Hướng dẫn các bước pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật y học, công thức pha chế một số môi trường nuôi cấy. 1. Trình bày được các yêu cầu cơ bản, phân loại, các bước tiến hành điều chế môi trường. 2. Chuẩn bị được dụng cụ tiến hành điều chế môi trường. 3. Tiến hành điều chế được một số môi trường thông dụng.
Trang 1MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP
VI KHUẨN,NẤM GÂY BỆNH
1.Tầm quan trọng của môi trường:
Muốn nuôi cấy các vi khuẩn gây bệnh trong phòng thí nghiệm cần phải có các môi trường dinh dưỡng,đó là hỗn hợp các chất đạm,đường,muối khoáng và vitamin thích hợp,đảm bảo cho sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn
Việc pha chế các môi trường dinh dưỡng là một trong những khâu quan trọng nhất trong công tác xét nghiệm vi khuẩn vì nếu môi trường không đảm bảo chất lượng sẽ cho những kết quả sai lệch trong việc chẩn đoán,xác định các vi khuẩn gây bệnh.Vì vậy để đảm bảo chất lượng của môi trường, việc pha chế môi trường phải được tiến hành một cách thận trọng
2 Các loại môi trường:
2.1 Dựa vào thành phần:
Môi trường được chia làm 2 loại: Môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp.
- Môi trường tự nhiên là môi trường được điều chế từ các sản phẩm có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, ví dụ: môi trường khoai tây, môi trường nước mạch nha…
- Môi trường tổng hợp là môi trường được điều chế từ các chất hoá học tinh khiết, xác định và được lấy với những nồng độ cho trước
2.2 Dựa vào trạng thái vật lý:
Môi trường được chia làm 3 loại:
- Môi trường lỏng, ví dụ: môi trường canh thang…
- Môi trường nửa lỏng nửa đặc, ví dụ: môi trường thạch mềm…
- Môi trường đặc, ví dụ: môi trường thạch thường…
2.3 Dựa vào công dụng:
Dựa vào công dụng môi trường được chia ra làm 5 loại:
2.3.1 Môi trường cơ bản:
Môi trường cơ bản là môi trường phần lớn các vi khuẩn có thể phát triển được và là nguyên liệu cơ bản để điều chế các môi trường khác Môi trường cơ bản hay được sử dụng nhất là môi trường thạch thường và canh thang
2.3.2 Môi trường vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm:
Trong những trường hợp sau khi lấy bệnh phẩm không có điều kiện cấy ngay vào môi trường nuôi cấy thích hợp mà phải vận chuyển đi xa với một thời gian nhất định, bệnh phẩm phải được bảo quản trong môi trường vận chuyển về phòng xét nghiệm một trong những môi trường hay được sử dụng là môi trường Cary – Blair
2.3.3 Môi trường tăng sinh:
Môi trường tăng sinh được sử dụng trong một số trường hợp vi khuẩn trong bệnh phẩm quá ít, chúng ta cần làm tăng số lượng trước khi cây vào môi trường phân lập ví dụ: môi trường Mueller – Kauffman…
Trang 22.3.4.Môi trường phân lập:
Môi trường phân lập nhằm mục đích tách vi khuẩn cần tìm ra khỏi bệnh phẩm có lẫn tạp khuẩn vi vậy trong môi trường phân lập ngoài chất dinh dưỡng còn có các chất đảm bảo sự phát triển ưu thế cho một loài hoặc một nhóm vi khuẩn nào đó, nhưng đồng thời lại
có chất hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của những loài vi sinh vật khác (môi trường ức chế chọn lọc) do đó mỗi loài hoặc mỗi nhóm vi khuẩn sẽ có môi trường phân lập khác nhau Vi dụ: môi trường Endo, MC… sử dụng để phân lập vi khuẩn đường ruột, môi trường Chapman để phân lập tụ cầu, môi trường Schoer phân lập vi khuẩn bạch hầu…
2.3.5 Môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học:
Đây là môi trường sử dụng để phân biệt giữa loài vi khuẩn này với loài vi khuẩn khác vi vây thành phần các môi trường này ngoài chất dinh dưỡng ra còn có các hoá chất đặc biệt để phát hiện khả năng chuyển hoá của loại vi khuẩn cần định danh
3 Các bước pha chế môi trường.
3.1 Pha chế từ các hóa chất riêng lẻ
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
- Phải có các dụng cụ pha chế bằng men sứ hoặc thủy tinh.Thường dung bình nón thủy tinh có dung tích gấp đôi thể tích môi trường đủ để lắc kĩ.Không pha quá 1 đến 2 lít môi trường cho mỗi bình.Các dụng cụ phải được rửa thật sạch không lẫn các chất khác:
- Hóa chất dung pha chế phải tinh khiết,khô,không vốn cục,không đổi màu
- Nếu môi trường có thạch gelatin thì phải đun nóng để hòa tan hoàn toàn,khi không còn các tiểu phần thạch dính trên thành bình
Điều chỉnh PH của môi trường.
