Ý n hĩa khoa học và ý n hĩa thực tiễn của luận án - Ý nghĩa khoa học: Việc sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm này và sử dụng như nguồn peptone trong nuôi cấy vi sinh vật ch
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Cần Thơ, 2021
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Công Hà
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 Dang Minh Hien, Vo Thi Nhu Lan, Huynh Thi Bich Tran, Nguyen
Thi Cam Tu and Nguyen Cong Ha, 2018 Enzymatic hydrolysis of pangasius belly protein by-product using for
Bacillus subtilis cultivation Can Tho University Journal of
Science, 54, Special issue: 1-7
2 Đặng Minh Hiền, Võ Thị Như Lan, Huỳnh Thị Bích Trân, Ngô
Thảo Trang, Nguyễn Thị Cẩm Tú và Nguyễn Công Hà,
2018 Khảo sát quá trình sử dụng bromelain thủy phân protein máu cá tra sau thu hồi protein từ nước rửa máu cá tra trong chế biến cá tra phi lê và ứng dung nuôi cấy nấm mốc
Aspergillus oryzae Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn, Tháng 8, 117-124 (ISSN 1859-4581)
3 Đặng Minh Hiền, Nguyễn Thị Điều, Lê Ngọc Quyên và Nguyễn
Công Hà, 2020 Sử dụng enzyme papain thủy phân protein
máu cá tra dùng làm môi trường nuôi vi khuẩn Bacillus
subtilis Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn,
Tháng 9, 49-56 (ISSN 1859-4581)
Trang 4CHƯƠNG 1: GI I THIỆU 1.1.Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm qua, nghề nuôi cá tra ở Việt Nam phát triển nhanh chóng góp phần vào việc nâng cao thu nhập của người nuôi và đồng thời sản phẩm cá tra cũng là một trong những mặt hàng chiếm tỷ trọng cao trong xuất khẩu thủy sản Theo số liệu thống kê của vasep từ năm 2015 đến 2019 sản lượng cá tra liên tục tăng Năm
2015, Việt Nam xuất khẩu cá tra đạt 1,565 tỷ USD đến năm 2018, tăng lên 2,261 tỷ USD Tính đến ngày 19/11/2019, diện tích thả nuôi
là 7.127 ha (tăng 2.086 ha bằng 41,3% so với cùng kỳ năm 2018), diện tích thu hoạch là 5.412 ha (tăng 1.669 ha bằng 44,6% so với cùng kỳ năm 2018)
Bên cạnh việc nuôi trồng và xuất khẩu cá tra tăng nhanh, quá trình chế biến cá tra thành sản phẩm đông lạnh xuất khẩu chỉ sử dụng 1/3 khối lượng nguyên liệu đầu vào, phần còn lại thải ra như đầu xương cá, da cá, dè cá, mỡ cá, bao tử cá, thịt vụn cá, máu cá đây là những phụ phẩm chứa rất nhiều các thành phần có giá trị dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học, dầu ăn, gelatin và mỹ phẩm Nếu sản lượng nguyên liệu cá tra 1 triệu tấn/năm thì có khoảng 600.000 tấn phụ phẩm Phần phụ phẩm sau chế biến cá tra phi lê chiếm khoảng 60-65% tổng khối lượng nguyên liệu, đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất ra các sản phẩm giá trị gia tăng Tuy nhiên, chưa có nhiều sản phẩm được sản xuất từ nguồn phụ phẩm này, hiện mới chủ yếu dùng làm nguyên liệu sản xuất bột cá Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật là hướng đi đúng và cấp thiết
1.2 Mục tiêu n hiên c u
Sản xuất bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra bằng enzyme ngoại bào nhằm tăng thêm giá trị cho phụ phẩm cá tra giàu protein, góp phần tạo nên một giải pháp thay thế mới đầy hứa hẹn và thân thiện với môi trường Tận dụng hiệu quả và sử dụng thành công nguồn phụ phẩm này làm protein thủy phân giúp tăng lợi nhuận và góp phần phát triển bền vững ngành nuôi trồng, chế biến thủy sản Nghiên cứu này cung cấp thông tin kỹ thuật mới quan trọng để lựa chọn protease và các điều kiện chế biến để tối ưu hóa hiệu quả, từ phụ phẩm cá tra sử dụng phương pháp thủy phân bằng enzyme với mục tiêu sử dụng các phụ phẩm này như nguồn peptone cho vi sinh vật sinh tổng hợp
Trang 51.3 Nội dun n hiên c u
Luận án nghiên cứu các nội dung cơ bản sau:
- Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm thịt dè cá tra và máu
Aspergillus oryzae và vi khuẩn Bacillus subtilis)
