bào chất đậm đặc, và mật độ ti thể hình cầu cao 99

Hình 3.58 Vùng tế bào với sự hiện diện của ti thể và mạng nội chất 99

Hình 3.59 Vùng tế bào với sự hiện diện của hệ thống Golgi 99

Hình 3.60 Sự phân bào (A) và phân chia không cân xứng (B) của tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 100

Hình 3.61 Phôi hình cầu sớm hình thành từ tế bào dịch treo có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 100

Hình 3.62 Phôi hình cầu sớm hình thành từ tế bào dịch treo có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn 21 ngày trên môi trường Ma*3 100

Hình 3.63 Các phôi hình cầu với biểu bì hóa 101

Hình 3.64 Chi tiết một phôi hình cầu với biểu bì hóa 101

Hình 3.65 Phôi hợp tử chuối Hột 30 ngày tuổi 101

Hình 3.66 Quá trình hình thành mô phân sinh ngọn chồi của phôi phát triển từ tế bào dịch treo có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn trên môi trường Ma* có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 102

Hình 3.67 Phôi ở trạng thái tử diệp phát triển từ phôi hình núi lửa chuối Cau Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường MS½ 103

Hình 3.68 Sự phát sinh phôi sau 49 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh phôi trên môi trường Ma*3 107

Hình 3.69 Sự phát sinh phôi sau 49 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 107

Hình 3.70 Phôi hình núi lửa (quan sát dưới kính hiển vi quang học) 108

Hình 3.71 Phôi hình núi lửa (quan sát dưới kính hiển vi confocal) 108

Hình 3.72 Phôi hình chùy (quan sát dưới kính hiển vi confocal) 108

Hình 3.73 Phôi hình cầu muộn với lớp tế bào biểu bì phân chia quá mức (quan sát dưới kính hiển vi confocal) 108

Hình 3.74 Sự phát triển phôi từ các phôi hình cầu chuối Cau Mẵn sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 110

Hình 3.75 Sự phát triển phôi từ các phôi hình cầu chuối Cau Mẵn sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS với ABA 0,5 mg/l 110

Hình 3.76 Các nhóm tế bào ở thời điểm ngày 0 112

Hình 3.77 Các nhóm tế bào ở ngày 14 của quá trình phát sinh phôi 112

Hình 3.78 Các nhóm tế bào ở ngày 28 của quá trình phát sinh phôi 112

Hình 3.79 Sự phát triển phôi từ các phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát triển khác nhau trên môi trường MS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l 114

Hình 3.80 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokin trên sự phát triển

phôi từ phôi hình kim tự tháp chuối Cau Mẵn 119 Hình 3.81 Sự phát triển của cây mầm chuối Cau Mẵn từ phôi hình kim tự tháp

trên môi trường MS½ có bổ sung zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l 120 Hình 3.82 Cây mầm phát triển từ phôi hình núi lửa sau 4 tuần nuôi cấy 121 Hình 3.83 Cây mầm với sự hình thành cụm chồi phát triển từ phôi hình núi

lửa sau 8 tuần nuôi cấy 121 Hình 3.84 Cây mầm với phần gốc bị phù phát triển từ phôi hình cầu sau 5

tuần nuôi cấy 121 Hình 3.85 Cây mầm với tử diệp bất thường phát triển từ phôi hình cầu sau 5

tuần nuôi cấy 121 Hình 3.86 Phôi với sự hiện diện của mô phân sinh ngọn chồi và rễ sau 3 tuần

nuôi cấy 122 Hình 3.87 Phôi trưởng thành với sự hiện diện của các sơ khởi cơ quan (chồi,

rễ và hệ thống mạch) sau 4 tuần nuôi cấy 122 Hình 3.88 Cụm chồi phát triển từ phôi chuối Cau Mẵn bị cắt bỏ một phần

mô phân sinh ngọn chồi, sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½

có bổ sung BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l 124 Hình 3.89 Cụm chồi phát triển từ lát cắt dọc qua mô phân sinh ngọn chồi của

phôi chuối Cau Mẵn (phôi tế bào dịch treo), sau 3 tuần nuôi cấy

trên môi trường MS½ có bổ sung BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l 124 Hình 3.90 Các cây chuối Cau mẵn sau 6 tuần chuyển ra bầu đất và tăng

trưởng trong nhà lưới tại Bộ môn Sinh lý thực vật, trường Đại học

Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh 125 Hình 3.91 Các cây chuối La Ba sau 14 tuần chuyển ra bầu đất tăng trưởng

trong nhà lưới tại Bộ môn Sinh lý thực vật, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh 125 Hình 3.92 Sự phóng thích tế bào trần từ các nhóm tế bào dịch treo 127

Hình 3.93 Sự phóng thích tế bào trần từ lá cây in vitro 127

Hình 3.94 Tập hợp tế bào trần được cô lập từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn 127 Hình 3.95 Chi tiết một nhóm tế bào trần được cô lập từ dịch treo tế bào

chuối Cau Mẵn 127 Hình 3.96 Khả năng sống của tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi

trường PCM 127 Hình 3.97 Tế bào trần từ tế bào dịch treo sau 10 ngày nuôi cấy trên môi

trường PCM 127 Hình 3.98 Sự tăng trưởng của tế bào trần được cô lập từ dịch treo tế bào

chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy 128 Hình 3.99 Sự thành lập vách của tế bào trần sau 5 ngày nuôi cấy trên môi

trường N6PKM với 2,4-D 0,2 mg/l, NAA 1 mg/l và zeatin 0,5 mg/l 129 Hình 3.100 Tập hợp các tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường

PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn 129 Hình 3.101 Sự phân chia của tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi

trường PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn 129 Hình 3.102 Cụm tế bào hình thành từ tế bào trần sau 28 ngày nuôi cấy trên

môi trường PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn 129 Hình 3.103 Sự dung hợp của các tế bào trần dưới ảnh hưởng của PEG 130 Hình 3.104 Mô hình giải thích sự phát triển chồi từ mô phân sinh ngọn chồi

và sự phát triển rễ bất định từ chồi (SAM, mô phân sinh ngọn chồi;

PZ, vùng ngoại vi; RZ, vùng lõi) 139 Hình 3.105 Mô hình giải thích sự hình thành và phát triển phôi 151

MỞ ĐẦU

Chuối là cây ăn trái rất được ưa chuộng ở hầu hết các nước trên thế giới Ở một số vùng nhiệt đới ẩm (Châu Phi, Đông Á và một số vùng thuộc khu vực Đông Nam Á), chuối còn là nguồn cung cấp năng lượng chính Ngoài lượng carbohydrat phong phú, trái chuối giàu potassium, một chất dinh dưỡng khoáng cần cho hoạt động nhịp nhàng của tim, và chứa nhiều vitamin C, B6, đặc biệt là vitamin A, loại vitamin thường thiếu hụt trong bữa ăn của người dân vùng nhiệt đới [65], [116]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy trong trái chuối (Musa acuminata) có sự hiện diện

của Banlec, một protein đặc biệt thuộc nhóm lectin có khả năng làm chậm sự lây lan HIV (human immunodeficiency virus) bằng cách ngăn cản sự xâm nhập của virus này vào cơ thể [87], [126]