- Mỗi loại vi khuẩn chỉ phát triển được ở một độ PH nhất định,vì vậy làm môi trường nhất thiết phải Điều chỉnh PH thích hợp
- Việc Điều chỉnh PH của môi trường được tiến hành ở 45-50 độ C để PH cuối cùng của môi trường sau khi hấp và để nguội không bị thay đổi nhiều
- Hóa chất dùng để thay đổi PH là Natri Hydroxit ( NaOH) 10-20% và axit Clohidric 10-12%.Chỉ thị màu là phenol hoặc Bromphenol
- Cách pha chỉ thị màu xem phần kĩ thuật pha chế
Trang 3 Làm sáng trong môi trường.
- Môi trường phải được làm sáng trong để quan sát tốt sự phát triển của vi khuẩn
- Các phương pháp làm trong thông thường là:
- Đối với môi trường lỏng: lọc qua vải mịn hoặc giấy lọc
- Đối với môi trường thịt: muốn môi trường trong suốt không lờ đục thì phải dùng Natri hydroxit điều chỉnh pH = 7,8- 8 và hấp 120 độ C trong 30 phút, để lắng cặn rồi hấp 120 độ C trong 30 phút, để lắng cặn rồi lọc qua 2 lần giấy lọc
- Phương pháp làm sáng mầu là: một số môi trường có màu sẫm như môi trường casein thủy ngân, canh thang, có thể ding than hoạt để loại màu tùy theo môi trường sẫm màu nhiều hay ít mà có thể dùng từ 5 đến 10g than hoạt tính cho 1 lít môi trường; đun sôi 10 phút rồi lọc qua giấy lọc hoặc vải dày
- Các môi trường có trứng hoặc huyết thanh thì khử trùng ở nhiệt độ 70-80 độ C
- Các môi trường thông thường khác thường khử trùng ở 110độC trong 30 phút hoặc 121độ C trong 15 phút Nếu bình môi trường trên 1 lít thì khử trùng 121độ C trong 20 phút
- Sau khi khử trùng và áp suet lò giảm xuống không thì chuyển môi trường ra lò , không nên để môi trường hâm nóng lâu trong lò, càng không nên để môi trường qua đêm trong lò, vì như vậy môi trường sẽ bị sẫm màu và kém chất lượng
- ở huyện, xã nếu không có lò hấp môi trường có thể đun sôi cách thủy 100độ C trong 30 phút lion 3 ngày, các nha bào sẽ bị phá hủy ở tỷ lệ khá cao
Đổ đĩa môi trường:
- Một số môi trường cần đổ đĩa thì sau khi hấp khử trùng, để nguội 45- 50độ C rồi
đổ lên đĩa khi môi trường nóng trên 50 độ C để tránh hơi nước đọng lại trên mặt nắp hộp lồng
- Trước khi rót môi trường ra đĩa, phải quay tròn bình môi trường để trộn đều
- Các bọt khí trên bề mặt môi trường được phá bằng cách dùng một ngọn đèn ga lia nhẹ trên mặt bọt khí hoặc dùng dầu piopet đã đốt nóng, châm vào bọt khí
Trang 4- Nếu bề mặt môi trường ướt thì phải làm khô trong tủ ấm ở nhiệt độ 30-40 độ C trong 20-30 phút trước khi cấy.