1.4 Ý n hĩa khoa học và ý n hĩa thực tiễn của luận án
- Ý nghĩa khoa học: Việc sản xuất sản phẩm thủy phân protein
từ phụ phẩm này và sử dụng như nguồn peptone trong nuôi cấy vi sinh vật cho thấy giải pháp này là sự lựa chọn phù hợp để tận dụng hiệu quả nhất nguồn phụ phẩm thịt dè, máu cá tạo ra bởi ngành công nghiệp chế biến cá tra phi lê
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở bước đầu cho nghiên cứu ở quy mô lớn hơn trong thu nhận và ứng dụng protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra, qua đó nâng cao giá trị cho nguồn nguyên liệu này, đồng thời giảm tác động xấu đến môi trường
1.5 Điểm mới của luận án
Luận án nghiên cứu sử dụng ba enzyme thương mại thủy phân protein phụ phẩm thịt dè và máu cá tra tạo ra sản phẩm có giá trị về dinh dưỡng sử dụng như nguồn peptone nuôi cấy vi sinh vật Kết quả nghiên cứu tạo thêm những hướng đi mới là sản xuất sản phẩm protein thủy phân từ thịt dè và máu cá tra, tạo ra sản phẩm dinh dưỡng như một nguồn peptone Nghiên cứu quá trình thủy phân protein từ phụ phẩm này bằng ba loại enzyme bromelain, papain và neutrase góp phần cung cấp thêm các thông tin về động học của quá trình thủy phân và góp phần mở ra một hướng đi mới trong việc thu hồi protein phụ phẩm và nâng cao giá trị phụ phẩm protein Mặt khác, nghiên cứu làm giảm đáng kể chi phí xử lý phụ phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời cải thiện và nâng cao giá trị thương mại của phụ phẩm cá tra
Trang 61.6 Bố cục của luận án
- Bố cục của luận án gồm 05 chương với tổng cộng 172 trang, trong đó: Chương 1 Giới thiệu – 06 trang, Chương 2: Tổng quan tài liệu – 36 trang, Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu – 27 trang, Chương 4 Kết quả và thảo luận – 41 trang, Chương 5 Kết luận và kiến nghị – 03 trang, Tài liệu tham khảo – 06 trang, Phụ lục – 55 trang, tổng cộng có 43 hình và 16 bảng
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổn quan về n ành cá tra
Cá tra được nuôi chủ yếu ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang, Long An và Bến Tre,.) Ngành cá tra từng có giai đoạn phát triển mạnh, đem lại lợi nhuận cao cho người nuôi, các doanh nghiệp chế biến và đem lại hàng tỷ USD kim ngạch xuất khẩu cho đất nước Cá tra Việt Nam vẫn là loài cá cung cấp trên 90% nhu cầu tiêu thụ cá da trơn trên thế giới, đây là lợi thế cạnh tranh đặc biệt để sản phẩm cá tra nâng cao giá trị và ngành cá tra hoạt động hiệu quả trong những năm tới
2.2 Giới thiệu về n uyên liệu cá tra
Cá tra là một trong số 11 loài thuộc họ cá tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long
Cá tra có tên tiếng Anh là: Shutchi catfish
Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus
Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá tra phi lê
Thành phần hóa học gồm: nước, protein, lipid, muối vô cơ, vitamin, Các thành phần này thay đổi phụ thuộc vào giới tính, điều kiện sinh sống, Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học
Hàm lượng nước chiếm 72,9%, đạm 60,3%, lipid 26,9%, tro
4,02% và acid amin 53,7% (tính theo căn bản khô) (Trần Minh Phú
và ctv, 2014)
Việc xử lý phụ phẩm cá tra hiện nay
Sản phẩm chủ yếu của cá tra là ở dạng phi lê, cá tra nguyên con sau khi qua các công đoạn và đi đến công đoạn thành phẩm thì hiệu suất thu hồi chỉ đạt khoảng 38,6% dạng phi lê (Nguyen Phuoc Minh, 2014), 61,4% còn lại là phụ phẩm bao gồm thịt dè, đầu, xương, da, nội tạng, … chiếm một khối lượng tương đối lớn
2.3 Tổn quan về protein
Các acid amin ngoài việc tồn tại ở dạng tự do còn kết hợp với nhau thông qua liên kết peptide Tùy thuộc vào số lượng các acid
Trang 7amin trong mạch peptide mà có các dạng khác nhau (di, tri, tetra, oligopeptide) Khi số lượng acid amin trong chuỗi peptide lớn hơn