Với giá trị cao về mặt dinh dưỡng, cảm quan và dược liệu, chuối là thứ trái nhiệt đới quan trọng trên thị trường thế giới Tuy nhiên, việc sản xuất chuối bị đe dọa nghiêm trọng bởi các vấn đề về bệnh nhiễm như bệnh đốm lá do nấm

Mycosphaerella fijiensis, bệnh héo (héo Panama hay héo rũ) do Fusarium oxysporum, các bệnh do virus (banana bunchy top virus, banana streak virus) và

bệnh do giun tròn [53], [105], [150] Do đó, việc nghiên cứu vi nhân giống nhằm sản xuất cây giống ở qui mô công nghiệp với chất lượng cao (cây đồng nhất, sạch bệnh, năng suất cao và ổn định…) rất được quan tâm

Sự phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phôi soma (phát sinh phôi thể

hệ, somatic embryogenesis) là hai quá trình phát sinh hình thái thực vật (plant morphogenesis) có ý nghĩa quan trọng trong sinh học thực vật Các quá trình này chịu

sự tác động của nhiều yếu tố khác nhau, trong đó vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật là đặc biệt quan trọng Vì vậy, ngày nay sự sinh cơ quan và đặc biệt là

sự sinh phôi soma được các nhà sinh học thực vật hết sức quan tâm và nghiên cứu dưới các khía cạnh phát sinh hình thái và sinh lý học cũng như ở mức độ tế bào và phân tử, nhằm ứng dụng có hiệu quả trong sự vi nhân giống thực vật ở quy mô lớn

Đề tài “Phân tích các biến đổi hình thái học và sinh lý học trong các quá trình

phát sinh cơ quan và phôi soma ở một số giống chuối (Musa sp.)” được thực hiện

nhằm tìm hiểu cơ sở sinh lý học và phát sinh hình thái cho việc vi nhân giống một

số giống chuối trồng hay hoang dại ở các tỉnh phía nam Việt Nam, tập trung vào các vấn đề sau:

- Tạo các hệ thống tế bào để dùng trong vi nhân giống thực vật;

- Phân tích các quá trình phát sinh hình thái in vitro (chồi, rễ và phôi soma), đặc

biệt dưới khía cạnh hình thái học và sinh lý học;

- Tìm hiểu vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong các quá trình phát sinh cơ quan và phôi soma;

- Thu nhận cây in vitro của một số giống chuối trồng và hoang dại

Về mặt khoa học, luận án giải đáp một số vấn đề liên quan tới sự phát sinh hình thái ở cây chuối: các biến đổi hình thái học và sinh lý học của quá trình phát sinh cơ quan (chồi và rễ) và phôi soma ở chuối xảy ra như thế nào? ở vùng tế bào nào? chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố nào? Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò gì trong từng giai đoạn của các quá trình phát sinh hình thái này?

Về mặt thực tiễn, sự nuôi cấy khúc cắt chứa mô phân sinh ngọn chồi và thu nhận phôi soma giúp sự vi nhân giống chuối đạt hiệu quả cao, đặc biệt nhờ áp dụng phối hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật vào các bước phát sinh hình thái và sự

hủy mô phân sinh ngọn chồi bằng cách cắt cho phép thu nhận cây in vitro đồng nhất

với số lượng cao

Phần lớn đề tài được thực hiện tại Bộ môn Sinh lý thực vật, các quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử, các phân tích hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhờ HPLC được thực hiện tại trung tâm phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh; các quan sát dưới kính hiển vi confocal và kính hiển vi điện tử truyền suốt được thực hiện tại Viện Sinh học thực vật và vi sinh Sinica, Đài Loan, Trung Quốc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây chuối

Cây chuối có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới đông nam Châu Á, thuộc lớp Đơn

tử diệp (một lá mầm), bộ Zingiberales, họ Musaceae, giống Musa L., giống phụ Eumusa Đa số các giống trồng hiện nay do sự kết hợp giữa hai loài hoang dại Musa acuminata (AA) và Musa balbisiana (BB) hay giữa các thứ trong cùng một loài với

nhau Hai loài khởi thủy này là nhị bội, thụ tinh được, có cùng số lượng nhiễm sắc thể cơ bản (n=11) nhưng mang các đặc điểm hình thái khác nhau [24], [105], [113] Cây có chiều cao hai đến sáu mét, có thể phân biệt hai phần chính: phần dinh dưỡng và phần mang phát hoa Phần dinh dưỡng gồm một thân ngầm (thường được gọi là củ) nằm dưới mặt đất, là thân thật, mang hệ thống rễ bất định và một thân giả khí sinh với các bẹ lá lồng vào nhau Ở mỗi nách lá đều có chồi mầm Trong thời kỳ dinh dưỡng, nhiều chồi dinh dưỡng cùng phát triển trên thân ngầm Tuy nhiên, chỉ các chồi từ phần giữa đến ngọn thân ngầm có thể phát triển thành thân hay chồi nảy đảm bảo cho sự nhân giống dinh dưỡng [1], [105]

Khi cây trưởng thành, đỉnh sinh trưởng của thân thật vươn dài ra khỏi thân giả cùng với một phát hoa Lúc này gọi là trổ buồng Mô phân sinh hoa phân hóa theo chiều dài trục phát hoa theo thứ tự hoa cái, hoa lưỡng tính và cuối cùng là hoa đực Phát hoa đã thành thục thường mang ở đầu tận cùng các “chồi đực” hay còn gọi là

“bắp chuối” gồm mô phân sinh phát hoa được bao bọc trong các lá bắc không mở

ra, che giấu các hoa đực bên trong (hình 1.1) [1], [150]

Hoa cái có noãn sào và vòi nhụy lớn, cánh hoa thường có màu trắng chia thành năm khía ở đỉnh, năm nhị đực không có túi phấn Đầu nuốm nhụy cái có mật

để thu hút ong, bướm… Hoa lưỡng tính có noãn sào nhỏ nhưng không thụ tinh được Ở hoa đực, noãn sào bị thoái hóa, vòi nhụy nhỏ và nhị đực có bao phấn, nhưng ở các giống trồng thì ít khi bao phấn chứa phấn hoa Một ngày sau khi nở, hoa đực rụng Hoa cái do không có tầng tế bào vùng rụng ở đáy noãn sào nên không rụng Cách thức “bắp chuối” mọc chỉ thẳng lên trời, mọc ngang hay mọc thòng xuống đất được dùng để phân loại các giống chuối trồng [1]

Hình 1.1 Sơ đồ một cây chuối trưởng thành [113], [150]

Sự phân loại có thể được thực hiện nhờ dựa vào các đặc tính như: màu sắc thân cây, hình dạng cuống lá, sự phân bố của noãn, chồi đực hay hình dạng trái [24], [150]

