Luận án tiến sĩ nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Một số nghiên cứu đã được tiếnhành về quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cá bằng cách sử dụng enzyme; cácnghiên cứu tập trung vào việc cải thiện mức độ thủy phân để cải thiện hoạt

KHOA NÔNG NGHIỆP

ĐẶNG MINH HIỀN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME

PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2021

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÃ NGÀNH: 62.54.01.01

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME

PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

NGHIÊN CỨU SINH ĐẶNG MINH HIỀN MSNCS: P1114001

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN CÔNG HÀ

LỜI CẢM ƠN

Luận án nghiên cứu được hoàn thành tại bộ môn Công nghệ thực phẩm,khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ Để hoàn thành được luận án nàynhờ vào sự nỗ lực của chính tác giả và sự giúp đỡ vô cùng quý báo của giáoviên hướng dẫn, các thầy cô, Cơ quan công tác, Công ty Caseamex, Công ty

CP thủy sản Đại Đại Thành, Công ty 404, gia đình và bạn bè

Tôi thật lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

PGs Ts Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, Trao đổi, động viên vàgiúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.Quý thầy, cô bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinhhọc Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức trong suốt quátrình học tập

Các cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và phòng thínghiệm Sinh học đất, bộ môn Khoa học đất đã tạo điều kiện cho tôi hoànthành luận văn

Quý Công ty GEPIMEX 404, Công ty CP thủy sản Đại Đại Thành,Caseamex đã tạo điều kiện cho tôi có được nguyên liệu để làm thí nghiệm vàhoàn thành luận văn

Cám ơn tất cả bạn bè, anh chị em lớp cao học Công nghệ thực phẩm khóa

19, 20, 21, các em sinh viên đại học Công nghệ thực phẩm khóa 38, 39 đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Đặc biệt, cám ơn gia đình và quý thầy cô đã ủng hộ, động viên, khích lệ

và cũng là điểm tựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian học tập

Xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2021

Nghiên cứu sinh Đặng Minh Hiền

TÓM TẮT

Cá tra dầu (Pangasius hypophthalmus) được biết đến là một trong những mặt hàng

xuất khẩu chủ lực của Việt Nam với phi lê là sản phẩm chính của ngành chế biến cátra được ưa chuộng tại nhiều quốc gia trên thế giới Một số nghiên cứu đã được tiếnhành về quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cá bằng cách sử dụng enzyme; cácnghiên cứu tập trung vào việc cải thiện mức độ thủy phân để cải thiện hoạt độngchống oxy hóa của chúng; nghiên cứu quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cátra bằng cách sử dụng nhiều protease và động học thủy phân Cho đến nay, chưa cóthông tin nào về việc thủy phân thịt vây và máu cá tra bằng các enzym protease(bromelain, papain, neutrase) để ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật Ngoài ra, nghiên cứunày là nghiên cứu đầu tiên cho thấy động học thủy phân của các enzyme này trên hai

cơ chất và xu hướng thay đổi của hàm lượng acid amin trong quá trình thủy phânprotease liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật Vì vậy, nghiên cứu ứng dụngenzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụnglàm môi trường nuôi cấy vi sinh vật đã được thực hiện với ba nội dung bao gồm: (1)Nội dung 1: tách hàm lượng mỡ trong thịt dè cá, tiến hành thí nghiệm thủy phân trênphụ phẩm thịt dè cá bằng các enzyme bromelain, papain và neutrase, dung dịch thủyphân đem sấy phun thu sản phẩm bột protein thủy phân; (2) Nội dung 2: các thửnghiệm được thực hiện tương tự như nội dung 1 trên phụ phẩm máu cá tra; (3) Nội

dung 3: tiến hành nuôi cấy vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc

Aspergillus oryzae) trên các môi trường là sản phẩm tối ưu của thử nghiệm thủy phân

protein thịt dè cá và máu cá

Sau quá trình thực hiện, nghiên cứu đã ghi nhận các kết quả như sau: (1) Nộidung 1: kết quả cho thấy phụ phẩm thịt dè cá tra được tách béo bởi dung dịchNaHCO3 ở nồng độ 0,2%, có khả năng tách béo tốt nhất, hiệu suất thủy phâncủa các enzyme hiệu quả ở tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất là 2,25 mgenzyme (mgE)/1,17 g protein (gPro) đối với enzyme bromelain, 1,5mgE/1,17gPro đối với enzyme papain và 0,625 mgE/0,975 gPro đối vớienzyme neutrase; bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân tyrosin và đạm amin bằngenzyme bromelain ở thời điểm 240 phút tương ứng 65,25% và 71,02%, củaenzyme papain là 57,74% và 67,22%, enzyme neutrase là 42,69% và 52,51%;hàm lượng acid amin tự do tăng theo thời gian thủy phân đồng thời bởi 3enzyem, lượng acid amin tự do thủy phân bromelain > papain > neutrase (2)Nội dung 2: Đối với phụ phẩm máu cá tra được tách béo bởi dung dịchNaHCO3 ở nồng độ 0,2%, có khả năng tách béo tốt nhất; hiệu suất thủy phâncủa các enzyme hiệu quả ở tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất là 2,1 mgenzyme (mgE)/0,69 g protein (gPro) đối với enzyme bromelain, 1,2mgE/0,598 gPro đối với enzyme papain và 0,7 mgE/0,690 gPro đối với

enzyme neutrase; bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân tyrosine và đạm amin bằngenzyme bromelain ở thời điểm 240 phút tương ứng 95,93% và 75,65%, củaenzyme papain là 76,62% và 70,91%, enzyme neutrase là 59,17% và 63,65%.Hàm lượng acid amin tự do tăng theo thời gian thủy phân đồng thời bởi 3enzyme, lượng acid amin tự do thủy phân bromelain > papain > neutrase (3)Nội dung 3: Các sản phẩm thủy phân từ thịt dè và máu cá tra đã được sử dụng

làm môi trường dinh dưỡng nuôi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc

Aspergillus oryzae cho thấy hiệu quả tốt hơn so với môi trường peptone

thương mại thông qua đường cong tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợpprotease của các vi sinh vật này trên các môi trường thử nghiệm

Từ khóa: bromelain, papain, neutrase, phụ phẩm cá tra, thủy phân, dịch thủy

phân protein.

Catfish (Pangasius hypophthalmus) is known as one of the mainly export

products of Vietnam with fillets being the main product of pangasiusprocessing, which is popular in many countries around the world A fewstudies have been conducted on the enzymatic hydrolysis of fish by-productsusing enzyme; the studies were focusing on improving degree of hydrolysis inorder to improve their antioxidant activity; study the hydrolysis of channelcatfish by-products by using multiple proteases and hydrolysis kinetics Untilnow, no information has been reported on hydrolysis of fin meat and blood ofcatfish by protease enzymes (bromelain, papain, neutrase) for application ofcultural microorganism In addition, this study is the first to show hydrolysiskinetics of enzymes on two substrates and the acid amin content patternchanges during protease hydrolysis connecting to develope of microorganism.Therefore, the study on the application of protease enzyme in processinghydrolyzed protein powder from pangasius by-products used as microbialculture medium was carried out with three contents including: (1) Content 1:defatted in fish fin meat, hydrolysis experiment was proceeded on catfish by-products by enzymes bromelain, papain and neutrase, the hydrolysate wasspray-dried to obtain hydrolyzed protein powder; (2) Content 2: the tests wereperformed similarly to content 1 on catfish blood by-product; (3) Content 3:

Culturing microorganisms (Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae) on the

media was the optimal product of the experiment of hydrolysis of protein finmeat and fish blood

After the conducted experiment, the research has recorded the followingresults: (1) Content 1: the results showed that pangasius belly by-productswere defatted by NaHCO3 solution at a concentration of 0,2%, possibly fatseparation the best; the hydrolysis efficiency of enzymes were effective at theenzyme mass to substrate ratio is 2,25 mg enzyme (mgE)/1.17 g protein (gPro)for bromelain enzyme, 1,5 mgE/1,17gPro for papain enzyme and 0,625mgE/0,975 gPro for neutrase enzyme; besides, the hydrolysis efficiency oftyrosin and amino proteins by bromelain enzyme at 240 minutes to 65,25%and 71,02%, of papain enzyme to 57,74% and 67,22%, enzyme neutrase to42,69% and 52,51%, corresponding; free amino acid content increases withhydrolysis time at all three enzyems, free amino acid hydrolyzed bybromelain>papain>neutrase (2) Content 2: For pangasius blood by-product,which was defatted by NaHCO3 solution at a concentration of 0.2%, has thebest ability to separated fat; the hydrolysis efficiency of enzymes reachedoptimation at the enzyme and substrate mass ratio to 2,1 mg enzyme