10 thì được gọi là polypeptide Protein được tạo thành khi số acid amin trong mạch polypeptide đạt khoảng 100 đến trên 900, với khối lượng phân tử từ 10 đến trên 100 kDa
Khi các protein bị biến tính, chúng dễ bị thủy phân bởi các protease hơn khi ở dạng chưa biến tính, còn các protein có hoạt tính sinh học như các enzyme thì thường sẽ bị mất hoạt tính (Hoàng Kim Anh, 2007)
2.4 Enzyme bromelain
Hoạt động thủy phân của bromelain được thể hiện thông qua vai trò nhóm -SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur Nhóm -SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm amin của chất nhận khác Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain Casein
và hemoglobin là hai cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amin Protein kết hợp với nhóm -SH của enzyme làm cho protein bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide
2.5 Enzyme papain
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm -SH ở dạng tự do Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là chất có tính khử như cysteine, glytation acid, hydrocyamic, hydrogensulfite, sodiumthiosulfate, … trong đó cysteine là chất hay dùng nhất, khi có mặt các chất này thì nhóm -SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain
Trang 8Paenibacillus polymyxa là một trong ba loài chỉ sản sinh một
neutrase (Fogarty and Griffin, 1973)
2.7 Độn học của enzyme
Enzyme là một chất xúc tác của các hệ thống sinh học và cực
kỳ hiệu quả Trong thực tế, thông thường một loại enzyme làm tăng tốc độ của một phản ứng lên ít nhất một triệu lần so với tốc độ của một phản ứng mà trong đó không có enzyme Hầu hết các phản ứng sinh học không xảy ra khi không có mặt của các enzyme Một trong những phản ứng sinh học đơn giản được xúc tác bởi một enzyme là hydrat hóa CO2 Chất xúc tác trong phản ứng này là carbonic anhydrase Phản ứng này là một phần của chu kỳ hô hấp là loại bỏ
CO2 ra khỏi cơ thể Carbonic anhydrase là một enzyme có hiệu quả cao, mỗi phân tử enzyme có thể xúc tác hydrat hóa 105 phân tử CO2
trong một giây
2.8 Giới thiệu về côn n hệ sấy phun
Sấy là quá trình sử dụng nhiệt để tách nước ra khỏi mẫu nguyên liệu Trong quá trình sấy nước tách ra khỏi nguyên liệu theo nguyên tắc bốc hơi hay thăng hoa Do đó, hàm lượng chất khô tăng trong một đơn vị nguyên liệu (Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, 2011) Theo Nguyễn Thị Hồng Minh và cộng sự (2011), quá trình sấy phun tiến hành nhanh nên sản phẩm không quá nhiệt giữ được màu sắc và hương vị trong sản phẩm Ứng dụng quá trình sấy phun khi nguyên liệu ở trạng thái lỏng hoặc huyền phù (Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, 2011)
2.9 Giới thiệu về vi sinh vật
Dinh dưỡng vi sinh vật chia thành 5 nhóm lớn: nguồn dinh dưỡng cacbon, ngồn nitơ, nguồn muối vô cơ, chất sinh trưởng và nước Vi sinh vật có tính đa dạng rất cao vì vậy các loại hình dinh dưỡng phức tạp Căn cứ vào nguồn C, nguồn năng lượng, nguồn điện
tử chia thành các loại sau (Bảng 2.3):
Bảng 2.3: Các loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật
Nguồn C Nguồn năn lượng Nguồn điện tử
là ánh sáng
- Dinh dưỡng vô cơ : Dùng các phân tử vô cơ dạng khử để cung cấp điện tử
- Dinh dưỡng hữu cơ : Dùng các phân tử hữ cơ
để cung cấp điện tử
Trang 9hóa hợp (Nguyễn Lân Dũng, 2017)
Môi trường nuôi cấy là các chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển và sản sinh các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật Có hai dạng môi trường : Môi trường thiên nhiên và môi trường tổng hợp
2.10.1 Tổn quan về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là trực khuẩn, có khả năng sinh catalase, hiếu
khí hay kị khí, thường được tìm thấy trong đất có nội bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn Chúng sản sinh ra protease tùy thuộc vào nguồn dinh dưỡng nitơ và nguồn cacbon trong môi trường; thừa hoặc mức nitơ thấp có thể gây ra sự ức chế