1.2 Các nghiên cứu nhằm cải tiến giống chuối trên thế giới và ở Việt Nam

Các phương pháp cổ điển để cải thiện giống chuối bằng cách sử dụng các kỹ thuật lai giống thường khó thực hiện vì chuối có tỉ lệ vô sinh cao và vì tính đa bội của chúng [80]

Trên thế giới, việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ở chuối bắt đầu vào

năm 1919 bởi sự nhân giống sinh dưỡng tái sinh chồi, và đến năm 1960 bởi sự nuôi cấy phôi hợp tử của loài lưỡng bội Năm 1987, Cronauer và Krikorian mô tả sự hình thành các khối mô sẹo và sự tái sinh chồi qua quá trình phát sinh cơ quan Hiện nay,

sự thu nhận phôi soma ở chuối được tiến hành từ các mô cấy có nguồn gốc khác nhau như: chồi, phôi hợp tử non, cuống lá non, hoa đực non, mô phân sinh ngọn qua con đường tạo mô sẹo, dịch treo tế bào (huyền phù tế bào, suspension cell) hay

tế bào trần [26], [28], [35], [40], [43], [59], [92], [95], [111]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chuối đã được thực hiện liên quan tới sự nuôi cấy chồi đỉnh [10]; tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo [5]; tạo mô sẹo và dịch treo

tế bào từ phôi hợp tử non hay hoa đực non [2], [3], [4], [8], [20], [31]; phân tích tính

đa dạng di truyền giữa các giống chuối nhóm AAA-Cavendish Việt Nam [6], [11]

1.2.1 Sự nuôi cấy chồi và mô phân sinh ngọn chồi

Các khúc cắt chồi ngọn (dài vài mm, mang chồi với nhiều phát thể lá và chồi nách) hay khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi (dài 0,5 - 1,0 mm, mang mô phân sinh ngọn chồi và một hay hai phát thể lá) được nuôi cấy trên môi trường MS với IAA (0,175 mg/l) và BA (2,25 mg/l) [67], [125] Sự phát triển chồi chịu ảnh hưởng bởi kích thước mẫu cấy và nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy [121], [133]

Tùy mục đích nghiên cứu, vật liệu ban đầu có thể lớn hay nhỏ Sự dùng các mảnh cấy lớn mang nhiều chồi nách cho khả năng thu nhận số chồi cao hơn (so với

các mảnh cấy nhỏ), nhưng các mẫu cấy chuối thường bị hóa nâu do sự oxy hóa các hợp chất phenol tại vị trí vết thương [123] Sự tiết các các sản phẩm oxy hóa ức chế hoạt động của nhiều enzyme, làm đen mô và ngăn cản sự hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường dẫn đến sự cản tăng trưởng của mẫu cấy [45] Để khắc phục tình trạng này, sự cấy chuyền mỗi hai tuần trong 4 - 6 tuần đầu kết hợp với sự đặt

mô cấy trong tối, bổ sung các chất chống oxy hóa (acid ascorbic hay acid citric) vào môi trường, hay dùng khúc cắt có kích thước nhỏ Đặc biệt, mảnh cấy nhỏ (khúc cắt

mô phân sinh ngọn chồi) là vật liệu lý tưởng để thu nhận cây sạch bệnh [51], [67]

Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy chồi, BA 2,25 mg/l thường được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy Trong giai đoạn tăng sinh chồi, mẫu cấy tiếp tục được cấy chuyền trên môi trường có BA ở nồng độ 2,25 mg/l hay cao hơn (có thể đến 22,5 mg/l, tùy giống chuối) nhằm thu nhận cụm chồi tăng sinh cao (dùng trong

sự tạo dịch treo tế bào) Các nồng độ BA cao hơn thường ức chế sự tăng sinh chồi

và sự phát sinh hình thái nên ít được sử dụng [123] Ở một vài giống chuối, TDZ cho tỉ lệ tăng sinh chồi cao hơn so với BA [112]

Các chồi hay cụm chồi sau đó được cấy chuyền sang môi trường giảm

cytokinin và tăng auxin nhằm thu nhận cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ ở chuối,

các auxin như IAA, NAA và IBA thường được sử dụng ở nồng độ 0,1- 2,0 mg/l Trong vài trường hợp, sự bổ sung than hoạt tính (0,1 - 0,25 mg/l) được thực hiện

[123] Sau sự tạo rễ, các cây in vitro được chuyển ra trồng trong bầu đất, trước khi

được trồng trong các vườn thực nghiệm hay vườn sản xuất

1.2.2 Sự thu nhận phôi soma

 Kỹ thuật nuôi cấy phôi hợp tử

Các phôi hợp tử chưa trưởng thành được đặt nuôi trên môi trường đặc có picloram 2 mg/l Sau một đến hai tháng, các mô sẹo có khả năng sinh phôi được thu nhận cho sự tái sinh cây qua con đường sinh phôi soma [43] Kỹ thuật này chỉ áp dụng được ở các cây chuối có khả năng tạo hột (loài nhị bội, thụ tinh được)

 Kỹ thuật của Novak

Các mô của phần củ chuối in vitro và phần gốc của lá non được đặt nuôi trên

môi trường có dicamba và thidiazuron (chất có hoạt tính cytokinin rất mạnh) để thu nhận mô sẹo có khả năng sinh phôi [92]

 Kỹ thuật CHP (Cultures Hautement Proliférantes)

Kỹ thuật này do nhóm K.U.L (Katholicke University Leuven) ở Bỉ thực hiện Các đỉnh chồi có kích thước 1 - 2 mm3 có chứa mô phân sinh và được bao quanh bởi vài phát thể lá được đặt nuôi trên môi trường MS với IAA 0,175 mg/l và BA 2,25 mg/l Khi đó, hiện tượng ưu tính ngọn bị đàn áp, sự tăng sinh mạnh của đỉnh chồi sẽ tạo nên một tập hợp chồi hay các “khối mô phân sinh” màu trắng, tròn, dính nhau Phần chóp ngọn của các chồi này (“scalps”) được chuyển sang môi trường lỏng và được lắc, chứa 2,4-D và zeatin để tạo các khối cầu giống như tiền phôi, có khả năng phát triển thành cây [111]

 Kỹ thuật nuôi cấy phần đực của phát hoa

Kỹ thuật này do Ma và cộng sự thực hiện ở Đài Loan [148] Các nải hoa đực non được đặt nuôi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 4 mg/l, NAA 1 mg/l và IAA

1 mg/l Các mô sẹo có khả năng sinh phôi được thu nhận và chuyển sang môi trường lỏng và được lắc, chứa 2,4-D để tạo dịch treo tế bào Phôi soma được cảm ứng từ dịch treo tế bào trên môi trường có chứa các auxin và cytokinin

Trong vi nhân giống chuối, khởi đầu từ bốn nhóm kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào kể trên, sự phát triển của các cấu trúc lưỡng cực của phôi soma từ mô sẹo hay

dịch treo tế bào trên môi trường bán lỏng đã được ghi nhận ở Musa spp [43], [86],