(mgE)/0,69 g protein (gPro) of bromelain enzyme, 1,2 mgE/0,598 gPro ofpapain enzyme and 0,7 mgE/0,690 gPro of neutrase enzyme; beside that, thehydrolysis efficiency of tyrosin and amino proteins by bromelain enzyme at

240 minutes, respective to 95,93% and 75,65%, the papain enzyme to 76,62%and 70,91%, the enzyme neutrase to 59,17% and 63,65% The content of freeamino acids increases with the hydrolysis time simultaneously by 3 enzymes,the amount of free amino acids hydrolyzed by bromelain> papain> neutrase.(3) Content 3: Hydrolyzed products from pangasius belly and pangasius blood

were used as a nutrient medium for strains of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae, which showed better efficiency than comercial peptone through growth and protease

biosynthesis of these microorganisms on test media

Keywords: bromelain, papain, neutrase, catfish by-product, hydrolyzate,

Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae

LỜI CAM ĐOANLuận án “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột proteinthủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật”được tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS NguyễnCông Hà, khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.

Tôi xin cam kết các kết quả, số liệu luận án này được hoàn thành dựatrên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưađược dùng cho bất cứ công trình nào khác

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iv

DANH SÁCH BẢNG xii

DANH SÁCH HÌNH xiii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xv

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của luận án 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 4

1.3 Nội dung nghiên cứu 5

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5

1.5 Ý nghĩa của luận án 5

1.6 Điểm mới của luận án 6

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

2.1 Tổng quan về ngành cá tra 7

2.2 Giới thiệu về nguyên liệu cá tra 8

2.2.1 Giới thiệu chung 8

2.2.1.1 Đặc điểm phân loại cá tra 8

2.2.1.2 Đặc điểm sinh học của cá tra 10

2.2.2 Thành phần hóa học 11

2.2.3 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá tra phi lê 11

2.2.4 Việc xử lý phụ phẩm cá tra hiện nay 11

2.3 Tổng quan về protein 12

2.4 Tổng quan về enzyme 15

2.5 Enzyme bromelain 17

2.5.1 Đặc điểm của enzyme bromelain 17

2.5.2 Cấu tạo của enzyme bromelain 17

2.5.3 Hoạt tính của enzyme bromelain 19

2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain 20

2.6 Enzyme papain 21

2.6.1 Đặc điểm của enzyme papain 21

2.6.2 Cấu tạo của enzyme papain 21

2.6.3 Hoạt tính của enzyme papain 23

2.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme papain 25

2.7 Enzyme neutrase 26

2.7.1 Đặc điểm của enzyme neutrase 26

2.7.2 Cấu tạo của enzyme neutrase 26

2.7.3 Đặc điểm phân tử neutrase 27

2.8 Động học của enzyme 27

2.9 Cơ chế thủy phân của enzyme protease 32

2.10 Các Phương pháp loại bỏ lipid 33

2.11 Giới thiệu về công nghệ sấy phun 34

2.12 Giới thiệu về vi sinh vật 34

2.12.1 Tổng quan về Bacillus subtilis 36

2.12.2 Tổng quan về Aspergillus oryzae 38

2.13 Một số nghiên cứu thủy phân protein thủy sản 41

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

3.1 Phương tiện nghiên cứu 45

3.1.1 Thời gian và địa điểm 45

3.1.2 Nguyên vật liệu 45

3.1.3 Dụng cụ và hóa chất 45

3.1.3.1 Dụng cụ 45

3.1.3.2 Hóa chất 46

3.2 Phương pháp nghiên cứu 46

3.2.1 Phương pháp phân tích 46

3.2.2 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 48

3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm 48

3.3.1 Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm cá tra 48

3.3.1.1 Xác định thành phần hóa học của dè cá tra 48

3.3.1.2 Xác định thành phần hóa học của máu cá tra 49

3.3.2 Nội dung 1: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm thịt dè cá tra 49

3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO 3 49

3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme ngoại bào 50

3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme ngoại bào 53

3.3.3 Nội dung 2: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm máu cá tra 56

3.3.3.1 Thí nghiệm 4: Xác định hiệu suất thu hồi máu cá bằng nhiệt độ, pH và thời gian 56

3.3.3.2 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3 57

3.3.3.3 Thí nghiệm 6: Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân máu cá tra bằng 3 enzyme ngoại bào 58

3.3.2.3 Thí nghiệm 7: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá bằng 3 enzyme ngoại bào 60

3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật 64

3.3.3.1 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật 64

3.3.3.2 Thí nghiệm 9: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật 67

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71

4.1 Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm cá tra 71

4.2 Nội dung 1: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm thịt dè cá tra 72

4.2.1 Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3 72

4.2.2 Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme ngoại bào 73

4.2.3 Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme protease 77

4.2.3.1 Hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosin sinh ra 77

4.2.3.2 Hiệu suất thủy phân đạm amine bằng phương pháp OPA 82

4.2.3.3 Hàm lượng acid amin trong quá trình thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme protease (bromelain, papain và neutrase) 85

4.3 Nội dung 2: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm máu cá tra 89

4.3.1 Kết quả nghiên cứu thu hồi protein từ nước rửa máu cá tra 89

4.3.2 Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3 90

4.3.3 Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân máu cá tra bằng 3 enzyme ngoại bào 90

4.3.4 Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá bằng 3 enzyme ngoại bào 93

4.3.4.1 Hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosin sinh ra 93

4.2.3.2 Hiệu suất thủy phân đạm amine bằng phương pháp OPA 98

4.4 Sấy phun dịch thủy phân 100

4.4 Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật 102

4.4.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật 102

4.4.1.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis 102

4.4.1.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae 105

4.4.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật 107

4.4.2.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis 107

4.4.2.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae 109

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 112

5.1 Kết luận 112

5.2 Kiến nghị 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

PHỤ LỤC 121

PHỤ LỤC A CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN TÍCH 121

1 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 121

2 Xác định hàm lượng chất béo 121

3 Phương pháp xác định hàm lượng đạm 123

4 Xác định hàm lượng tyrosine theo phương pháp Anson cải tiến 124

5 Phương pháp xác định hàm lượng tyrosin tổng 128

6 Xác định hàm lượng đạm amine bằng phương pháp OPA (AOAC., 2000)

128

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 130

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 130

1 Thủy phân thịt dè cá bằng enzyme ngoại bào 130

B.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein thịt cá 135

B2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 đến hàm lượng protein và protein thịt cá 136

B.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein máu cá 138

3 Thủy phân máu cá bằng enzyme papain 155

4 Thủy phân máu cá bằng enzyme bromelain 159

PHỤ LỤC C: PHIẾU PHÂN TÍCH ACID AMIN 175

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của thịt cá tra phi lê (Theo căn bản khô) 11

Bảng 2.2: Phần trăm phần thu được trong chế biến cá tra phi lê 12

Bảng 2.3: Thành phần axit amin của papain 21

Bảng 2.4: Tính chất vật lí của papain 23

Bảng 4.1: Thành phần hóa lý của thịt dè cá tra và máu cá 71

Bảng 4 2: Thành phần các acid amin (mg/100 mL) của phụ phẩm thịt dè tra và máu cá tra 72

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein 73 Bảng 4.4Thông số động học của các enzyme 74

Bảng 4.5: Thành phần acid amin (mg/100 mL) trong quá trình thủy phân bằng enzyme neutrase theo thời gian 86

Bảng 4.6: Thành phần acid amin (mg/100 mL) trong quá trình thủy phân bằng enzyme papain theo thời gian 87

Bảng 4.7: Thành phần acid amin (mg/100 mL) trong quá trình thủy phân bằng enzyme bromelain theo thời gian 88

Bảng 4 8: Ảnh hưởng của nồng độ NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein 90 Bảng 4 9: Thông số động học của các enzyme 91

Bảng 4 10: Sản phẩm sấy phun của các dung dịch thủy phân 100

Bảng 4 11: Thành phần hóa học cơ bản của sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra và pepton thương mại 101 Bảng 4 12: Thành phần acid amin của các dung thủy phân sau khi sấy phun 101