Kiểm tra vô trùng:
Môi trường được để vào tủ ấm qua đêm để kiểm tra vô trùng (3 – 5% số lượng đĩa sản xuất)
Các bước pha chế môi trường từ các chất riêng lẻ
3.2 Pha chế bột từ môi trường khô
Hiện nay nhiều phòng xét nghiệm vi sinh được cung cấp các loại môi trường chế sẵn dưới dạng bột khô Các môi trường này được làm từ các nguyện liệu, hóa chất tinh khiết nên chất lượng môi trường được đảm bảo và ổn định hơn và việc cân đong pha chế cũng đơn giản tiện lợi hơn Tuy nhiên việc pha chế các môi trường từ bột khô cũng phải làm theo các bước trên và cần chú ý một số điểm sau:
- Phải dùng nước mới cất hoặc nước khoáng trung tính để pha chế
- Nếu môi trường còn mới và pha với nước trung tính thì không phải điều chỉnh lại
PH, nhưng nếu môi trường cũ, cần kiểm tra và điều chỉnh PH quy định trên lọ môi trường
3.3 Các hiện tượng và nguyên nhân gây sai hỏng môi trường.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa
chất Cân đong Hoà tan Điều chỉnh pH
Làm trong sáng môi
trường
Đổ đĩa
Đóng ống môi trường Khử trùng môi trường
Kiểm tra vô trùng
Trang 5Có nhiều hiện tường và nguyên nhân gây sai hong môi trường, chúng ta cần biết để tìm cách khắc phục Dưới đây là 1 số hiện tượng và nguyên nhân chính:
3.3.1.Môi trường quá cứng là do
- Thạch không thích hợp hoặc cân đong không chính xác, làm tăng lượng thạch quá quy định
3.3.2 Môi trường có độ cứng quá thấp là do
- Thạch không thích hợp hoặc lượng thạch quá ít
- Thạch chưa được tan hoàn toàn
3.3.3.Vi khuẩn phát triển kém là do:
- Có các chất úc chế trong bình chứa, trong mẫu thử
- Vi khuẩn trong mẫu thử bị phá hủy trước khi cấy
- Liều lượng các thành phần cơ bản trong môi trường không đúng
3.3.4 Vi khuẩn phát triển quá mạnh là do
- môi trường sấy, hấp quá nhiệt đọ quy định ,làm hỏng các chất ức chế tạp khuẩn
- cấy vào quá nhiều chất thử
3.3.5.Khuẩn lạc bị nhòe là do
- bề mặt môi trường quá ẩm ướt
- cấy vào môi trường quá nhiều chất thử
- hấp môi trường quá nhiệt độ quy định, làm hỏng chất ức chế
3.4.Bảo quản môi trường
3.4.1 đối với các môi trường khô
- bảo quản ở nôi khô, tránh ánh sang, nhiệt độ từ 10 đến 12 độ c
- Lọ môi trường phải luôn luôn được đậy chặt sau khi dùng vì nếu bị hở môi trương hấp thụ nước sẽ làm thay đổi độ PH và bị vón cục
- Trong điều kiện lý tưởng( khô mát tối) lọ môi trường có thể được nhất 5 năm,
kể từ khi sản xuất
3.4.2 đối với môi trường đã pha chế
- Bảo quàn trong túi băng chất dẻo nhiệt độ 4-10°C các ống môi trường có Thể đẻ được từ 1-2 tháng
- Nếu ở nhiệt độ phòng chỉ được 1-2 tuần
Tài liệu thâm khảo :
1 Kỹ thuật cơ bản và đảm bảo chất lượng trong xét nghiệm vi sinh y học – NXB Y Học- 2008
2 Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh – Viện vệ sinh dịch tễ trung ương
Trang 62 KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
2.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
2.1.1 các môi trường cơ bản
+ môi trường cấy vi khuẩn ưa khí
- lọc qua giấy lọc để loại mỡ
- them nước cất vào cho đủ 1000ml
Có thể dùng ngay, nếu muốn để dành thì đóng chai hấp khử trùng 110độ c trong 30 phút
Để giảm thể tích có thể làm nước thịt 1/1( 1 kg thịt với 1 l nước) khi dùng sẽ pha đôi 1 phần nước thịt, 1 phần nước cất
Nước thịt tốt phải có từ 500 – 600 mg axitamin trong 1 lít
Nước thịt là môi trường cơ sở đẻ pha chế canh thang thường, thạch thường v.v
canh thang thường
Pha chế từ nước thịt bò
- nước thịt bò 1000ml
- peptone bột 10g
- muối tinh khiết (NACL) 5g
- đun nóng khuấy đều cho tan hết muối và peptone
- điều chỉnh ph 7,8 – 8 bằng dung dịch NAOH
- hấp 120 độ c trong 30 phút và để nguội cho lắng cặn
- chắt lấy phần nước trong, điều chỉnh PH 7,4 – 7,6
- đun sôi lại rồi lọc qua giấy lọc cho trong
- đun nóng, khuấy đều cho tan hết các chất
- điều chỉnh ph 7,4-7,6 rồi lọc trong
- đóng ống 16mm, mỗi ống 5ml, hấp khử trùng 110độc trong 30phut
Canh thanh thường dùng để cấy các loại vị khuẩn ưa khí nói chung, thường dùng để kiểm tra vô khuẩn
Trang 7- đun nóng nước thịt, peptone, muối cho tan
- điều chỉnh ph từ 7,8-8 bằng dung dich NAOH 20%
- cho thạch đã rửa sạch, cắt nhỏ vào
- hấp 120độ c trong 30 phút
- kiểm tra lại ph xem đã đạt yêu cầu chưa 7,4-7,6
- lọc qua bong gạc khi môi trường còn nóng rồi phân phối vào bình cầu 250ml hoặc vào ống nghiệm mỗi ống từ 5-6ml
- hấp 110độ c trong 30 phút, các ống nghiệm phải để nằm nghiêng cho thật đôngPha chế từ cao thịt bò
đóng ống nghiộm mỗi ống 5,6 ml hoặc binh cầu 250 ml
Hấp khử trùng 110°c trong 30 phút, đem ra để ống môi trường nằm nghiêng cho thạch dông
Môi trường làm từ cao thịt thì tinh khiết hơn nước thịt tươi nên không phải qua giai đoạn hẩp lắng cặn 120°c trong 30 phút
Thạch thường là môi trường cơ sở để chế ra nhiều loại môi trường khác
canh thang glucoza 1%
- Canh thang thường1000 ml
Trang 82.1.Môi trường cấy vi khuẩn kị khí.