sinh tổng hợp protease (M Paul et al., 2006 và Aertsen et al., 2005)
B subtilis là lợi khuẩn chịu được điều kiện môi trường khắc nghiệt,
có khả năng sinh ra enzym tốt và ứng dụng rộng rãi trong y học,
nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm Môi trường nuôi cấy B
subtilis là môi trường Luria-Bertani (LB), triệt trùng 121°C trong 20
phút (Jemil et al., 2014)
2.10.2 Tổn quan về Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae (A oryzae) là một loại nấm sợi, có khả
năng tiết ra một lượng lớn các enzyme thủy phân trong quá trình lên
men ở trạng thái rắn Hơn nữa, A oryzae S có gen rất tốt được đặc
trưng và được coi là một sinh vật an toàn để sản xuất enzyme thực phẩm vì nó không có sự biểu hiện các gen chịu trách nhiệm sản xuất aflatoxin – một chất độc gây ảnh hưởng sức khỏe con người (Nora Khaldi, 2008) Môi trường nuôi cấy thành phần chính gồm: N, C, khoáng
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phươn tiện n hiên c u
3.1.1 Thời ian và địa điểm
- Thời gian: Các thí nghiệm trong luận án được thực hiện từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 6 năm 2020
- Địa điểm: nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm
bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp-Trường Đại học Cần Thơ; xưởng thực hành-Khoa Công nghệ-Trường Đại học Cần Thơ; phòng Chế biến-Trung Tâm Phát Triển Vườn Ươm Công Nghệ Công Nghiệp Việt Nam-Hàn Quốc
Trang 103.1.2 N uyên vật liệu
- Nguồn phụ phẩm dè cá và máu cá tra từ Công ty cổ phần xuất nhập khẩu Cần Thơ (CASEAMEX) bảo quản ở nhiệt độ 4C được vận chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường đại học Cần Thơ Nguyên liệu dè cá được rửa sạch, xử lý nhiệt sơ bộ và máu cá được bảo quản đông ở nhiệt độ -
200C cho đến khi sử dụng làm thí nghiệm
- Vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus oryzae nguồn gốc từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học Trường Đại học Cần Thơ
- Ba enzyme ngoại bào: Bromelain xuất xứ Merck (Đức), papain và neutrase xuất xứ Trung Quốc
3.1.3 Phươn pháp phân tích
- Hàm lượng ẩm: Hàm lượng ẩm trong nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi (AOAC, 2000)
- Hàm lượng lipid: Hàm lượng lipid được phân tích bằng phương pháp Soxhlet (AOAC, 2000)
- Hàm lượng đạm: Xác định hàm lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000)
- Phương pháp thủy phân protein bằng enzyme bromelain, papain và neutrase: Xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Đức Lương, 2003)
- Xác định hàm lượng tyrosine tổng: Thủy phân bằng axit HCl
- Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng vi khuẩn
Bacillus subtilis (CFU/mL) và nấm mốc Aspergillus oryzae bằng
cách sử dụng số lượng khuẩn lạc (Trần Linh Phước, 2006)
- Hoạt tính protease được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Đức Lương, 2003)
Trang 11- Xác định hàm lượng acid amin: Hàm lượng acid amin sản sinh trong quá trình thủy phân được xác định bằng thiết bị sắc ký khối phổ
UPLC-MS/MS theo phương pháp của (Chaimbault et al, 1999)
3.1.4 Phươn pháp đánh iá và xử lý số liệu
Thí nghiệm được tiến hành trên cùng một loại phụ phẩm cá tra được lấy từ các nhà máy chế biến, thí nghiệm được lập lại 3 lần Các
số liệu thu thập được xử lý và vẽ đồ thị bằng phần mềm SAS 9.1.3 Portable và Excel 2010 Tính toán thống kê, kiểm định bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV
3.2 Nội dun bố trí thí n hiệm
3.2.1 Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm cá tra
3.2.1.1 Xác định thành phần hóa học của thịt dè cá tra
* Mục đích: Xác định một số thành phần cơ bản của thịt dè cá
tra, làm cơ sở cho việc nghiên cứu thu nhận protein thủy phân