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2 1: Cá tra 9

Hình 2 2: Cấu trúc protein từ bậc 1 tới bậc 4 14

Hình 2 3: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain 18

Hình 2 4: Cấu trúc không gian của enzyme bromelain 18

Hình 2 5: Cấu trúc không gian của enzyme papain 22

Hình 2 6: Phản ứng của enzyme papain 25

Hình 2 7: Thể hiện năng lượng hoạt hóa có và không có chất xúc tác 28

Hình 2 8: Mô hình “khóa và chìa khóa” 29

Hình 2 9: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng 30

Hình 2 10: Đồ thị thể hiện phương trình Lineweaver-Burke 32

Hình 4.1: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme bromelain trên thịt dè cá tra 75 Hình 4.2: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme papain trên thịt dè cá tra 75

Hình 4.3: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme neutrase trên thịt dè cá tra 76 Hình 4 4: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain 78

Hình 4.5: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian 78

Hình 4 6: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme papain 79

Hình 4 7: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian 80

Hình 4.8: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme neutrase 81

Hình 4.9: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian 82

Hình 4 10: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian 83

Hình 4 11: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian 83

Hình 4 12: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian 84

Hình 4 13: Đồ thị hiệu suất thu hồi protein tại nhiệt độ 700C, thời gian (40, 50, 60 phút), pH (4, 4,5, 5, 5,5 và 6) 89

Hình 4 14: Đồ thị thể hiện vmax, km của enzyme bromelain trên cơ chất máu cá tra 91 Hình 4 15: Đồ thị thể hiện vmax, km của enzyme papain trên cơ chất máu cá tra 92 Hình 4 16: Đồ thị thể hiện vmax, km của enzyme neutrase trên cơ chất máu cá tra 92

Hình 4 17: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thờigian thủy phân máu cá tra bằng enzyme bromelain 94

Hình 4 18: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzymebromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian 94

Hình 4 19: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thờigian thủy phân máu cá tra bằng enzyme papain 95

Hình 4 20: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzymepapain theo tỉ lệ E/S và thời gian 96

Hình 4 21: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thờigian thủy phân máu cá tra bằng enzyme neutrase 97

Hình 4 22: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzymeneutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian 97

Hình 4 23: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng

enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian 98

Hình 4 24: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng

enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian 99

Hình 4 25: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng

enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian 99

Hình 4 26: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong

môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại.102

Hình 4 27: Hoạt tính protease của vi khuẩn B.subtilis trong các môi trường

dinh dưỡng thịt dè và môi trường peptone thương mại 104

Hình 4 28: Đường cong tăng trưởng của Aspergillus oryzae trong các môi

trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại 105

Hình 4 29: Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae trong các môi trường

thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại 106

Hình 4 30: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn B.subtilis trong các môi

trường thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại 107

Hình 4 31: Hoạt tính protease của vi khuẩn B.subtilis trong các môi trường

thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại 108

Hình 4 32: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn Aspergillus oryzae trong các

môi trường thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại 109

Hình 4 33: Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy

phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại 110

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TMAO: Trimethylamin oxid

TMA: Trimethylamin

EDTA: Ethylendiamin tetraacetic acid

EGTA: Ethylene glycol tetraacetic acid

DE: Equivalent dextrose, đương lượng dextrose

E/ S: Enzyme/ substrate (tỉ lệ enzyme trên cơ chất)

Ttp/ Tt: Tyrosin thủy phân / tyrosin tổng

DH: Degree hydrolysis, hiệu suất thủy phân

aw: Độ hoạt động của nước

Vmax: Vận tốc cực đại của enzyme

Km: Hằng số tốc độ phản ứng của enzyme

gPro: Khối lượng protein

gTyr: khối lượng tyrosin

OPA: 0-phthaldialdehyde

TNBS: Trinitrobenzene sulphonic acid

SDS: Sodium dodecyl sulphate

DTT: Dithiothreitol

APS: Amonium persulphat

TEMED: Tetramethylethylenediamine

TCA: Tricloacetic acid

CFU/ g: Số khuẩn lạc trên 1 gam

KPH: Không phát hiện

mgN/ gNL: Khối lượng Nitơ/ khối lượng nguyên liệu

pH stat: Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân protein

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án

Nhiều quốc gia trên thế giới coi ngành công nghiệp cá là trụ cột của nềnkinh tế của họ với sản lượng hàng năm khoảng 140 triệu tấn, trong đó khoảng

80% được dành cho tiêu dùng của con người (Benfteres et al., 2012) Người ta

ước tính rằng 1 tỷ người phụ thuộc trực tiếp hoặc gián tiếp vào ngành hàng chếbiến và xuất khẩu cá (Oosterveer, 2008) Tuy nhiên, trong quá trình chế biếncho thấy các sản phẩm phụ từ cá chưa được sử dụng hết bao gồm đầu, da, thịtvụn, vây, nội tạng và trứng cá, chiếm hơn 60% tổng sinh khối Phụ phẩm chếbiến cá là nguyên liệu cá còn sót lại từ quá trình xử lý sơ bộ của quá trình sản

xuất (He et al., 2013) Trong hầu hết các trường hợp, những phụ phẩm từ cá này bị loại bỏ mà không có ý định thu hồi (Halim et al., 2016) Hơn nữa, việc

loại bỏ các sản phẩm phụ của cá có tác động sinh thái lớn và cũng ảnh hưởngđáng kể đến khả năng kinh tế của ngành đánh bắt và nuôi trồng thủy sản Cácbiện pháp kỹ thuật bắt buộc phải sử dụng phụ phẩm từ cá làm nguyên liệu để

sản xuất các hợp chất có giá trị gia tăng (Morales-Medina et al., 2016).

Trong những năm qua, nghề nuôi cá tra ở Việt Nam phát triển nhanhchóng góp phần vào việc nâng cao thu nhập của người nuôi và đồng thời sảnphẩm cá tra cũng là một trong những mặt hàng chiếm tỷ trọng cao trong xuấtkhẩu thủy sản Theo số liệu thống kê của vasep từ năm 2015 đến 2019 sảnlượng cá tra liên tục tăng Năm 2015, Việt Nam xuất khẩu cá tra đạt 1,565 tỷUSD đến năm 2018, tăng lên 2,261 tỷ USD Tính đến ngày 19/11/2019, diệntích thả nuôi là 7.127 ha (tăng 2.086 ha bằng 41,3% so với cùng kỳ năm 2018),diện tích thu hoạch là 5.412 ha (tăng 1.669 ha bằng 44,6% so với cùng kỳ năm2018) Sản lượng thu hoạch đạt 1.072.677 tấn (giảm 84,323 tấn giảm 0,7% sovới cùng kỳ 2018) Tính đến tháng 9/2019, tổng diện tích nuôi cá tra áp dụngVietGAP khoảng 2.000 ha, áp dụng GAP khác (GlobalGAP, ASC, BAP…),đạt 1.900 ha (https://www.fistenet.gov.vn)

Bên cạnh việc nuôi trồng và xuất khẩu cá tra tăng nhanh, quá trình chếbiến cá tra thành sản phẩm đông lạnh xuất khẩu chỉ sử dụng 1/3 khối lượngnguyên liệu đầu vào, phần còn lại thải ra như đầu xương cá, da cá, dè cá, mỡ

cá, bao tử cá, thịt vụn cá, máu cá đây là những phụ phẩm chứa rất nhiều cácthành phần có giá trị dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học, dầu ăn, gelatin,phân bón lá, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm Nếu sản lượng nguyên liệu cátra 1 triệu tấn/năm thì có khoảng 600.000 tấn phụ phẩm Phần phụ phẩm sauchế biến cá tra phi lê chiếm khoảng 60-65% tổng khối lượng nguyên liệu, lànguyên liệu đầu vào cho chế biến bột phụ phẩm cá tra, những phụ phẩm này

bao gồm đầu, xương, da và thịt vụn còn lại sau khi phi lê hai bên đã được xaytươi, luộc chín và loại bỏ dầu, sau đó sấy khô để sản xuất phụ phẩm cá da trơn.Trong quá trình này, một lượng lớn nước thải chế biến được thải ra ngoài, đặcbiệt ở các nhà máy quy mô nhỏ, không có hệ thống máy móc hiện đại để sửdụng trong quá trình xử lý và thải ra môi trường bên ngoài, dẫn đến lãng phítài nguyên gây ô nhiễm môi trường (Nguyen Thi Thuy and Nguyen Cong Ha,2017) Do đó, phụ phẩm về cơ bản được coi là chất thải phải được xử lý, nếukhông sẽ gây ô nhiễm môi trường Những sản phẩm phụ này có thể là mộtnguồn giá trị gia tăng lớn như protein, axit amin, collagen, gelatin, dầu và

enzym (Ghaly et al., 2013) Các sản phẩm phụ (chủ yếu là đầu và khung

xương) là một nguồn protein tuyệt vời (42,7% protein, db) có giá trị dinhdưỡng cao và nó có thể được chế biến thành các sản phẩm hoặc thành phầnthực phẩm có giá trị gia tăng với các giá trị chức năng và dinh dưỡng mong

muốn (Pal and Suresh, 2016; Tan and Chang, 2018; Tan, Gao, Chang, Bechtel

and Mahoud, 2019).