2.1.1.Canh thang V.F (Thịt-Gan, Viandc Foỉc) :
- Thịt bò xay
- Gan bò xay
- Pcpsin hiệu giá 5o0
- Axít clohydric nguyên chất
- Nước cất nóng 600C
Cho tất cà vào nồi men, để tủ ấm 48-50°C trong 18 giờ, cứ 2 giờ khuấy một lần, sau đó đem đun sôi từ từ lên 80°c trong 20 phút để hủy mcn pepsin Diều chỉnh pH = 7,4, lọc và hấp 120°c trong 30 phút
Cứ một lít môi trường trên thêm vào 2g glucoza, lọc trong, đóng vào ống co, mỏi ống cho
1 bi thủy linh Hấp 110°c trong 15 phút
Chú ý : Nếu không có pcpsin, thì có the thay lOg pcpsin hằng 2000g dạ dày lợn băm nhỏ.
- Trước khi dùng nên đun sôi cách thủy ống môi trường đê làm mất không khí có thể sinh ra trong môi trường trong quá trình bào quản
2.1.2.- M ôi trường thịt băm :
Thịt bò đã ép hết nước, cho vào chai rộng miệng, đậy nút bông gạc, hấp 120°c trong 30
phút Bảo quản ở 4°c Trước khi dùng phải luộc bã thịt trong nước cất, ép hết nước thừa và
cho vào mỗi ống môi trường độ 0,5g
- Môi trường gan cục:
- Canh thang V.F (pH = 7,4) 12ml
- Gan bò luộc chín thái nhỏ hạt lựu 0,5g Đóng vào ống nghiệm Hấp 110°c trong
30 phút
Trang 9Gan bò cỏ khả năng khử oxy trong môi trường.
2.1.3.Thạch Veillon (Vây-ông) :
- Thạch thường 1 lít
- Kalinitrat 0,5 g
Đun sôi thạch, cho glucoza và kali nitrat vào Lắc đều rồi lọc
phân phối vào mỗi ống 15ml (nếu ống có đường kính nhỏ 8mm thì cho vào 7 ml)
Hấp 110°c trong 20 phút Để ống thẳng đứng cho thạch đông
không để nghiêng Trước khi dùng phải tái sinh bằng cách đun sôi cách thủy 10 phút
+ Môi trường dùng nuôi cấy chung cho vi khuần ưa khí và ki khí
2.1.4 Môi trưòng thiognicolat:
đun nóng để hòa lan các chất, trừ glucoza, thiognicolat và rcsazurin Riêng L-cyslin hòa
lan trong ít nước cất có pha thêm 5 - 6ml dung dịch natri hydroxyt 10% rồi đồ vào hỗn hợp trên
Kiềm hóa pH = 8 - 8,2 bằng natri hiydroxyt
Đun sôi 5 - 1 0 phút, khuấy đều cho tan hết thạch rồi bù nước vào cho đủ thể tích ban đầu; thêm glucoza, thioglycolat,
Lọc qua 2 lăn giấy lọc hoặc qua vải
Điều chỉnh ph = 7,2 - 7,3, thêm rcsa/urin
đóng ống lOml.hấp khử trùng 110°c trong 30 phút
Hiệnn nay tại nhiều phòng thí nghỉệm lớn trên thế giới môi trường thioglycolat được dùng
đẻ thử vô trùng các chế phẩm sinh vật học và dược phẩm để tìm các vi khuần ưa khí và kị khí
Chú ý:
- Môi trường không đề quá 7 ngày ở nhiệt độ phòng
Trang 10- Nếu là môi trường mới pha thì không phải đun lại
Trước khi dùng, nếuu môi trường đã để 2 - 3 ngày thì phải đun lại
Môi trường không được dùng nếuu nó đã trở nên hồng và mầu hồng không mất di khi đun sôi
b/ CÁC MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP :
+ Môi trường phân lập vi khuẩn ưa khí
7- Môi trường phân lập tụ cầu :
Môi trường Chapman (Sápman)
Hòa tan đỏ phcnol trong nước căt nóng 70°c, lọc qua giấy lọc, đựng lọ nút kín