* Chỉ tiêu theo dõi: Protein tổng số (%), lipit (%) và acid amin
* Kết quả thu nhận: Xác định một số thành phần cơ bản của
thịt dè cá tra làm cơ sở cho việc bố trí các thí nghiệm tiếp theo
3.2.1.2 Xác định thành phần hóa học của máu cá tra
* Mục đích: Xác định một số thành phần cơ bản của máu cá
tra, làm cơ sở cho việc nghiên cứu thu nhận protein thủy phân
* Chỉ tiêu theo dõi: Protein tổng số (%), lipit (%) và acid amin
* Kết quả thu nhận: Xác định một số thành phần cơ bản của
máu cá tra làm cơ sở cho việc bố trí các thí nghiệm tiếp theo
3.2.2 Nội dun 1: N hiên c u thủy phân phụ phẩm thịt dè cá tra 3.2.2.1 Thí n hiệm 1: Khảo sát khả năn tách béo của dun dịch NaHCO 3
* Mục đích: Chọn nồng độ NaHCO3 tách béo tối ưu để tiến hành xử lý nguyên liệu làm cơ chất cho quá trình thủy phân enzyme
Trang 12* Tiến hành thí nghiệm: Nguyên liệu được rửa sạch và tiến
hành xử lý nhiệt sơ bộ ở nhiệt độ 600C Phụ phẩm thịt cá tra sau khi được xử lý nhiệt sơ bộ đem xay nhuyễn bằng máy xay Thịt cá sau khi xay nhuyễn được tách béo bằng dung dịch NaHCO3 ở các nồng
độ 0, 0,1, 0,2 và 0,3% so với dung dịch nước, tỷ lệ nguyên liệu so với dung dịch nước là 1:4 Mẫu thịt dè cá sau khi tách béo bằng dung dịch NaHCO3 được ly tâm lạnh 10 phút ở 8oC với tốc độ 10.000 vòng/phút, phần lắng sau khi ly tâm được rửa lại bằng nước cất với
tỷ lệ 1:4 và ly tâm 5 phút ở 8oC với tốc độ 10.000 vòng/phút để thu
hồi protein Tiến hành phân tích hàm lượng lipid và protein
* Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định hàm lượng lipid và protein sau khi xử lý tách béo ở các nồng độ khác nhau của dung dịch NaHCO3
3.3.2.2 Thí n hiệm 2: Xác định các thôn số độn học v max và k m
thủy phân thịt dè cá bằn 3 enzyme n oại bào
a) Thí n hiệm: Xác định các thôn số độn học v max và k m thủy phân thịt dè cá bằn enzyme bromelain
* Mục đích: Xác định thông số động học vmax, km của enzyme bromelain thủy phân cơ chất phụ phẩm cá tra đã tách béo bằng dung dịch NaHCO3 ở nồng độ tối ưu của thí nghiệm tách béo (cơ chất thủy phân)
* Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm một nhân tố
- Cố định pH=6,5 và nhiệt độ 55oC tối ưu của enzyme
- Cố định nồng độ enzyme bromelain (1,5 mg) và thời gian thủy phân 30 phút
- Nhân tố B: Nồng độ cơ chất (g thịt phụ phẩm cá tra xay đã tách béo bằng dung dịch NaHCO3)
Trang 13ứng bằng TCA 5%, ổn định dung dịch trong 30 phút, sau đó đem lọc Lấy dịch lọc và tiến hành các bước xác định hàm lượng tyrosine sinh
ra theo phương pháp Anson cải tiến
Mẫu đối chứng cũng được tiến hành tương tự nhưng dung dịch TCA 5% được thêm vào ngay trước khi bổ sung enzyme vào cơ chất
* Chỉ tiêu theo dõi
Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra sau khi thủy phân theo phương pháp Anson cải tiến, xác định các thông số động học vmax, km
bằng phần mềm SAS 9.1.3 Portable
b) Thí n hiệm: Xác định các thôn số độn học v max và k m thủy
phân thịt dè cá bằn enzyme papain
* Mục đích: Xác định các thông số động học vmax, km của enzyme papain thủy phân cơ chất phụ phẩm cá tra đã tách béo bằng dung dịch NaHCO3 ở nồng độ tối ưu của thí nghiệm tách béo
* Chỉ tiêu theo dõi: Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra sau
khi thủy phân theo phương pháp Anson cải tiến, xác định các thông
số động học vmax, km bằng phần mềm SAS 9.1.3 Portable
c) Thí n hiệm: Xác định các thôn số độn học v max và k m thủy
phân thịt dè cá bằn enzyme neutrase
* Mục đích
Xác định các thông số động học vmax, km của enzyme neutrase thủy phân cơ chất phụ phẩm cá tra đã tách béo bằng dung dịch NaHCO3 ở nồng độ tối ưu của thí nghiệm tách béo
* Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm một nhân tố
- Cố định pH 6,5 và nhiệt độ 50oC
Trang 14- Cố định nồng độ enzyme neutrase (0,5 mg) và thời gian thủy phân 30 phút