Hơn nữa, tới 10-20% (w/w) tổng lượng protein cá có thể được tìm thấytrong các sản phẩm phụ của cá Ngoài ra, hàm lượng protein thô của phụ phẩm

cá thay đổi từ 8 đến 35% (Sila and Bougatef, 2016) Để thu hồi protein và

peptid từ các sản phẩm phụ của cá, một số phương pháp như thủy phân bằngaxit hoặc kiềm, tự phân và thủy phân bằng enzym đã được phát triển Cácprotein cá không thủy phân không có các đặc tính này do khả năng tiếp cận

kém với trình tự peptid chức năng (Ghaly et al., 2013; Kim and Wijesekara,

2010) Gần đây, một số tác giả đã tinh chế sản phẩm thủy phân từ cá và đã báocáo chuỗi peptid có hoạt tính sinh học khác nhau như chất chống oxy hóa (Ahn

et al., 2014; Cai et al., 2015; Chi et al., 2015a, b), hoạt tính hạ huyết áp

(Intarasirisawat et al., 2013), hoạt động kháng khuẩn (Ennaas et al., 2015),

hoạt động giải phóng cholecystokinin (Cudennec và cộng sự 2008), và chốngtăng sinh (Picot et al., 2006) Mặt khác, sản phẩm thủy phân protein được chếbiến từ các bộ phận nội tạng của cá chứa nhiều peptid có đặc tính dinh dưỡng

và chức năng tốt hơn Chất lượng của sản phẩm thủy phân protein nội tạngdạng sấy phun chiết xuất từ chất thải chế biến cá tra bằng phương pháp xử lýbằng enzym và hóa học đã được nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng của chúngđến năng suất, thành phần hóa học, màu sắc và các đặc tính chức năng (Md

Aman Hassan et al., 2018).

So với thủy phân hóa học, thủy phân bằng enzym được ưa chuộng hơn

do một số ưu điểm, chẳng hạn như điều kiện phản ứng nhẹ, sản phẩm khôngmong muốn thấp, chất lượng và sản phẩm cao Hơn nữa, nó là một quá trình

cụ thể với việc kiểm soát dễ dàng mức độ thủy phân cũng như cho phép giữ lại

giá trị dinh dưỡng của protein nguồn Ưu điểm chính của quá trình thủy phânprotein bằng enzyme là nó cho phép định lượng aspargine và glutamine và cácchất cặn nhạy cảm khác, thường bị phá hủy bởi quá trình thủy phân bằng acidhoặc kiềm, và không gây ra bất kỳ sự phân hóa nào trong quá trình tiêu hóa

(Ghaly et al., 2013) Trong quá trình này, một số enzyme phân giải protein

thường được sử dụng để thủy phân protein và chuyển chúng thành các sảnphẩm chức năng, sinh học và đặc tính dinh dưỡng có giá trị gia tăng

(Kristinsson and Rasco, 2000; Shahidi et al., 1995) Một số enzym phân giải

protein thường được sử dụng để thủy phân các sản phẩm phụ của protein baogồm: alcalase, papain, pepsin, trypsin, alpha-chymotrypsin, pancreatin,flavourzyme, pronase, neutrase, protamex, bromelain, cryotin F, protease N,

protease A, orientase, thermolysin , và validase (Hsu, 2010; Je et al., 2007; Ngo et al., 2010; Raghavan and Kristinsson, 2008) Sản xuất protein cá thủy

phân thông qua thủy phân bằng enzyme là một cách để tăng thêm giá trị chochất thải cá giàu protein

Do đó, chế biến dịch thủy phân từ phụ phẩm cá tra sẽ giúp tận dụng tốthơn các sản phẩm phụ thường được sử dụng cho ngành công nghiệp thức ănvật nuôi hoặc thức ăn cho cá Nguồn phụ phẩm từ da được thu mua và chếbiến gelatine, collagen như Nhà máy chế biến collagen Vĩnh Hoàn Đồng Tháp,sản phẩm collagen thủy phân sẽ được dùng trong nhiều lĩnh vực như thựcphẩm, mỹ phẩm Vây cá cũng được dùng trong chế biến collagen, ngoài ra vây

và bao tử cá cũng được xuất khẩu hay dùng trong chế biến thức ăn tại các nhàhàng Thịt dè cá tra cũng được sử dụng trong chế biến surimi hay dạng cá viên.Như vậy, những phần trong phụ phẩm cá tra đã được tận dụng nhưng cũng chỉ

sử dụng không quá 30% tổng số phụ phẩm Việc sử dụng các thành phần phụphẩm khác như máu cá, thịt vụn, protein từ đầu hay xương cá chưa được quantâm Nguồn phụ phẩm này chủ yếu được đem đi sơ chế, sấy khô làm bột cádùng trong thức ăn chăn nuôi là chủ yếu Những nguồn phụ phẩm này là rấtlớn, nếu không được xử lý thì môi trường nhanh chóng bị ô nhiễm Có thể nói,việc sử dụng phụ phẩm cá tra chưa thật sự hiệu quả, đây chính là thực trạnghiện nay của công nghiệp sản xuất các sản phẩm có giá trị từ cá tra Như vậy,việc xử lý phụ phẩm cá tra hiệu quả, kinh tế và thân thiện với môi trường ngàycàng trở nên cấp thiết

Sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm của cá được sự chú ý ngàycàng nhiều trong những năm gần đây Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện đểđánh giá các điều kiện thủy phân và các tính chất chức năng của sản phẩmthủy phân protein cá Chẳng hạn, một số nghiên cứu đã báo cáo việc thủy phâncác sản phẩm phụ của cá bằng enzyme để thu hồi các thành phần có giá trị (Je

et al., 2007; Safari et al., 2009; Renhoran et al., 2011) Các enzyme phân giải

protein như alcalase, pepsin, papain, flavozyme và bromelain, đã được sử dụng

trong quá trình thủy phân cá (Kristinsson and Rasco, 2000a, 2000b) Enzyme

papain được dùng thủy phân protein cá, protein thủy phân ở mức độ trung bình

được sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật (Dufosse et al., 1997).

Enzyme papain và bromelain đã được sử dụng để cải thiện giá trị dinh dưỡngcủa thức ăn và chiết xuất men Chúng cũng đã được sử dụng trong việc tạo

hương vị, màu sắc và trong sản xuất môi trường vi sinh (Sumantha et al.,

2006)

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về thu hồi và tận dụng nguồnprotein phụ phẩm từ quá trình chế biến cá tra, đánh giá động học của một sốenzyme protease trên cơ chất phụ phẩm cá tra, nghiên cứu sử dụng enzymethủy phân protein phụ phẩm cá tra và thử nghiệm các đặc tính sinh học của sảnphẩm thủy phân,…( Yuqing Tan, Sam K C and Chang Shi Meng, 2019; Tam

Dinh Le Vo et al., 2016) Tuy nhiên, chưa có thông tin nào về việc thủy phân

thịt vây và máu cá tra bằng các enzym protease (bromelain, papain, neutrase)

để ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật Ngoài ra, nghiên cứu này là nghiên cứu đầutiên cho thấy động học thủy phân của các enzyme này trên hai cơ chất và xuhướng thay đổi của hàm lượng acid amin trong quá trình thủy phân proteaseliên quan đến sự phát triển của vi sinh vật Do vậy, nghiên cứu ứng dụngenzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sửdụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật là hướng đi đúng và cấp thiết

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung: Sản xuất bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra bằngenzyme ngoại bào nhằm tăng thêm giá trị cho phụ phẩm cá tra giàu protein,góp phần tạo nên một giải pháp thay thế mới đầy hứa hẹn và thân thiện vớimôi trường Tận dụng hiệu quả và sử dụng thành công nguồn phụ phẩm nàylàm protein thủy phân giúp tăng lợi nhuận và góp phần phát triển bền vữngngành nuôi trồng, chế biến thủy sản

Mục tiêu cụ thể: khảo sát động học của quá trình thủy phân bằng enzymebromelain, papain và neutrase trên cơ chất protein phụ phẩm thịt dè và máu cátra, và nghiên cứu các đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân ứng dụnglàm môi trường thay thế peptone trong nuôi cấy vi sinh vật Nghiên cứu nàycung cấp thông tin kỹ thuật mới quan trọng để lựa chọn protease và các điềukiện chế biến để tối ưu hóa hiệu quả, từ phụ phẩm cá tra sử dụng phương phápthủy phân bằng enzyme với mục tiêu sử dụng các phụ phẩm này như nguồnpeptone cho vi sinh vật sinh tổng hợp

1.3 Nội dung nghiên cứu

Luận án nghiên cứu các nội dung cơ bản sau:

- Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm thịt dè cá tra và máu cá tra

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt và pH đến quá trình thu hồi protein máu cá tra

- Khảo sát khả năng tách béo phụ phẩm thịt dè và máu cá tra bằng

NaHCO3.