2« môi trường phân lập liên cầu và phế cầu:
Thạch máu:
- Thạch thường 150 ml
- Máu thỏ hoặc cừu 15 ml
Đun cho thạch tan chảy ra, để nguội 50°c, thêm máu đá loại tơ huyết và vô khuẩn vào bình thạch Quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạc Màu thạch đỏ tươi là tốt Nếu màu ngả đen là máu đã quá chín Đóng ngay vào ống nghiệm l8mm bằng pipete vô khuần, mỗi ống 10 ml
Thạch máu có Gentainyxin :
Cách làm như thạch máu nhưng có thêm gêntamyxin 5 mcg trong 1 ml môi trường
- 3- Môi trường phân lộp não mô cầu và lậu cầu :
Canh thang máu.
Một ống canh thang thường + 15-20 giọt máu thỏ hoặc cừu vô khuẩn
Thạch máu Sôcôla (Chocolate) :
Làm như thạch máu rồi đun cách thủy 80°c trong 10 phút Chú ý lắc tròn bình thạch luôn
để nguội 45 - 50°c đồ đĩa
4- Môi trường phân lập Pasteurella tularensis :
Trang 11' Máu cừu hoặc huyết thanh 2 ml
Cho các dung dịch hóa chất vào bình thạch đun cho tan hết để nguội 45 – 500 c, cho thêm máu cừu hoặc huyết thanh lắc đều tránh nổi bọt, đổ ra đĩa hoặc đóng vào ống nghiệm
Chú ý : lượng tím gentian không cho quá qui định trên vì sẽ ức chế các loại vỉ khuẩn, kề cả
vi khuẩn dich hạch không mọc được
- Môi trường phân ìập Brucella:
6-Môi trường phân lập Hacmophilus:
Thạch máu Socola có bacitraxin.
Làm như thạch máu socola có thêm bacitraxỉn 300 mcg trong 1 ml môi trường
7- Môi trường phân lập vi khuẩn đường ruột:
Các vi khuẩn đường ruột lẩy từ các bệnh phẩm trước khi đưa vào phân lập cần cấy truyền qua một số môi trường vận chuyển bảo quản và môi trường tăng sinh
+ Môi trường vận chuyền và bảo quản
Môi trrờng Cary - Bỉair:
Trang 12- Nước muối sinh lí 8,5%0 2000 ml
Điều chỉnh pH = 8 với dinatriphotíat (Na2HPƠ4) Hấp khử trùng 110°c trong 30 phút.Dung dịch đệm glyxcrin dùng đề vận chuyển Salmonclla, Shigclla, E.Coli Không dùng cho Vibrio và Campylobacter
+ Môi trường tăng sinh :
Môi trường Mueller - KauỊf mann.
Chuẩn bị các dung dịch.
- Dung dịch I: Canh thang thường 90 ml
Canxi cacbonat 5 g
Cho canxi cacbonal vào bình cầu có canh thang Hấp 110°c trong 30 phút
- Dung dịch II : Natri hyposun if 50g
- Dung dịch IV: Xanh brilỉan (Vert Briỉỉiant) Nước cất
Cho Xanh brilỉan vào cối, nghiền nhỏ, đồ dần nước cất vào khuấy cho tan
0,1 g 100 ml hết
Pha môi trường hoàn chinh.
Trong bình cầu đựng dung dịch I, dùng ống hút lấy lOml dung dịch II, 2 ml dung dịch III,
1 ml dung dịch IV, lắc đều, đề lắng cặn 24 giờ, sau đó đóng vào ống nghiệm, mỗi ống 5 ml
Môi trường này có tác dụng hạn chế phần lớn các tạp khuằn và thích hợp cho Salmonella phát triền Từ môi trường này sẽ cấy truyền qua các môi trường đặc như ss, Endo để có khuần lạc riêng biệt Muốn tìm Shigella thì cấy thẳng vào các môi trường đặc nói trên, không cần qua môi trường Mueller KauíTmann