[92], [122] Tuy nhiên, chưa có nhiều công bố chi tiết về các quá trình phát triển phôi soma, cũng như sự tạo các sơ khởi rễ, sự hình thành chồi với các sơ khởi lá, đặc biệt dưới các khía cạnh phát sinh hình thái và sinh lý học Hơn nữa, ở một vài giống chuối, sự phát sinh phôi có thể bị giới hạn ở các giai đoạn phát triển nào đó [80] Vì vậy, các nghiên cứu về quá trình phát sinh cơ quan và phát sinh phôi, bao

gồm sự phát triển của các tế bào và mô chuyên biệt thành các mô phôi, cần được thực hiện như một vấn đề lý thuyết và đồng thời giúp gia tăng hiệu quả của việc vi nhân giống thực vật và áp dụng các công nghệ sinh học thực vật [150]

1.3 Phát sinh hình thái thực vật, phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử

1.3.1 Phát sinh hình thái thực vật

Sự phát sinh hình thái thực vật là quá trình phát triển một cấu trúc hình thái mới thông qua sự phân chia, tăng trưởng và phân hóa tế bào Sự phát sinh hình thái được nghiên cứu ở nhiều mức độ tổ chức: cơ quan, mô, tế bào và phân tử, và dưới nhiều khía

cạnh: sinh lý học, di truyền học, sinh học tế bào và sinh học phân tử [17], [70]

Sự phát sinh hình thái phụ thuộc vào hai quá trình căn bản: điều hòa hướng kéo dài tế bào và kiểm soát mặt phẳng phân chia tế bào Để nghiên cứu sự phát sinh hình thái cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trong các biến đổi hình thái và cấu trúc Hai phương pháp thường được áp dụng để nghiên cứu sự phát sinh hình thái là: cắt bỏ một vùng mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát

triển sau đó; và nuôi cấy in vitro các phần tách rời của cơ thể thực vật cùng với sự

áp dụng các hormone thực vật ngoại sinh [17], [41], [100], [102]

Theo Nozeran [152], trong quá trình phát triển, có sự tác động qua lại giữa các cơ quan thực vật, và cấu trúc toàn vẹn của cơ thể thực vật là do toàn bộ các tương tác giữa các cấu trúc hợp thành Các nhân tố di truyền và môi trường có ảnh

hưởng quan trọng tới sự phát sinh hình thái Trong nuôi cấy in vitro, trên môi

trường nhân tạo và với các điều kiện môi trường được kiểm soát, mô cấy (như khúc cắt mô phân sinh ngọn) thoát khỏi sự tương quan mà nó phải chịu trong cơ thể thực vật nguyên vẹn để thiết lập sự tương quan mới

1.3.2 Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi

 Lịch sử nghiên cứu

Năm 1759, Wolff quan sát các mô và lá mới mọc ra từ ngọn Đầu thế kỷ 19, các tế bào ngọn được Negeli nhận diện trong các cây có mạch không có hạt, và hiểu

biết này được mở rộng cho cây có hạt qua thuyết tế bào ngọn Sau đó, thuyết tế bào ngọn được thay thế bởi thuyết vùng sinh mô của Hanstein (1868, 1870) cho cây hạt kín Hanstein mô tả mô phân sinh ngọn chồi gồm ba lớp: tầng sinh bì (dermatogen), tầng sinh vỏ (periblem) và lõi mô phân sinh ngọn (plerome) Một cách tuần tự, các lớp này sẽ cho ra biểu bì, vỏ và trụ trung tâm [42], [118]

Năm 1924, khái niệm vỏ (tunica) và thể (corpus) của Schmidt dựa trên sự định hướng phân chia tế bào trong các lớp khác nhau của mô phân sinh ngọn ở cây hạt kín trở nên rất phổ biến Theo Schmidt, các tế bào trong vỏ phân chia thẳng góc với bề mặt của mô phân sinh ngọn trong khi các tế bào vùng thể phân chia theo mọi hướng Số lượng các lớp tế bào vùng vỏ thay đổi từ một đến năm, nhưng thường là hai [42], [46], [118]

Vào những năm 1950, quan điểm “mô phân sinh chờ” (méristème d’attente) xuất hiện ở Pháp Theo quan điểm này, mô phân sinh ngọn bao gồm ba vùng: vùng trung tâm hay vùng “mô phân sinh chờ”, vùng ngoại vi hay vòng khởi sinh (anneau initial) và vùng lõi (méristème médullaire) Các tế bào vùng trung tâm không hoạt động trong giai đoạn tăng trưởng dinh dưỡng nhưng sự hoạt động trở nên mạnh mẽ vào giai đoạn ra hoa (cho ra các bộ phận của hoa) [118]

Khái niệm mô phân sinh động (dynamic meristem) được Ball đề nghị vào năm

1960, dựa trên các ảnh chụp sự tăng trưởng của mô phân sinh ngọn chồi theo thời gian, và được phát triển bởi Wardlaw (1968) khi nghiên cứu sự phát sinh hình thái

từ mô phân sinh ngọn chồi cô lập Mô phân sinh ngọn chồi không ngừng hoạt động

và sẽ tái tạo ngay một mô phân sinh ngọn mới hoàn chỉnh để sản sinh ra lá mới Vùng trung tâm mới chính là “vòng khởi sinh” thật sự; vùng ngoại vi là nơi sinh ra các sơ khởi lá từ lớp dưới biểu bì (tunica 2), và chỉ là vùng chuyển tiếp của các tế bào được sinh ra từ vùng trung tâm [46], [118], [137]

 Sự phát triển chồi từ mô phân sinh ngọn chồi

Mô phân sinh ngọn chồi ở cây hạt kín thường có đường kính khoảng 100-200m, với các tế bào đang phân chia, chưa biệt hóa cao về mặt hình thái, nhưng có khả năng

phát sinh hình thái Trong thiên nhiên, sự phát sinh cơ quan có nguồn gốc từ các mô phân sinh ngọn Mô phân sinh ngọn chồi (shoot apical meristem, SAM) là nguồn tế bào cho sự hình thành cơ quan chồi trong suốt quá trình phát triển hậu phôi [46], [48] Đặc điểm quan trọng của mô phân sinh ngọn chồi là sự phân lớp hay vùng Ở bắp, mô phân sinh ngọn chồi có hai lớp: L1 là vỏ (lớp ngoại vi), L2 là thể (bên

trong lớp ngoại vi) Ở cà chua hay Arabidopsis, mô phân sinh ngọn chồi có ba lớp:

L1 và L2 tạo nên vỏ, L3 là thể Mô phân sinh ngọn chồi hiện nay cũng thường được phân chia thành ba vùng: vùng trung tâm (central zone, CZ), vùng ngoại vi (peripheral zone, PZ) và vùng mô phân sinh lõi (rib zone, RZ) (hình 1.2) [17], [32], [100], [102] Vùng trung tâm gồm các tế bào chưa biệt hóa ở ngoại biên, một nhóm nhỏ tế bào gốc (stem cell) tập trung ở đỉnh (tối đa 10 tế bào) và một trung tâm tổ

chức với các tế bào có khả năng biểu hiện gene WUSCHEL [56], [102]