- Khảo sát điều kiện thủy phân protein: nồng độ enzyme/cơ chất theo thời gian thủy phân

- Ứng dụng các chế phẩm protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra làm

nguồn dinh dưỡng đạm nuôi cấy vi sinh vật (nấm mốc Aspergillus oryzae và

vi khuẩn Bacillus subtilis).

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là phụ phẩm cá tra (thịt dè cá tra vàmáu cá tra) từ quy trình chế biến cá tra phi lê đông lạnh, để tạo ra bột proteinthủy phân giàu đạm Phạm vi nghiên cứu là xác định thành phần hóa lý phụphẩm cá tra và sử dụng ba enzyme thương mại thủy phân protein từ phụ phẩmtạo ra dung dịch đạm có hàm lượng dinh dưỡng cao, được sấy phun tạo ra bộtđạm, dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

1.5 Ý nghĩa của luận án

- Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu cho biết các thông số động học, thời gianthủy phân hiệu quả của các enzyme bromelain, papain và neutrase trên cơ chất thịt dè

và máu cá tra Nghiên cứu đã cho thấy phụ phẩm cá tra (thịt dè và máu cá) được thủyphần bằng enzyme thương mại có hiệu quả khi dùng để nuôi cấy

vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus oryzae Bên cạnh đó, việc

sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm này và sử dụng như nguồn peptonetrong nuôi cấy vi sinh vật cho thấy giải pháp này là sự lựa chọn phù hợp để tận dụnghiệu quả nhất nguồn phụ phẩm thịt dè, máu cá tạo ra bởi ngành công nghiệp chế biến

cá tra phi lê

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở bước đầu chonghiên cứu ở quy mô lớn hơn trong thu nhận và ứng dụng protein thủy phân từ phụphẩm cá tra, qua đó nâng cao giá trị cho nguồn nguyên liệu này, đồng thời giảm tácđộng xấu đến môi trường

1.6 Điểm mới của luận án

Luận án nghiên cứu sử dụng ba enzyme thương mại thủy phân proteinphụ phẩm thịt dè và máu cá tra tạo ra sản phẩm có giá trị về dinh dưỡng sửdụng như nguồn peptone nuôi cấy vi sinh vật Kết quả nghiên cứu tạo thêmnhững hướng đi mới là sản xuất sản phẩm protein thủy phân từ thịt dè và máu

cá tra, tạo ra sản phẩm dinh dưỡng như một nguồn peptone Nghiên cứu quátrình thủy phân protein từ phụ phẩm này bằng ba loại enzyme bromelain,papain và neutrase góp phần cung cấp thêm các thông tin về động học của quátrình thủy phân và góp phần mở ra một hướng đi mới trong việc thu hồiprotein phụ phẩm và nâng cao giá trị phụ phẩm protein Mặt khác, nghiên cứulàm giảm đáng kể chi phí xử lý phụ phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trường,đồng thời cải thiện và nâng cao giá trị thương mại của phụ phẩm cá tra

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về ngành cá tra

Vùng hạ lưu sông Mê Kông, nhất là các quốc gia như Campuchia, Lào,Thái Lan và Việt Nam có nhiều loài cá da trơn phân bố, trong đó có hai giống

chính là giống Pangasius với mười loài và giống Pangasianodon với một loài.

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có hai loài cá da trơn là cá basa và cá tra.Trước đây, cá tra giống được bắt tự nhiên trong mùa cá bột chảy theo dòngsông Mê Kông thuộc Campuchia và Việt Nam, nhất là những nơi tiếp giáp củacác dòng sông Tonle Sap, sông Tiền và sông Hậu Cá tra giống nhân tạo lầnđầu tiên được cung cấp đến cho người nuôi là vào năm 1996 Hiện nay, nghềnuôi cá da trơn ở ĐBSCL tập trung chủ yếu vào loài cá tra với năng suất, sảnlượng nuôi rất cao và trở thành loài cá nước ngọt chủ lực của Việt Nam, trong

đó vùng ĐBSCL chiếm gần như 100% Vì thế nghề nuôi cá tra của Việt Namchính là nghề nuôi cá tra của ĐBSCL Cá tra được nuôi dưới hình thức trong

bè và trong ao Các vùng nuôi cá tra tập trung nhiều ở những nơi có điều kiện

tự nhiên thuận lợi như dọc các sông lớn, đặc biệt là sông Tiền, sông Hậu vàcác cồn trên sông vì trao đổi nước ao dễ và nhiều bằng thủy triều hay bơm(Nguyễn Thanh Phương và Nguyễn Anh Tuấn, 2016) Khí hậu ấm áp quanhnăm ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho phép có thể thả giống cá nuôivào bất kỳ thời gian nào trong năm Chi phí sản xuất thấp là yếu tố quan trọngtạo ra sự gia tăng sản lượng cá nhanh chóng khi các cơ hội về thị trường được

mở ra Hầu hết cá tra sau khi nuôi được chế biến dưới dạng phi lê đông lạnhtrước khi đến tay người tiêu dùng cuối cùng Các tỉnh nuôi cá tra và basa ởĐBSCL đều có doanh nghiệp chế biến thủy sản gắn với các làng bè và ao nuôi

cá Ngành cá tra từng có giai đoạn phát triển mạnh, đem lại lợi nhuận cao chongười nuôi, các doanh nghiệp chế biến và đem lại hàng tỷ USD kim ngạchxuất khẩu cho đất nước Nuôi và chế biến cá tra xuất khẩu từng được xem làngành sản xuất có sự tăng trưởng cao trong lịch sử phát triển ngành thủy sản

Cá tra được xuất khẩu nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới Cá trađược đánh giá có chất lượng cao, cơ thịt dai, mùi vị thơm ngon, nhiều chấtdinh dưỡng tốt cho sức khỏe và có thể chế biến nhiều loại thức ăn Năng suất

cá tra có thể đạt tới 300-400 tấn/ha chỉ trong 7-8 tháng nuôi với các loại thức

ăn có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật nên giá thành sản xuất rẻ Cá tra ViệtNam vẫn là loài cá cung cấp trên 90% nhu cầu tiêu thụ cá da trơn trên thế giới,đây là lợi thế cạnh tranh đặc biệt để sản phẩm cá tra nâng cao giá trị và ngành

cá tra hoạt động hiệu quả trong những năm tới Trên cơ sở những nỗ lực vàthành quả của phía Việt Nam về việc tổ chức nuôi cá tra theo hướng có tráchnhiệm, giảm thiểu tối đa tác động xấu đến môi trường, đến các nhân viên của

doanh nghiệp và cộng đồng dân cư xung quanh thông qua chứng nhận ASC,quỹ bảo tồn động vật hoang dã thế giới (WWF) đã đưa cá tra vào “danh mụcxanh” trong cẩm nang hướng dẫn tiêu dùng ở Châu Âu để khuyến khích ngườitiêu dùng khu vực này lựa chọn cá tra trong thực đơn hàng ngày Đồng thời,Chính phủ cũng ban hành Nghị định 55/2017/NĐ-CP ngày 9/5/2017 về nuôi,chế biến và xuất khẩu sản phẩm cá tra, cùng với việc thành lập Hiệp hội cá traViệt Nam sẽ là động lực để cơ cấu, sắp xếp lại ngành hàng cá tra mang tínhchuyên nghiệp hơn, cân bằng giữa sản xuất nguyên liệu và xuất khẩu, tạo điềukiện để ngành cá tra phát triển ổn định, hiệu quả và bền vững.

2.2 Giới thiệu về nguyên liệu cá tra

2.2.1 Giới thiệu chung

2.2.1.1 Đặc điểm phân loại cá tra

Cá tra là một trong số 10 loài thuộc họ cá Pangasiidae đã được xác định

ở sông Cửu Long Hệ thống phân loại của loài cá tra được xác định như sau:

Giới: AnimaliaNgành: ChordataNgành phụ: VertebrataLiên Bộ: SiluriformesHọ: Pangasiidae Bleeker, 1858Giống: Pangasianodon Chervey, 1931Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) Các đồng danh của cá tra:

Helicophagus hypophthalmus (Sauvage, 1878) Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878) Pangasius Pangasius (non Hamilton, 1822) Pangasius pleurotaenia (non Sauvage, 1878) Pangasius sutchi (Fowler, 1937)

Ở nước ta những năm trước đây, khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột

và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu Cá trưởng thành chỉ thấy trên aonuôi, rất ít gặp trong tự nhiên Việt nam đã thành công trong sinh sản nhân tạo cá tragiống và chủ động được nhu cầu về giống cho nghề nuôi cá thương phẩm

Cá tra là một trong những loài cá có giá trị kinh tế phổ biến ở Đồng bằngsông Cửu Long Đây là loài cá có kích thước lớn, dễ nuôi, tăng trọng nhanh.Hiện nay cá tra có nguồn gốc sinh sản nhân tạo đã được thả nuôi ổn định và làmột trong những đối tượng nuôi trồng thủy sản đang được phát triển với tốc độnhanh tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Năng suất nuôi cá tra rất cao,trong ao đạt tới 60-70 tấn/ha, trong bè có thể đạt tới 100-300 kg/m3 nước bènuôi Tập trung nhiều tại An Giang và Đồng Tháp và là một trong những loài

cá có giá trị xuất khẩu cao

Cá tra ngoài tự nhiên phân bố ở những sông, hồ, kênh, rạch, mương vùngnước ngọt, sống ở các thủy vực nước tĩnh và nước chảy

* Hình thức nuôi: Thâm canh, bán thâm canh với các mô hình nuôi bè,

ao hầm

Thông thường thì một vụ nuôi kéo dài khoảng 6-8 tháng, nếu thả cá nhỏ thìthời gian thu hoạch dài hơn (khoảng 10 - 12 tháng) Kích thước thu hoạch khoảng30-40 cm, khi thu hoạch dùng lưới bắt bớt cá, sau cùng tát cạn thu toàn bộ.

* Vận chuyển: Cá được vận chuyển đến nhà máy chế biến bằng thuyềnthông thủy, ở đầu thuyền, đuôi thuyền và ở mạn thuyền có lỗ thông cho nước ra vào tự

do để kéo dài thời gian sống của cá Để tăng hiệu quả vận chuyển nên ít dừng lại dọcđường nhưng nếu cần đỗ lại thì đỗ ở những nơi nước sạch và nước chảy với tốc độ nhỏnhất là 0,5 m/giây, không để thuyền phơi nắng, tốc độ thuyền nhỏ hơn 4 km/giờ đểtránh cho cá khỏi va đập vào thành thuyền hạn chế cá bị chết vì cá sống là nguyên liệuchế biến lý tưởng nhất Vì vậy, khi vận chuyển nguyên liệu cần tìm mọi biện pháp đểvận chuyển tốt nhất Hiệu quả vận chuyển cá sống là do lượng oxy hòa tan trong nướcquyết định, nếu lượng oxy quá thấp sẽ làm cho cá ngạt thở

2.2.1.2 Đặc điểm sinh học của cá tra

* Hình thái sinh lý:

Cá tra là cá da trơn thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, có

2 đôi râu dài Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống ở vùng nướchơi lợ, chịu đựng được nước phèn với pH ≥ 5 Dễ chết ở nhiệt độ thấp ≤ 15oC nhưngchịu nóng tới 39oC Cá tra có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí

và da nên chịu đựng được môi trường thiếu oxy hòa tan, cá có ngưỡng oxy thấp có thểsống được trong môi trường nước ao tù

Cá hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫnnhau ngay trong bể ấp, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau trongđáy vớt cá bột Chúng ăn các loại phù du động vật có kích thước vừa cỡ miệngchúng Khi cá lớn tính ăn tạp thiên về động vật và dễ chuyển đổi loại thức ăn.Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức

ăn bắt buộc như mùn, bã hữu cơ và động vật đáy

Cá tra có tốc độ sinh trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng nhanh

về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10-12 cm (14-15g/con) Từ khoảng 2,5 kg trở đi mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăngchiều dài cơ thể Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cátrong tự nhiên 18 kg/con hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m Nuôi trong ao một năm

cá đạt 1-1,5 kg/con Những năm sau cá tăng trọng nhanh hơn có khi đạt tới 5-6kg/con/năm Tùy môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như

loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hoặc ít Độ béo của cá tăng dần theotrọng lượng và nhanh nhất ở những năm đầu Cá đực thường có độ béo caohơn cá cái và độ béo thường giảm đi khi vào mùa sinh sản.

* Đặc điểm sinh sản:

Cá tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cái tuổi thứ 3 trở lên Mùa sinhsản tự nhiên vào đầu tháng 5 âm lịch Trong điều kiện nuôi vỗ tốt cá tra có thểtham gia sinh sản vào đầu tháng 4 dương lịch

2.2.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học gồm: nước, protein, lipid, muối vô cơ, vitamin,

Các thành phần này thay đổi phụ thuộc vào giới tính, điều kiện sinh sống,

Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và

các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học

Thành phần khối lượng đầu xương chiếm khoảng 33 - 36%, da và vây cáchiếm tỉ lệ 6 - 8%, nội tạng chiếm 11 - 13% Phần thịt cá khoảng 45 - 48% cho

tỉ lệ cao nhất khi so với các thành phần khác Xét về thành phần hóa học, cá tra

có độ ẩm dao động từ 79 - 81%, hàm lượng protein trung bình là 71% (theocăn bản khô), lượng chất béo trong thịt cá là 12,92% (theo căn bản khô) Đốivới cá tra có khối lượng lớn hơn 1.000 g/con có lượng lipid khá cao 22,29%tính theo căn bản khô (Huỳnh Văn Lam, 2008)

2.2.3 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá tra phi lê

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của thịt cá tra phi lê (Theo căn bản khô)

2.2.4 Việc xử lý phụ phẩm cá tra hiện nay

Sản phẩm chủ yếu của cá tra là ở dạng phi lê, cá tra nguyên con sau khiqua các công đoạn và đi đến công đoạn thành phẩm thì hiệu suất thu hồi chỉ đạtkhoảng 38,6% dạng phi lê được trình bày ở Bảng 2.2 (Nguyen Phuoc Minh,

2014), 61,4% còn lại là phụ phẩm bao gồm thịt dè, đầu, xương, da, nội tạng,

… chiếm một khối lượng tương đối lớn

Bảng 2.2: Thành phần khối lượng cá tra

Trước đây, phụ phẩm của cá tra phi lê chủ yếu dùng để sản xuất thức ăn,giá trị kinh tế tương đối thấp Trong thời gian gần đây, một số doanh nghiệpthu mua phụ phẩm cá tra về sản xuất các sản phẩm có giá trị kinh tế hơn Hiệnnay, đã tạo ra được những sản phẩm giá trị gia tăng từ những phần phụ phẩmcủa con cá tra như mỡ cá sản xuất dầu ăn có DHA, xăng sinh học, da sản xuất

da cá chiên giòn, collagen, máu cá sản xuất bột protein huyết bổ sung thức ănchăn nuôi, một số khác dùng làm thực phẩm như bao tử cá, bong bóng cá, ức

cá, dè cá,… Tuy nhiên, việc chế biến phụ phẩm vẫn còn hạn chế và vẫn chưaphát huy hết tiềm năng vốn có của phụ phẩm cá tra Quá trình thủy phânprotein từ phụ phẩm cá tra là xu hướng mới đang được quan tâm

