Y hai duong NGHIỆM PHÁP VON KAULLA

Nguyên lý Khi huyết tương được pha loãng và acid hoá sẽ làm tủa fibrinogen và các yếu tố hoạt hoá hệ thống tiêu sợi huyết plasminogen hoạt hoá, plasminogen.. Dựa vào tính chất này, người

NGHIỆM PHÁP VON - KAULLA

1 Nguyên lý

Khi huyết tương được pha loãng và acid hoá sẽ làm tủa fibrinogen và các yếu tố hoạt hoá hệ thống tiêu sợi huyết (plasminogen hoạt hoá, plasminogen) Các chất ức chế tiêu sợi huyết và yếu tố VII có trong tủa rất ít Do đó khi tủa này được làm đông, thì cục đông sẽ bị tiêu nhanh hơn nhiều lần so với bình thường Dựa vào tính chất này, người ta tiến hành theo dõi thời gian tiêu của tủa được làm đông để đánh giá mức độ hoạt động của hệ thống tiêu sợi huyết

2 Chuẩn bị

2.1 Dụng cụ:

- Ống nghiệm, pipet, nồi cách thủy, máy ly tâm

2.2 Hóa chất:

- Đệm Michaelis pH 7,35

- CaCl2 M / 10

- Acid acetic 2 %

- Chất chống đông Natri citrat 3,8%

2.3 Bệnh nhân

- Không đang sử dụng các thuốc chống đông

3 Tiến hành kỹ thuật

- Lấy máu và tách huyết tương giàu tiểu cầu: máu tĩnh mạch chống đông bằng Natri citrat 3,8% với tỷ lệ 1/10 Để tự lắng hoặc ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút, tách huyết tương

- Trong ống nghiệm chứa 0,3 ml huyết tương của mẫu chứng hoặc của bệnh nhân, cho vào 3ml nước cất

- Cho thêm vào mỗi ống 1 giọt acid acetic 2%, kiểm tra để có pH = 5,2

- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút Gạn bỏ nước trong, giữ lại phần tủa

- Dùng giấy thấm, thấm khô thành ống

- Cho vào mỗi ống 0,3 ml dung dịnh đệm Michaelis pH 7,35 đã pha loãng 1 /4 trong dung dịch NaCl 0,9 %, dùng que đánh tan tủa

- Cho thêm vào mỗi ống 1 giọt CaCl2 M/10, đặt ống nghiệm vào bình cách thuỷ 370 C, chờ

đông Bấm đồng hồ theo dõi thời gian từ khi đông tới khi tan hoàn toàn

4 Kết quả

- Tan hoàn toàn : trước 15 phút - Tiêu sợi huyết tối cấp

15 - 30 phút - Tiêu sợi huyết nặng

30 - 45 phút - Tiêu sợi huyết vừa

45 - 60 phút - Tiêu sợi huyết nhẹ

Trên 60 phút - Bình thường

5 Các yếu tố ảnh hưởng kết quả

- Không tạo được cục đông do: tiến hành sai kỹ thuật, lượng acid acetic cho không đúng, thấm ống nghiệm không khô

- Chú ý : nếu lượng fibrinogen của huyết tương quá ít, cũng không tạo được cục đông, lúc đó phải làm lại xét nghiệm bằng cách bổ sung vào huyết tương bệnh một lượng fibrinogen

6 lưu ý khi làm xét nghiệm:

Von-Kaulla là một nghiệm pháp dùng để đánh giá mức độ hoạt động của hệ thống tiêu sợi huyết Xét nghiệm được thực hiện bằng cách tạo tủa fibrinogen và các chất hoạt hóa quá trình tiêu sợi huyết (chủ yếu làm plasminogen và t-PA-plasminogen), do đó khi tủa này được làm

đông thì quá trình tan cục đông xảy ra rất nhanh do không có chất ức chế quá trình tiêu sợi

huyết Như vậy quá trình tiêu sợi huyết chỉ dựa trên sự hoạt động của hệ thống tiêu sợi huyết Xét nghiệm này được dùng để đánh giá tình trạng tiêu fibrin tiên phát hoặc thứ phát và phát hiện tình trạng tiêu fibrin tiềm tàng Đồng thời xét nghiệm cũng dùng để theo dõi điều trị tiêu huyết khối Tuy nhiên quy trình thực hiện xét nghiệm này cũng khá phức tạp do có nhiều yếu

tố tham gia vào nên với kinh nghiệm của mình, hôm nay mình sẽ chia sẻ với các bạn các điểm cần lưu ý khi thực hiện xét nghiệm này để đảm bảo kết quả xét nghiệm được chính xác Mình

sẽ tóm tắt từng bước trong quy trình và giải thích cụ thể từng bước để các bạn nắm được chắc

hơn và loại bỏ được các nguyên nhân gây ảnh hưởng

1 Tách huyết tương giàu tiểu cầu:

Hãy nhớ trong xét nghiệm này cần huyết tương giàu tiểu cầu vì cơ chế đông giống như Howell,

do vậy nếu bạn lấy huyết tương nghèo tiểu cầu thì phần sau huyết tương này sẽ không đông

được khi chỉ cho Ca++ do thiếu sự tham gia cầu tiểu cầu Mặt khác nếu bạn tách huyết tương

nghèo tiểu cầu có nghĩa là bạn phải ly tâm vòng cao và như vậy phần lớn fibrinogen bị lắng xuống làm cho nồng độ fibrinogen trong huyết tương giảm đi và cũng không hình thành được fibrin Cách làm như sau:

Lấy máu tĩnh mạch chống đông bằng Natri citrat 3,8% với tỷ lệ 1/10 Để tự lắng tự nhiên hoặc

ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút trong 5 phút, tách huyết tương

2 Pha loãng và acid hóa huyết tương:

Cho vào ống nghiệm 0,3 ml huyết tương ở trên sau đó thêm 3ml nước cất Thêm 1-2 giọt acid acetic 2% để có pH 5,2 Khi pha loãng và acid thế này sẽ hình thành tủa fibrinogen cùng các chất hoạt hóa quá trình tiêu sợ huyết (t-PA-plasminogen) các chất ức chế gần như được loại bỏ trong tủa này Lưu ý là pH phải điều về 5,2 bằng acid nhẹ Nếu bạn dùng các acd mạnh và pH

dưới 5,2 có thể làm biến tính fibrinogen Ngược lại nếu pH > 5,2 thì sẽ không tạo được tủa

hoặc không loai bỏ được các chất ức chế trong tủa

3 Ly tâm và tách tủa

Ở bước này bạn sẽ ly tâm với tốc độ vòng rất cao (khoảng 3000v/phút x 15') để tạo tủa hoàn

toàn Sau đó đổ phần dịch trong Hãy nhớ là đổ dịch trong chứ không hút bằng cách dốc thẳng

ống nghiệm sau ly tâm để đổ dịch trong bên trên đi Nếu bạn hút có thể làm sục tủa này lên

4 Thấm khô ống nghiệm

Bạn dùng giấy thấm để thấm thật khô thành ống nghiệm để loại bỏ hoàn toàn dịch trong Nếu bạn làm không khô thì có thể sẽ còn sót lại các chất ức chế quá trình tiêu sợi huyết Và như vậy khi tủa này được làm đông thì quá trình tiêu cục đông có thể kéo dài do còn chất ức chế

5 Làm tan tủa

Thêm vào 0,3 ml dung dịch đệm Michaelis pH 7,35 đã pha loãng 1 /4 trong dung dịch NaCl 0,9

%, dùng que đánh tan tủa Lưu ý đệm này phải pha loãng 1 phần đệm và 3 phần nước muối sinh lý Nếu chỉ dùng đệm không thì plasminogen không hoạt động được ngược lại nếu không

có đệm pH trung tính thì plasmin lại không hoạt động Và tỉ lệ 1/4 là tối ưu để cả plasminogen

và plasmin hoạt động tốt nhất

6 Làm đông trở lại và xác định thời gian tan đông

Cho thêm vào ống 1 giọt CaCl2 M/10, đặt ống nghiệm vào bình cách thuỷ 370C, chờ đông Bấm đồng hồ theo dõi thời gian từ khi đông tới khi tan hoàn toàn Lúc này cơ chế đông sẽ giống như đông máu trong xét nghiệm Howell Bạn có thể dùng CaC2l M/40 nhưng phải dùng

lượng nhiều hơn, như vậy sẽ bị pha loãng và có thể sẽ không đông hoàn toàn hoặc thời gian đông hoàn toàn lâu hơn Ở đây ta chỉ cần tính thời gian từ khi đông hoàn toàn đến khi tan đông

hoàn toàn nên cần rút ngắn thời gian chờ đông

Tuy nhiên trong một số trường hợp cục đông không thể hình thành do 4 lý do chính sau:

- Thiếu hoặc không có tiểu cầu: Cần ly tâm tốc độ vòng thấp để thu đươc huyết tương giàu tiểu cầu

- Lượng fibrinogen quá ít: Có thể thêm 1 lượng fibrinogen vào huyết tương

- Hệ thống hoạt hóa plasminogen quá mịnh dẫn đến đông đến đâu tan ngay đến đó làm ta không thấy được cục đông: Xử lý bằng cách thêm huyết tương bình thường vào trước khi cho CaCl2, khi đó cục đông hình thành và tan rất nhanh

- Tiêu thụ hết các yếu tố của hệ thống đông máu như trong bệnh lý đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC): Xử lý bằng cách cũng thêm huyết tương bình thường vào, khi đó cục đông hình thành nhưng sau 60 phút vẫn không tan được do đã hết các yếu tố hoạt hóa quá trình tiêu fibrin Trên đây là 6 kinh nghiệm cần lưu ý của mình để có thể làm thành công được nghiệm pháp Von-Kaulla Mình đã làm như vậy và chưa lần nào thất bại Vậy các bạn hãy thử làm và lưu tâm những điểm mình trình bày ở trên xem sao? Nếu có gì bất thường hoặc có thêm kinh nghiệm gì chia sẻ thêm vui lòng phản hồi tại đây cùng mình