Hình 1.2 Sự phân vùng chức năng của mô phân sinh ngọn chồi với các lớp (L1,

L2, L3) và vùng (CZ, vùng trung tâm; PZ, vùng ngoại vi và RZ, vùng lõi) [32]

Mô phân sinh ngọn có vai trò quan trọng trong sự hình thành cơ quan và duy trì chính nó Việc duy trì tính toàn vẹn của mô phân sinh ngọn đòi hỏi sự phối hợp chính xác sự phân chia, tăng rộng và biệt hóa của tế bào [41], [102], [108]

Ngày nay, bằng cách thực hiện các nghiên cứu vi phẫu và áp dụng các kỹ thuật

di truyền phân tử, cấu trúc và vai trò của mô phân sinh ngọn chồi ngày càng được

A

hiểu nhiều hơn [32], [46], [56], [100] Nếu như trước kia người ta cho rằng có sự tồn tại của vùng “mô phân sinh chờ” thì ngày nay, người ta nhận thấy vùng trung tâm, đặc trưng bởi một hoạt động phân chia chậm hơn so với vùng ngoại vi, được cấu tạo bởi các tế bào gốc (stem cell) có khả năng tự làm mới, là một nguồn tế bào cho vùng ngoại vi và vùng mô phân sinh lõi [78], [134]

Ở Arabidopsis, L1 cho ra biểu bì của chồi, lá và hoa, L2 sản xuất các mô nền

và các tế bào mầm (germ cells) và L3 cho ra các mô mạch của thân và hầu hết các

mô bên trong của lá và hoa Tuy nhiên, sự tăng trưởng của mỗi lớp rất linh động [32], [72] Các nghiên cứu vi phẫu thuật dùng tia laser để cắt chính xác một vùng hay lớp tế bào của mô phân sinh ngọn chồi hay xử lý các hóa chất lên mô phân sinh ngọn chồi cây cà chua kết hợp với sự quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, các

phân tích mô học và kỹ thuật lai in-situ đã cho thấy vai trò cũng như mối liên hệ

giữa các vùng và lớp trong mô phân sinh ngọn chồi [101], [102]

Khi cắt một đường dọc qua mô phân sinh ngọn chồi, các sơ khởi lá tiếp tục phát triển đồng thời với sự thành lập hai mô phân sinh ngọn chồi mới Sự cắt bỏ vùng trung tâm không ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan nhưng dẫn đến sự hình thành trung tâm mô phân sinh mới từ các tế bào ở vùng ngoại vi Sự cắt bỏ vùng ngoại vi không ảnh hưởng đến chức năng của vùng trung tâm Tuy nhiên, trong sự cắt vùng ngoại vi, tùy vào vị trí cắt có thể ảnh hưởng đến vị trí hình thành của các sơ khởi lá Ngược với sự hình thành một trung tâm mô phân sinh mới sau khi vùng trung tâm bị cắt bỏ, lớp L1 không thể tái sinh nếu bị cắt bỏ hoàn toàn Sự cắt bỏ lớp L1 tại vùng trung tâm có ảnh hưởng đến sự phân chia và biệt hóa tế bào của lớp L2 và L3 Sự thay thế lớp L1 từ các tế bào của lớp L2 chỉ có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các tế bào còn lại của lớp L1; nếu không có thông tin nào từ các tế bào lớp L1, sự tạo mới các tế bào lớp L1 không thể được thực hiện từ các tế bào lớp L2 [103], [104]

1.3.3 Mô phân sinh ngọn rễ và sự phát triển rễ

Một rễ đang tăng trưởng đầy đủ gồm ba vùng chức năng: vùng mô phân sinh ngọn rễ, vùng kéo dài và vùng trưởng thành Vùng mô phân sinh ngọn rễ bao gồm

chóp rễ, vùng trung tâm yên lặng (quiescent center) và vùng tế bào tăng trưởng nhanh [42], [46] Ngoài nhiệm vụ giữ chặt cây xuống đất, rễ đảm nhiệm một vai trò quan trọng là hấp thu nước và các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây thông qua các lông rễ và tế bào biểu bì của vùng rễ non chưa hóa sube [18], [128]

Ở cả đơn tử diệp (một lá mầm) và song tử diệp (hai lá mầm), sự hình thành và

phát triển rễ xảy ra rất sớm trong quá trình phát triển phôi Ở Arabidopsis, vào giai

đoạn 32 tế bào (với sự hiện diện của 7 - 9 tế bào dây treo), tế bào trên cùng của dây treo phân chia không đối xứng cho ra một tế bào đáy lớn là nguồn gốc của chóp rễ,

và một tế bào ngọn nhỏ là nguồn gốc của vùng trung tâm yên lặng [109], [136] Tế bào ngọn phân chia cho ra 4 tế bào không hoạt động của vùng trung tâm yên lặng Các tế bào yên lặng ngay lập tức cảm ứng các tế bào bên cạnh hình thành nên tế bào gốc (stem cell) của mô phân sinh ngọn rễ Khi các tế bào gốc bắt đầu sản sinh ra các

tế bào con, một mô phân sinh ngọn rễ với đầy đủ các chức năng được thành lập [57] Trong quá trình phát triển, tế bào sinh rễ của phôi tích lũy tinh bột và có sự không bào hóa [52], [136] Ở lúa, sự hình thành rễ đầu tiên xảy ra ở sâu bên trong phôi, sau giai đoạn phôi hình cầu [144]

Sự tăng trưởng của rễ tùy thuộc vào sự hoạt động của mô phân sinh ngọn rễ Tuy nhiên, các dữ liệu về di truyền và sự dùng tia laser để loại vùng trung tâm cho thấy chính vùng trung tâm ức chế sự biệt hóa của các tế bào bên cạnh Sự hủy các tế bào trung tâm nhanh chóng làm mất dấu hiệu ức chế, dẫn đến sự biệt hóa của các tế bào trụ bên cạnh Sự tương tác giữa các tế bào bên trong mô phân sinh ngọn rễ rất đặc biệt, và hình thành các cấu trúc rễ chịu sự điều khiển của hai kiểu truyền tín hiệu: tín hiệu ức chế từ vùng trung tâm mô phân sinh rễ và tín hiệu cảm ứng từ rễ trưởng thành [46], [99], [128], [136]