- Nhân tố D: Nồng độ cơ chất (g thịt phụ phẩm cá tra xay đã tách béo bằng dung dịch NaHCO3)
* Chỉ tiêu theo dõi
Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra sau khi thủy phân theo phương pháp Anson cải tiến, xác định các thông số động học vmax, km
* Mục đích: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân tối
ưu của enzyme bromelain
* Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm hai nhân tố
- Nhân tố E, Nhân tố cặp tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất tăng dần tương ứng (E/S)
* Tiến hành thí nghiệm: Cơ chất thủy phân được cân khối
lượng theo tỷ lệ E/S tối ưu như mô tả ở phần nhân tố E, sau đó pha trộn với 10 mL dung dịch đệm phosphate pH 6,5, enzyme bromelain cũng được pha với nồng độ tương tự cặp tỷ lệ E/S Enzyme và cơ chất được ủ trên bể điều nhiệt ở 55oC trong thời gian 30 phút trước khi tiến hành thủy phân Sau khi ủ 30 phút, hút dung dịch enzyme cho vào các bình dung dịch cơ chất và tiến hành thủy phân ở các khoảng thời gian nêu trên Bất hoạt enzyme để kết thúc quá trình phản ứng bằng TCA 5%, ổn định dung dịch trong 30 phút, sau đó
Trang 15đem lọc Lấy dịch lọc và tiến hành các bước xác định hàm lượng tyrosine sinh ra theo phương pháp Anson cải tiến
Mẫu đối chứng cũng được tiến hành tương tự nhưng dung dịch TCA 5% được thêm vào ngay trước khi bổ sung enzyme vào cơ chất
* Chỉ tiêu theo dõi:
- Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra sau khi thủy phân theo phương pháp Anson cải tiến
- Xác định hiệu suất thủy phân theo lượng tyrosine sinh ra
- Xác định hiệu suất thủy phân đạm amin sinh ra
- Xác định hàm lượng acid amin
b) Thí nghiệm: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời ian thủy phân thịt
- Thí nghiệm hai nhân tố
- Nhân tố G, Nhân tố cặp tỷ lệ khối lượng enzyme papain và
cơ chất tăng dần tương ứng (E/S)
* Tiến hành thí nghiệm (Tương tự bromelain)
* Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra sau khi thủy phân theo phương pháp Anson cải tiến
- Xác định hiệu suất thủy phân tyrosine sinh ra
- Xác định hiệu suất thủy phân đạm amin sinh ra
- Xác định hàm lượng acid amin tự do
c) Thí nghiệm: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt
dè cá bằng enzyme neutrase
* Mục đích: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân tối
ưu của enzyme neutrase
* Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm hai nhân tố
Trang 16- Nhân tố I, Nhân tố cặp tỷ lệ khối lượng enzyme neutrase và
cơ chất tăng dần tương ứng (E/S)
* Tiến hành thí nghiệm: (Tương tự bromelain)
Mẫu đối chứng cũng được tiến hành tương tự nhưng dung dịch TCA 5% được thêm vào ngay trước khi bổ sung enzyme vào cơ chất
* Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra sau khi thủy phân theo phương pháp Anson cải tiến
- Xác định hiệu suất thủy phân tyrosine sinh ra
- Xác định hiệu suất thủy phân đạm amin sinh ra
- Xác định hàm lượng acid amin tự do
3.2.3 Nội dun 2: Bố trí thí n hiệm tươn tự nội dun 1 nhưn trên cơ chất là máu cá thủy phân bằn 3 enzyme n oại bào 3.2.4 Nội dun 3: N hiên c u sử dụn protein thủy phân n dụn nuôi cấy vi sinh vật
3.3.4.1 Thí n hiệm 8: N hiên c u sử dụn protein thủy phân thịt
dè cá tra n dụn nuôi cấy vi sinh vật
a) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra
nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis
b) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra
nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
3.3.4.2 Thí n hiệm 9: N hiên c u sử dụn protein thủy phân máu cá tra n dụn nuôi cấy vi sinh vật
a) Thí nghiệm Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra
nuôi cấy khuẩn Bacillus subtilis
b) Thí nghiệm: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra
nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN