Thiết kế đầu dò AND cho kỹ thuật LAI DOT BLOT

BLOT Nguyễn Thị Thu Hường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số 60 42 01 21 Người hướng dẫn: PGS.TS.. Nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, nguyên

BLOT Nguyễn Thị Thu Hường

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số 60 42 01 21

Người hướng dẫn: PGS.TS Võ Thị Thương Lan

Năm bảo vệ: 2013

Abstract Nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, nguyên tắc của kỹ thuật lai axit nucleic,

đầu dò, một số kỹ thuật lai axit nucleic, các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật lai pha rắn, ứng dụng của các kỹ thuật lai axit nucleic Trình bày một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu như: Thiết kế đầu dò; Phương pháp PCR; Quá trình lai điểm; Quá trình lai điểm ngược; Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm; Tách plasmid; Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro; Phương pháp điện di Đưa ra các kết quả nghiên cứu đạt được: Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M; So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG; Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng; Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích và trình tự đối chứng; Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin; Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngược; Kết

quả lai điểm ngược phát hiện đột biến trên gen β-globin

Keywords Di truyền học; Đầu dò; AND; Kỹ thuật lai

MỞ ĐẦU

Ngày nay, chúng ta được sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh chóng Sự tiến bộ của y học hiện đại luôn song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri thức y học và sự phát triển vượt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng Điều này giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về

cơ sở phân tử của bệnh Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ đắc lực trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích Nền tảng về cơ sở học phân tử của bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và ngược lại Xu hướng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lượng mẫu phân tích lớn như: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen Đáng

chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát

triển của phương pháp lai ADN Đây là một kỹ thuật kinh điển nhưng vẫn được sử dụng khá phổ biến nhờ vào những ưu điểm vượt trội như thao tác đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lượng mẫu lớn

và đặc biệt phù hợp với các nước đang phát triển Ở nước ta hiện nay kỹ thuật lai

điểm đã được ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên

quan đến bệnh ung thư cổ tử cung Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chưa được công bố Do đó,

chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với

mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide trong các bệnh lý di truyền Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào,

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội

2 Nguyễn Chấn Hùng (2004), Ung thư học nội khoa, Nhà xuất bản Y học Thành

phố Hồ Chí Minh

3 Nguyễn Thị Tuyết Vân, Nguyễn Hoàng Quân, Cao Minh Nga (2010), "Nhiễm

các type Human Papillomavirus ở phụ nữ tuối sinh đẻ", Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 14 (1), tr 504-508

4 Võ Thị Thương Lan (2009), Giáo trình Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng,

Nhà xuất bản Giáo dục

Tiếng Anh

5 Amann R., Ludwig W (2000), "Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes

for studies in microbial ecology", FEMS Microbiology Reviews, 24, pp

555-565

6 An S F., Franklin D., Fleming K A (1992), "Generation of digoxigenin-labelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase

chain reaction", Moleculer and Cellular Probes, 6, pp 193-200

7 Barbu V (2007), "Molecular hybridization techniques of nucleic acids",

Innovative Romanian Food Biotechnology, 1, pp 1-12

8 Bottari B., Santarelli M., Neviani E., Gatti M (2010), "Natural whey starter

for Parmigiano Reggiano: culture-independent approach", Journal of Applied Microbiology, 108, pp 1676-1684

9 Boussiou M., Karababa P., Sinopoulou K., Tsaftaridis P., Plata E., Loutradi-Anagnostou A (2008), "The molecular heterogeneity of β-thalassemia in

Greece", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 40, pp 317-319

10 Braissant O., Wahli W (1998), "A simplified in situ hybridization protocol

using non-radioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on

tissue sections", Biochemia, 1, pp 10-16

11 Chan V., Yam I., Chen F E., Chan T K (1999), " A reverse dot blot method

for rapid detection of non-deletion α thalassaemia", British Journal of Haematology, 104, pp 513-515

12 Clement G., Benhattar J (2005), "A methylation sensitive dot blot assay

(MS-DBA) for the quantitative analysis of DNA methylation in clinical samplas", J Clin Pathol, 58, pp 155-158

13 Colah R., Gorakshakar A., Nadkarni A, Phanasgaonkar S., Surve R., Sawant P., Mohanty D., Ghosh K (2009), "Regional heterogeneity of β-thalassemia

mutations in the multi ethnic Indian population", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 42, pp 241-246