Ở lúa, sự phân chia thẳng góc đầu tiên của các tế bào vùng trung tâm yên lặng dẫn đến hình thành các tế bào ở trụ giữa; sự phân chia song song đầu tiên sau nhiều lần phân chia thẳng góc tạo nên các tế bào vùng ngoại biên của chóp rễ Sự phân chia thẳng góc đầu tiên của tế bào ngay bên cạnh vùng trung tâm yên lặng khởi phát

sự sản sinh biểu bì và nội bì Tám lần phân chia song song không cân xứng liên tục sau lần phân chia thẳng góc đầu tiên dẫn đến sự hình thành biểu bì, nội bì, cương

mô và năm lớp tế bào ở vùng vỏ [46], [99] Ở lúa, sự hình thành rễ bên khởi đầu bởi

sự phân chia thẳng góc với trục thân để hình thành vùng trung tâm mô phân sinh rễ Sau đó, các tế bào bên trong vùng trung tâm sẽ phân chia song song với trục thân để hình thành mô phân sinh rễ, sẵn sàng cho sự hình thành rễ bên [99]

Sự tạo rễ bất định thường gồm ít nhất hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi: giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc hay chu luân và giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ này [15] Các phân tích dưới kính hiển vi cho thấy, sự tạo sơ khởi rễ bắt đầu từ các tế bào có không bào lớn Trong giai đoạn đầu, các tế bào này biến đổi thành các tế bào mô phân sinh cấp hai có khả năng phát sinh mô: lục lạp mất dần các sắc tố và phân chia mạnh cùng với ti thể để trở thành các bóng màng ngày càng nhỏ, khó phân biệt dưới kính hiển vi; sau đó các tế bào này tiếp tục biến đổi thành các tế bào mô phân sinh cấp một có khả năng phát sinh

cơ quan: phân chia mạnh, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ, nhân và hạch nhân rất lớn Khi đó, sự hình thành sơ khởi rễ xảy ra [79], [149]

1.3.4 Sự phát triển phôi hợp tử

Ở phôi hợp tử của các cây song tử diệp, sự phân chia không cân xứng đầu tiên cho ra tế bào gốc với không bào lớn (basal cell), và tế bào ngọn (apical cell) có không bào nhỏ hơn nhưng có nhân to và tế bào chất đậm đặc Sự phân chia của tế bào gốc được thực hiện theo hướng ngang để hình thành một chuỗi tế bào nhỏ (nguồn gốc của dây treo có nhiệm vụ dẫn truyền chất dinh dưỡng từ mô mẹ) Một tế bào nhỏ của dây treo ở gần tế bào ngọn nhất, được gọi là tế bào yên (hypophysis),

sẽ hình thành nên các phần của rễ bao gồm trung tâm mô phân sinh rễ với tế bào gốc của rễ (tế bào sinh rễ) [69], [138]

Thành phần chủ yếu của phôi có nguồn gốc từ tế bào ngọn Sự phân chia đầu tiên theo hướng dọc và sự phân chia kế tiếp theo hướng ngang để dẫn đến phôi tám

tế bào Sau đó, phôi này tiếp tục phát triển để cho các mô và cơ quan phôi [46],

[138] Ở Brassica napus, sự hình thành mô phân sinh ngọn chồi bắt đầu vào giai

đoạn phôi hình cầu với sự xuất hiện của các tế bào có dạng vuông đặc trưng, kích thước nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc Vào giai đoạn phôi hình cá đuối, vùng ngọn gia tăng kích thước và các tế bào mô phân sinh chỉ chứa một vài không bào nhỏ dễ dàng phân biệt với các tế bào tiền tượng tầng với các không bào to Trong giai đoạn phôi tử diệp, mô phân sinh ngọn phát triển đầy đủ với sự hiện diện của lớp tunica và corpus [142], [127]

Ở đơn tử diệp, ngoại trừ lần phân chia tế bào không cân xứng đầu tiên, các phân chia tế bào sau đó xảy ra theo kiểu có thể thay đổi và không thể đoán trước [145], dẫn đến một khối cầu được xem như tiền phôi ở bắp và phôi hình cầu sớm ở lúa [66] Ở bắp, tiếp theo giai đoạn tiền phôi là giai đoạn tạo vùng mô phân sinh ngọn chồi; sau đó, mô phân sinh ngọn chồi phát triển thành chồi ngọn được diệp tiêu bao quanh Tương tự, ở lúa, sự hình thành diệp tiêu, mô phân sinh ngọn chồi và

sơ khởi rễ mầm bắt đầu sau giai đoạn hình cầu Khác biệt chính với song tử diệp là

rễ đầu tiên của các loại ngũ cốc hình thành ở sâu bên trong phôi [57], [144]

1.4 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong phát sinh cơ quan

và phát triển phôi hợp tử

Phần lớn các nghiên cứu về sự phát sinh phôi đi sâu vào phân tích các thay đổi hình thái học Các nghiên cứu về sinh lý học của sự phát sinh phôi thường tập trung vào tìm hiểu vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Thuật ngữ "chất điều hòa thực vật" (plant regulator) được dùng để chỉ một cách tổng quát những hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các chất được tổng hợp nhân tạo) có tác dụng kích thích hay cản, nói cách khác, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở nồng độ thấp Chúng không phải là chất dinh dưỡng, tức là những vật liệu cung cấp năng lượng hay những nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật [17], [37], [63], [106]

Thuật ngữ "kích thích tố thực vật" (phytohormone) chỉ những chất điều hòa thực vật thiên nhiên, được tạo ra từ vị trí sản xuất và di chuyển tới vị trí hoạt động (mô và tế bào đích) [14], [63]

Hiện nay, năm nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật có tác động trực tiếp trên sự tăng trưởng và phân hóa tế bào được thừa nhận rộng rãi là: auxin, cytokinin, acid abcisic, gibberellin [17], [128]

1.4.1 Auxin

Auxin là yếu tố quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật, nhưng có ảnh hưởng khác nhau trong các giai đoạn phát sinh phôi hay phát sinh cơ quan Hàm lượng auxin trong tế bào và mô thay đổi do tốc độ sinh tổng hợp, trạng thái hoạt động

và sự vận chuyển, trong khi khả năng đáp ứng với auxin của tế bào hay mô được xác định bởi nồng độ và hoạt động của con đường truyền tín hiệu [62], [30], [94]

Auxin (IAA) được xác định và cô lập vào khoảng những năm 1920 và 1930 dựa trên sự kéo dài khúc cắt diệp tiêu Phần lớn auxin thiên nhiên hiện diện ở thực vật bậc cao là acid indole-3-acetic (IAA), với hàm lượng khoảng 10-100 ng/g trọng lượng tươi Một số thực vật tổng hợp thêm các phân tử auxin khác như acid 4-chloroindole-3-acetic, acid phenylacetic và acid indole-3-butyric (IBA) Ba auxin tổng hợp quan trọng nhất là acid 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D), acid 1-naphthalene acetic (NAA) và picloram [37], [82]

IAA được tổng hợp ở mô phân sinh ngọn chồi, lá non, các trái và hột đang tăng trưởng Sự sinh tổng hợp IAA tự do ở thực vật bắt đầu từ chorismate hay anthranilate dẫn đến sự sinh tổng hợp indol và tryptophan Có hai con đường tổng hợp IAA: con đường phụ thuộc tryptophan và con đường độc lập tryptophan Hầu

hết auxin trong thực vật (đến 99% trong trường hợp Arabidopsis) ở dạng liên kết

với các phân tử khác như glucid, acid amin và peptid Auxin liên kết thường là nguồn auxin dự trữ chủ yếu, nhưng cũng có thể là dạng trung gian của quá trình thoái biến IBA là một dạng dự trữ của auxin và có thể chuyển thành IAA, dù có thể tác dụng trực tiếp [82], [128]

Auxin có vai trò điều hòa hiện tượng ưu tính ngọn, sự hình thành rễ thứ cấp, lão suy của lá, phân hóa mô mạch, hình thành nụ hoa và tăng trưởng trái Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng, sự tăng trưởng theo đường kính, nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp Auxin có thể được tạo ra từ các lá già hơn và di chuyển tới mô phân sinh ngọn, và sự di chuyển hữu cực của auxin từ mô phân sinh ngọn cần thiết cho quá trình phát triển của các sơ khởi lá [37], [108]

Trong sự tăng trưởng của thân non và diệp tiêu, auxin làm tăng tính giãn của vách tế bào bằng cách hoạt hóa và tổng hợp mới ATPase-H+ (bơm proton) của màng H+ được bơm ra khoảng gian bào, và sự giảm pH của vách làm cho các vi nối giữa extensin, hemicellulose, các hợp chất pectic với cellulose bị phá vỡ, Ca2+ nối liền các chuỗi hợp chất pectic bị loại đi dẫn tới sự duy trì tính lỏng lẻo của vách [114], [128] Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp các mRNA liên quan trong sự tổng hợp các enzyme chuyên biệt, bao gồm các enzyme liên quan trong sự tạo tiền chất của cellulose và các hợp chất khác của vách [17], [94]

Sự di chuyển của auxin theo cơ chế vận chuyển tế bào – tế bào là nhân tố quan trọng trong sự hình thành trục của phôi cũng như sự hình thành mô phân sinh ngọn chồi, mô phân sinh ngọn rễ và các tử diệp sau đó [30], [47], [94] Ở Arabidopsis, sự

di chuyển và tích lũy auxin ở những vị trí đặc biệt có vai trò trong sự phát triển phôi: trong giai đoạn đầu, auxin di chuyển hướng ngọn; ở giai đoạn 32 tế bào, auxin

di chuyển hữu cực, tích lũy ở tế bào yên (tế bào dây treo gần tiền phôi nhất, và là tế bào quyết định số phận mô phân sinh ngọn rễ với vùng trung tâm yên lặng); và ở giai đoạn chuyển tiếp (giữa phôi hình cầu và hình tim), auxin ở vùng ngọn di chuyển về phía hai sơ khởi tử diệp (hình 1.3) [69], [138]

Vào giai đoạn phôi hình cầu muộn, hai sơ khởi tử diệp phát triển nhanh chóng dẫn đến sự hình thành phôi hình tim Các nghiên cứu ở đột biến CUP-SHAPED cho thấy sự xuất hiện của dòng auxin di chuyển hữu cực trong suốt quá trình phát sinh phôi dẫn đến sự hoạt hóa các gene liên quan trong sự hình thành các cơ quan phôi [30], [94], [135]

Hình 1.3 Mối liên hệ giữa sự di chuyển của auxin và sự phát triển phôi (theo Jenik

và Barton) [69] A-F, các giai đoạn phát triển phôi; ac, tế bào ngọn (apical cell); bc,

tế bào gốc (basal cell); ad, vùng ngọn (apical domain); cd, vùng trung tâm (central domain); bd, vùng gốc (basal domain); h, tế bào yên (hypophysis); cot, tử diệp (cotyledon); SAM, mô phân sinh ngọn chồi (shoot apical meristem); các mũi tên chỉ

sự di chuyển của auxin

1.4.2 Cytokinin

Cytokinin là dẫn xuất của adenin với sự thay thế nhóm N6 Cũng như các hormone khác, hoạt động của cytokinin trong cây được điều khiển bởi sự cân bằng trong quá trình tổng hợp, biến dưỡng và sự liên kết làm bất hoạt Sự phân bố cytokinin theo không gian và thời gian cũng được điều khiển một cách chính xác trong các giai đoạn phát triển của thực vật

Cytokinin được tổng hợp trong rễ, phôi đang tăng trưởng, lá non, trái và mô bướu Bước đầu tiên trong sự sinh tổng hợp isoprenoid của cytokinin được xúc tác bởi adenosine phosphate-isopentenyltransferase (IPT), và sử dụng các adenosine 5’-phosphate (ATP, ADP hay AMP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) hay butenyl diphosphate (HMBDP) [128] Cytokinin oxydase, sự liên kết adenosine-glucid sự chuyển đổi qua lại giữa dạng tự do và liên kết đóng vai trò điều hòa hàm lượng cytokinin [93], [128]

Cytokinin tham gia vào sự tăng rộng tế bào, phân chia và phát sinh hình thái tế bào, sự trưởng thành của lục lạp, cản sự lão hóa… [106], [128] Trong một số trường hợp, sự tăng nhẹ cytokinin nội sinh cần thiết cho sự phát sinh phôi Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đối kháng với auxin trong sự phát sinh cơ quan: auxin giúp tạo rễ trong khi cytokinin giúp tạo chồi Sự cân bằng giữa hai hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự tăng trưởng [37], [89], [91]

Cytokinin kích thích sự tăng trưởng tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Trong sự nuôi cấy các mô nghèo cytokinin, auxin kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách Sự phân vách chỉ xảy ra khi

có cytokinin ngoại sinh [17]

Cytokinin thúc đẩy sự phiên mã (tạo mRNA) và tổng hợp các protein và enzyme đặc hiệu trong các mô xác định Cytokinin kích thích sự tăng trưởng tế bào bằng cách làm giảm pH vách tế bào giống như auxin ở trụ hạ diệp cây mầm dưa leo

Cucumus sativus L [98] Cytokinin hoạt hóa các protein kinase trong các con

đường truyền tín hiệu, giúp sự đáp ứng của tế bào với cytokinin [82], [128]

Các nghiên cứu gần đây trên các gene đột biến ở lúa và Arabidopsis cho thấy

cytokinin có vai trò quan trọng trong sự điều hòa hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi [77], [139]

1.4.3 Gibberellin và acid abscisic

Gibberellin kiểm soát hướng đặt của các vi ống ở ngoại vi tế bào và từ đó quyết định hướng đặt của các vi sợi cellulose vừa mới được tổng hợp trên vách tế bào Gibberellin cảm ứng sự đặt các vi ống theo hướng ngang ở nhiều kiểu tế bào (kể cả các tế bào mà gibberellin không kích thích sự kéo dài), tuy nhiên sự phối hợp hoạt động giữa gibberellin và auxin chưa được biết rõ Ở song tử diệp, có lẽ bằng cách kích thích sự hấp thu Ca2+ vào tế bào, gibberellin làm giảm nồng độ Ca2+ trong vách

do đó giúp cho sự giãn vách Trong hoạt động này, vách tế bào không bị acid hóa như trong trường hợp auxin [17], [37]