Về phân loại, protein có thể được phân loại dựa vào tính đồng thể(homoprotein và heteroprotein) hay dựa vào chức năng của chúng trong các bộphận, các cơ quan sinh học (protein cấu trúc, protein chức năng và protein dựtrữ) Enzyme là những protein chức năng Bên cạnh các protein chỉ có các acidamin trong thành phần (protein đơn giản), còn có một số loại protein phức tạpkhác như: Phosphoprotein, chứa các gốc ester với phosphoric acid (như casein,phosvitin của lòng đỏ trứng), glycoprotein, chứa một hoặc nhiều

monosaccharide hoặc oligosaccharide trong thành phần như một số proteintrong lòng đỏ và lòng trắng trứng, collagen của các mô liên kết, serum ở một

số loài cá (Hoàng Kim Anh, 2007)

Về cấu trúc không gian, protein được phân thành 4 loại (Hình 2.2)như sau:

- Cấu trúc bậc một: Cấu trúc bậc một của protein được hiểu là số lượng

và trình tự các acid amin trong mạch polypeptide Các mạch này có hai đầu terminal (-COOH) và N-terminal (-NH2), trong đó gốc amin luôn ở bên trái

C Cấu trúc bậc hai: Cấu trúc bậc hai của protein là sự sắp xếp không giantương ứng với mạch polypeptide Các cấu trúc bậc hai đã biết chủ yếu của protein làcấu trúc xoắn α và cấu trúc tấm xếp gấp β-sheet Khả năng tạo cấu trúc xoắn, cấu trúctấm xếp gấp hoặc không tạo cấu trúc này phụ thuộc vào loại acid amin Do đó, có thể

dự đoán cấu trúc không gian cho một chuỗi polypeptide khi đã biết trình tự các acidamin Ngoài ra, nhiều cấu trúc xoắn α và cấu trúc tấm xếp gấp β-sheet có thể kết hợplại với nhau để tạo thành siêu cấu trúc bậc hai, như trường hợp các cuộn xoắn nhỏ nằmtrong một đoạn xoắn lớn hay trường hợp cấu trúc tấm nối tiếp cấu trúc xoắn …

- Cấu trúc bậc ba: Cấu trúc bậc ba của protein tương ứng với sự sắp xếpkhông gian ba chiều của mạch polypeptide có cấu trúc bậc hai ở các đoạn khác nhau.Hai dạng cấu trúc chính bậc ba gồm cấu trúc dạng sợi và cấu trúc dạng hình cầu Cácliên kết trong cấu trúc bậc ba của protein chủ yếu là liên kết hydro và liên kết kỵ nước(hydrophobe) Tuy nhiên, cũng tồn tại cả liên kết tĩnh điện và liên kết disulfide

Hình 2 2: Cấu trúc protein từ bậc 1 tới bậc 4

(Nguồn: Kenneth, 2011)

Về biến tính protein, biến tính là hiện tượng thay đổi thuận nghịch hoặckhông thuận nghịch cấu trúc không gian ban đầu của protein nhưng không làmbiến đổi các liên kết hóa trị trong phân tử (trừ liên kết disulfide) Các liên kết

bị phá vỡ có thể là các cầu hydro, liên kết kỵ nước hoặc liên kết ion Khiprotein bị biến tính, các tính chất của chúng cũng bị thay đổi Hiện tượng biếntính xảy ra khi có mặt tác nhân gây biến tính và phục hồi lại (một phần hayhoàn toàn) các tính chất của protein khi loại bỏ các tác nhân này được gọi là sựbiến tính thuận nghịch Ngược lại, biến tính không thuận nghịch không có khảnăng phục hồi lại các tính chất ban đầu và thường xảy ra khi các cầu disulfide

bị phá vỡ

Khi các protein bị biến tính, chúng dễ bị thủy phân bởi các protease hơnkhi ở dạng chưa biến tính, còn các protein có hoạt tính sinh học như cácenzyme thì thường sẽ bị mất hoạt tính (Hoàng Kim Anh, 2007)

Các tác nhân gây biến tính protein có thể gồm những loại sau:

- Đun nóng: Đun nóng ở nhiệt độ cao sẽ dẫn đến sự phá vỡ các liên kếthydro, làm cấu trúc bậc hai, ba và bốn của protein bị thay đổi Hệ quả là các tính chất

lý hóa học và hoạt tính sinh học đặc hiệu cũng bị thay đổi

- Làm lạnh: Vài enzyme bền ở nhiệt độ phòng nhưng trở nên kém bền ở

0oC như L-threonine deaminase Một số protein cũng sẽ bị biến đổi khi ở nhiệt

độ thấp hoặc ở nhiệt độ đóng băng

- Áp suất: Xử lý áp suất cao có thể dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc bậc bốncủa protein tạo thành các tiểu đơn vị ở áp suất từ 1.000-2.000 bar Các protein cấu tạo

từ một sợi polypeptide sẽ bị mất một phần cấu trúc bậc ba ở áp suất trên 3.000 bar cóthể là do làm yếu tương tác kỵ nước và phá vỡ các cầu muối

- Tác nhân hóa học: Ở pH cực trị, khả năng tích điện của protein bị ảnhhưởng dẫn đến sự giãn mạch Urea và guanidine thì tác dụng lên liên kết hydro vàtương tác kỵ nước Còn các chất tẩy rửa tổng hợp sẽ phá vỡ tương tác kỵ nước và làmtăng xu hướng tháo cuộn Bên cạnh đó, các chất khử (β-mecapto ethanol) phá vỡ liênkết cầu disulfide

Sự biến tính protein thường không thuận nghịch trừ trường hợp tác nhângây biến tính nhẹ hoặc đối với protein có phân tử lượng thấp (Nguyễn Thị ThuThủy, 2009)

2.4 Tổng quan về enzyme

Hầu hết các phản ứng trong tế bào sống đều đòi hỏi sự có mặt của mộtenzyme cụ thể Chúng là những chất xúc tác sinh học có bản chất là protein.Các enzyme này có chức năng xúc tác cho việc tạo ra và phá vỡ các liên kếthóa học Do đó, giống như bất kỳ chất xúc tác khác, các enzyme làm gia tăngtốc độ phản ứng mà không làm thay đổi về mặt hóa học của bản thân nó(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Các enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có những ưu điểm sau:

- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyểnhóa rất cao Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phảnứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo Trong các phảnứng, phản ứng bằng enzyme thì sự tiêu hao năng lượng thường rất ít Enzyme luônluôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn

và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể Các phản ứngxảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme Có nhiều enzymekhông bị mất đi sau phản ứng

Thành phần cấu tạo của enzyme: Enzyme là những protein có phân tửlượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, kích thước nhỏ nhất là ribonuclease12.700 dalton Enzyme được cấu tạo từ các L-α-acid amin kết hợp với nhaubởi liên kết peptide Dưới tác dụng của các peptidehydrolase, acid hoặc kiềm,các enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L-α-acid amin Trong cấu

tạo của enzyme ngoài acid amin còn có những thành phần khác, enzyme được chia thành hai nhóm:

- Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzyme đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo

từ một thành phần hóa học duy nhất là protein

- Nhóm enzyme đa cấu tử (enzyme phức tạp), enzyme có hai thành phần:+ Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme Apoenzyme thường quyết định tính đặc hiệu cao và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme

+ Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”: như ion kim loại,vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của monosacaride,

… Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần “apoenzyme”

(khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì nhữngagon đó còn có tên riêng là coenzyme Phần agon quyết định kiểu phản ứng

mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền củaapoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính

Đa số enzyme đều thuộc loại enzyme đa cấu tử Hiện nay người ta cũng

đã xác định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein cócấu trúc bậc bốn Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân

ly thuận nghịch tạo thành các đơn vị (protome), khi đó hoạt độ của enzyme bịgiảm hoặc bị mất hoàn toàn Ở những điều kiện thích hợp các đơn vị còn lại cóthể kết hợp lại với nhau và hoạt độ xúc tác của enzyme được phục hồi

Tính đặc hiệu của enzyme: Theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn ĐoanDuy (2011), đặc tính quan trọng nhất của enzyme đó là tính đặc hiệu Tính đặchiệu của enzyme là khả năng xúc tác có chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hóamột hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Tính đặchiệu của enzyme được biểu hiện như sau:

- Đặc hiệu phản ứng: kiểu đặc hiệu này biểu hiện đối với cơ chất cómang một loại liên kết hóa học nhất định hay các enzyme chỉ có thể xúc tác cho mộttrong những kiểu phản ứng chuyển hóa cơ chất nhất định

- Đặc hiệu cơ chất: mỗi cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng,enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng Khả năng này cònthấy rõ khi trong quá trình phản ứng tồn tại các dạng đồng phân

2.5 Enzyme bromelain

2.5.1 Đặc điểm của enzyme bromelain

Enzyme bromelain là protein có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từgiữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20 Ở nước ta nghiêncứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 - 1970

Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC 3.4.22.33 được thunhận từ họ bromeliaceae Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưukhác nhau và cấu tạo cũng khác nhau

Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy phânprotein Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl củabromelain thì thu được enzyme thủy phân protein hiệu quả

Enzyme bromelain có trong toàn bộ cây dứa (thân, lá, quả, ) nhưng tậptrung nhiều nhất trong quả dứa Bromelain là enzyme thủy phân protein thànhaxit amin nên tốt cho tiêu hóa, hoạt động được trong môi trường axit của dạdày và môi trường của ruột non Bromelain là một glycosylated protein cótrọng lượng phân tử 24,5 kDa, có 212 axit amin bao gồm 7 cysteines, mộttrong số đó có liên quan đến xúc tác, 6 cái còn lại có liên quan đến cầu nối

disulfua Bromelain được thu nhận bằng phương pháp sắc ký ái lực (Rowan et

al., 1990) Enzyme bromelain có nhiệt độ tối thích từ 50 - 60oC, pH tối thích

từ 6-8,5, cysteine thường sử dụng như một chất kích hoạt cho bromelain(Polaina, 2007)

2.5.2 Cấu tạo của enzyme bromelain

* Cấu tạo hóa học của bromelain

Bromelain thân là glycoprotein gồm phần protein và phần phi protein.Phần phi protein là một glucide, ở mỗi phân tử gồm 3 manose, 1 xylose, 1fructose và 2 glucosamine Glucosamine là phần nối trực tiếp với mạchpolypeptide của phần protein Sợi hydrate carbon liên kết hoán vị vớipolypeptide Trong sợi hydrate carbon này dường như một nửa sợi không liênquan đến cơ chế xúc tác của phân tử Cấu trúc phần carbon hydrate củabromelain thân (Hình 2.3)

Hình 2 3: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelainTùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp thí nghiệm, thành phầnbromelain thân và quả khác nhau Bromelain quả (ép từ quả) là protease acidvới điểm đẳng điện là 4,6, cấu tạo hơi khác so với loại enzyme thân.

Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144acid amin và 283-161 acid amin đối với bromelain quả Các nghiên cứu chothấy polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu -NH2 là valine và đầu -COOH là glycine, còn đối với bromelain quả, acid amin đầu -NH2 là alanine(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

* Cấu trúc không gian (Hình 2.4)

Cấu trúc bậc một của bromelain (Murachi, 1970)

-Ser-Val-Lys-Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Tryp-

-Gly-Cys-Lys-Hình 2 4: Cấu trúc không gian của enzyme bromelain

(nguồn: lifeofbiochem.wordpress.com)

Bromelain cũng như papain, ficin đều là các protease có tâm hoạt độngchứa cystein với cầu nối -S-S- (disulfur) giữa 2 sợi polypeptide với nhau Tâmhoạt động -Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Ao Chuỗi phân tửgấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu Bromelain có một nhóm sulfurhydrylcần cho hoạt tính xúc tác với 5 cầu nối disulfid ở mỗi phân tử Ngoài ra trongbromelain thân còn có sự hiện diện của Zn2+ với hàm lượng 2 mg/g enzymeđóng vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.

* Tính chất vật lýTheo Nguyễn Đức Lượng (2004), tính chất vật lý của enzyme bromelaintrích từ thân cây dứa như sau:

- Khối lượng phân tử: 33.200 - 33.500 Da

2.5.3 Hoạt tính của enzyme bromelain

* Hoạt tính phân giải của bromelainEnzyme bromelain từ quả dứa có hoạt tính kể từ 3 tháng trước khi chín.Trong đó hoạt tính cao nhất là 20 ngày trước khi chín, sau khi chín thì hoạttính của bromelain giảm dần nhưng không mất hoàn toàn Nhiều nghiên cứucho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất khác nhau Nếu

cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papaingấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này làtương đương nhau Đối với cơ chất tổng hợp thì enzyme bromelain phân giảiyếu hơn enzyme papain Enzyme bromelain có 3 hoạt tính khác nhau nhưpeptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain lớn hơn papain

và ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

* Cơ chế tác động của enzyme bromelainHoạt động thủy phân của bromelain được thể hiện thông qua vai trònhóm -SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur Nhóm-SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ

chất Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhómamin của chất nhận khác Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không giancủa bromelain Casein và hemoglobin là hai cơ chất tự nhiên được dùng nhiềunhất Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho rapolypeptide và acid amin Protein kết hợp với nhóm -SH của enzyme làm choprotein bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme,acid amin và peptide.

Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng chúng kết hợp với nhóm -SH củatâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo

liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein nhưamin, carboxyl ) Enzyme-SH + Zn2+ enzyme-S-Zn + H+

Do vậy nhóm -SHtrong trung tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gianđược bảo vệ ổn định

2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), giống như các cấu trúc xúc tác sinhhọc khác, bromelain chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: nồng độ cơ chất,nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháptrích ly, phương pháp tinh sạch,

Ảnh hưởng bởi cơ chất: Trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain cóhoạt tính khác nhau

Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởngbởi nhiều yếu tố, thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổilàm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất,dạng tồn tại của enzyme

Ảnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạttính xúc tác của enzyme pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định

mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất,

độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự hiện diện của chấttăng hoạt pH tối ưu thường nằm trong khoảng pH 5 - 8 tùy cơ chất

Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: Các ion kim loại thường gắn với phân

tử protein tại trung tâm hoạt động, ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác củaenzyme Enzyme bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động

có nhóm -SH, chất hoạt hóa cho bromelain như KCN, thioglycolic acid,cystein, sulfide Vì vậy bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có áilực mạnh hơn nhóm -SH, các tác nhân oxy hóa, halogen hóa, ankyl hóa như

iodoacetate, bromoacetate, clocetophenol, H2O2, methyl bromur Các ion kimloại Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có tính xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain.

2.6 Enzyme papain

2.6.1 Đặc điểm của enzyme papain

Papain (EC 3.4.22.2) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và

được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894) Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có

các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase vàmột số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979) Nhựa đu đủ có hàmlượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổnđịnh quanh năm Papain có khối lượng phân tử 23,4 kDa và có pI = 8,75

2.6.2 Cấu tạo của enzyme papain

* Cấu tạo hóa học

Papain là một endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S Papain là mộtprotease thiol, papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 acid amin, trọnglượng phân tử là 20.900 Dalton (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212acid amin trong đó không có chứa methionine Phân tử lượng khoảng 23.350

Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C làasparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95,153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc

và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25 (Bảng 2.3)

Bảng 2.3: Thành phần axit amin của papain

Leucine 10

* Cấu trúc không gianPhân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36 Ao và mạchchính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằmtại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe

và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn  chiếm 20% toàn bộ cácacid amin có trong phân tử

Hình 2 5: Cấu trúc không gian của enzyme papain

(Kamphuis, 1984)Hoạt tính của papain dựa trên hai hoạt động là cysteine 25 và histidine

159 Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng từ 3,5 - 8,0 tùy thuộc vào cơ

chất Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5,8

- 7,0 và nhiệt độ tối thích là 50 - 57oC (Hình 2.5)

* Cấu trúc tâm hoạt động của papain

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cysteine 25 và nitrogenbậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của histidine 159 cũngliên kết acid aspartic 175 bởi liên kết hydro

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với acid amin là:Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

Chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống nhưcủa ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau

Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys

Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser

* Tính chất vật lí của enzyme papain

Papain có dạng bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương phápsấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong nước

hay glycerin và bền nhiệt (Bảng 2.4)

2.6.3 Hoạt tính của enzyme papain

* Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nóđóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + (HOH)  (-NH-CH(R)-COOH)

i +(H2N- CH(R)-CO-)k (i+k=n)

Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các acid amin:

(H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + (HOH)  (H

2N-CH(R)-COOH)n’ +(H2N-CH(R)-CO-)k’ (n’+k’ = n)

So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật thì papain cókhả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó

có khả năng thủy phân hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline

và các axit glutamic có nhóm carboxyl tự do

Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 acid amin trên cơ chất peptidecủa mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine

như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X,Y,Z là các gốc acid amin) thì

papain sẽ cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có