Đối nghịch với auxin, acid abscisic (ABA) cản sự tăng trưởng của diệp tiêu và các mô nuôi cấy Tuy nhiên, vai trò trong sự sinh phôi và trưởng thành của hột là một hoạt động đặc sắc của acid abscisic [128] Acid abscisic được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm mục đích kích thích hoặc kìm hãm sự tăng trưởng của các tế bào mô sẹo hay kích thích hoặc kìm hãm sự hình thành và phát triển phôi tùy thuộc vào các loài thực vật khác nhau Ở nồng độ thấp (0,1 – 1 mg/l), ABA thúc đẩy sự trưởng thành của phôi soma và ngăn cản sự tăng sinh không bình thường như sự tạo

ra phôi thứ cấp hoặc phôi bất định và đàn áp sự nảy mầm sớm của phôi soma [23] Gibberellin và acid abcisic có tác động đối nghịch nhau trong sự tăng trưởng của tế bào Trong quá trình sinh phôi soma, gibberellin thường không có tác dụng đặc biệt Tuy nhiên trong một số trường hợp, để tạo được phôi cần phải có sự cân bằng giữa ABA, zeatin và GA3 Nói chung, acid abcisic giúp cho sự trưởng thành của phôi, gibberellin giúp cho sự nảy mầm [29], [37]

1.5 Cơ sở phân tử của sự phát sinh hình thái

Sự phát sinh hình thái là sự biểu hiện của các thông tin di truyền được mã hóa trong các trình tự DNA của genome và sự tương tác của các thông tin đó với nhau

và với môi trường [49]

Ở tế bào chân hạch, một gene bao gồm hai vùng chuyên biệt: vùng điều hòa và vùng mã hóa Vùng điều hòa kiểm soát sự sao chép, bao gồm các promoter và yếu

tố điều hòa cis Promoter là nơi cho phép RNA polymerase bắt đầu sự sao chép Yếu tố điều hòa cis là các trình tự DNA ngắn (6-8 cặp nucleotid) cho phép nhận biết nhiều hormone (động vật, thực vật) Trên yếu tố điều hòa cis (có bản chất DNA) sẽ

cố định yếu tố điều hòa trans (có bản chất protein) Các enhancer là trường hợp đặc biệt của yếu tố điều hòa cis Sự liên kết của yếu tố điều hòa trans trên enhancer (sự điều hòa trans) dẫn tới sự hoạt hóa của promoter (sự điều hòa cis) và sự gắn RNA polymerase trên promoter qua trung gian phức hợp TFII Từ đó, có sự sao chép các gene chuyên biệt Vùng mã hóa của các gene ở tế bào chân hạch là một chuỗi lần lượt các exon và intron nằm xen kẽ nhau Intron được sao chép nhưng không được dịch, exon là trình tự được dịch thành các protein [64], [71]

Để nghiên cứu sự biểu hiện gene, người ta thường dùng kỹ thuật “DNA footprinting”, cây chuyển gene hay theo dõi sự thay đổi hàm lượng của vài mRNA chuyên biệt Trắc nghiệm GUS (-glucuronidase) thường được sử dụng để chứng minh nhanh sự biểu hiện của gene được chuyển vào tế bào thực vật Theo đó, tế bào

có mang gene GUS sẽ có màu xanh lơ đậm do sự tạo sản phẩm màu sau khi được ủ trong dung dịch có chứa đài chất của -glucuronidase là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronic acid, dạng muối cyclohexyl ammonium) [147], [49], [64]

Có rất nhiều gene tham gia trong quá trình điều hòa sự phát sinh phôi và phát sinh cơ quan Ở mỗi giai đoạn phát triển khác nhau, các gene khác nhau được hoạt hóa trong các nhóm tế bào khác nhau, và ở những thời điểm khác nhau (sự điều hòa theo không gian và thời gian) Mỗi nhóm tế bào theo một con đường phát triển riêng biệt để trở thành một loại mô chứa các tế bào chuyên biệt, từ đó cho những cấu trúc

hình thái thích ứng cho những chức năng đặc biệt Mỗi tế bào cơ thể thừa hưởng toàn

bộ thông tin di truyền của tế bào ban đầu nhưng chỉ có một phần của chương trình được biểu hiện trong các tế bào phân hóa; tiềm năng sinh phôi của các tế bào phân hóa bị đàn áp bởi các tương quan trong một cơ thể nguyên vẹn [19], [96], [97], [108] Quá trình sinh phôi soma thật sự là một chương trình biểu hiện gene Trong

đó, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò trung tâm trong việc khởi động dòng thông tin tế bào Các loài thực vật khác nhau, với nhu cầu cảm ứng sự phát sinh phôi khác nhau, đòi hỏi hàm lượng cũng như loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau [33]

Sự biểu hiện gene có tính chuyên biệt theo từng giai đoạn phát triển Vùng biểu hiện gene xuất hiện ở vị trí đánh dấu mô phân sinh ngọn chồi (SAM) trong phôi chưa trưởng thành trước khi vùng này có thể thấy được dưới kính hiển vi Gene chỉ thị SAM đầu tiên biểu hiện trong phôi, trong 4 tế bào ngọn của phôi ở giai đoạn 16 tế bào, là

WUSCHEL (WUS) Sự phân chia tế bào sau đó giúp hình thành một nhóm tế bào dưới ngọn lớn hơn Có lẽ chức năng của WUS là duy trì trạng thái đa năng của các tế bào

trong trung tâm tổ chức (SAM) và xác định đặc tính của các tế bào gốc Sự hình thành

các tế bào gốc được đánh dấu bằng sự biểu hiện của SHOOTMERISTEMLESS (STM) trong phôi hình cầu và CLAVATA 3 (CLV3) trong phôi hình tim Trong khi STM định

vị trong vùng trung tâm của ngọn phôi (bao gồm các tế bào gốc và trung tâm tổ chức),

thì sự biểu hiện của CLV3 giới hạn trong các tế bào gốc [56], [127]

Các kết quả nghiên cứu về việc biểu hiện gene trong những năm gần đây cho thấy có nhiều nhóm gene liên quan trong quá trình phát sinh hình thái, hình thành và phát triển phôi hợp tử và phôi soma ở thực vật Đó là các gene đáp ứng với hormone

(DcArg-1, các đồng dạng của pJCW1, pJCW2, DcECP63, Em, DcECF31), các gene giữ nhà (Top 1, EF-la, CEM6, H3-1, CGS102, CGS103, CGS201), các gene điều khiển các con đường truyền tín hiệu (SERKs, swCDKs, CRKs, MsCPK3), các gene đồng dạng (Sbh1, CHB1-CHB6, DcDB1), các gene mã hóa các protein ngoại bào (EP3-1, EP3-2, PgChi-1, PgGlu-1, EP2, DcAGP1), và các gene điều khiển sự