14 Dawson D B (1990), "Use of nucleic acid probes in genetic tests", Clin Biochem, 23, pp 279-285

15 Dessauer H C., Reeder T W., Cole C J., Knight A (1996), "Rapid screening

of DNA diversity using dot-blot technology and allele-specific oligonucleotides: Maternity of hybrids and unisexual cones of hybrid origin

(Lizards, Cnemidophorus)", Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, pp

366-372

16 Dianandis E P., Christopoulos T K (1991), "The biotin-(strept)avidin

system: Principles and applications in biotechnology", Clinical chemistry, 37,

pp 625-636

17 Dooki M E., Akkhavan-Niaki H., Juibary A G (2011), "Detecting common CFTR mutations by reverse dot blot hybridization method in cystic fibrosis

first report from Northern Iran", Iran I Pediatr, 21, pp 51-57

18 Fernandez J., Sandino A., Yudelevich A., Avendano L F., Venegas A., Hinrichsen V., Spencer E (2009), "Rotavirus detection by dot blot hybridization assay using a non-radioactive synthetic oligodeoxynucleotide

probe", Epidemiol Infect., 108, pp 175-184

19 Forslund O., Hansson B G., Bjerre B (1994), "Typing of human papillomaviruses by consensus polymerase chain reaction and a

non-radioactive reverse dot blot hybridization", Journal of Virological Methods,

49, pp 129-140

20 Fox J L., Hsu P H., Legator M S., Morrison L E., Seelig S A (1995),

"Fluorescence in situ hybridization: Powerful molecular tool for cancer prognosis", Clin Chem, 41, pp 1554-1559

21 Gall J G., Pardue M L (1969), "Formation and detection of ARN-ADN

hybrid molecular in cytological preparations", Proc Natl Acad Sci USA, 63,

pp 378-383

22 Gong Y., Sweet W., Duh Y., Greenfield L., Fang Y., Zhao J., Tarco E.,

Symmans W F., Isola J., Sneige N (2009), "Chromogenic in situ hybridization is a reliable method for detecting HER2 gene status in breast cancer", Am J Clin Pathol, 131, pp 490-497

23 Gonzalez M P., Sanchez X., Ganga M A., Lopez-Lastra M., Jashes M., Sandino A M (1997), "Detection of the infectious hematopoietic necrosis virus directly from infected fish tissues by dot blot hybridization with a

non-radioactive probe", Journal of Virological Methods, 65, pp 273-279

24 Gupta D., Middleton L P., Whitaker M J., Abrams J (2003), "Comparison of

Fluorescence and Chromogenic in situ hybridization for detection of HER-2/neu oncogen in breast cancer", Am J Clin Pathol, 119, pp 381-387

25 Hammermueller J D., Krell P J., Derbyshire J B., Nagy E (1991), "An improved dot-blot method for virus detection in chicken embryo fibroblast

cultures", Journal of Virological Methods, 31, pp 47-56

26 Harris M R (1991), "Non-radioactive techniques for the labelling of nucleic

acids", Biotech adv, 9, pp 185-196

27 Hassan S., Ahmad R., Zakaria Z., Zulkafli Z., Abdullah W Z (2013),

"Detection of β-globin gene mutations among β-thalassaemia carriers and

patients in Malaysia: Application of Multiplex Amplification Refractory

Mutation System–Polymerase Chain Reaction", Malays J Med Sci., 20, pp

13-20

28 Heitzler J., Marechal-Drouard L., Dirheimer G., Keith G (1992), "Use of a dot blot hybridization method for identification of pure tRNA species on

different membranes", Biochimica et Biophysica Acta, 1129, pp 273-277

29 Hopp H E., Hain L., Almonacid F B., Tozzini A C., Orman B., Arese A I., Ceriani M F., Saladrigas M V., Celnik R., Vas M., Mentaberry A N (1991),

"Development and application of a nonradioactive nucleic acid hybridization

system for simultaneous detection of four potato pathogens", Journal of Virological Methods, 31, pp 11-30

30 Hsu Y C., Yeh T J., Chang Y C (2005), "A new combination of RT-PCR and reverse dot blot hybridization for rapid detection and identification of

potyviruses", Journal of Virological Methods, 128, pp 54-60

31 Juan M., Qin-sheng G U., Shi-ming L., Peng B., Li-feng L., Yan-bing T., Li

L (2007), "Dot-blot hybridization for detection of five cucurbit viruses by

digoxigenin- labelled cDNA probes", Agricultural Sciences in China, 6, pp

1450-1455

32 Kafatos F C., Jones C W., Efstratiadis A (1979), "Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization

procedure", Nucleic Acids Research, 7, pp 1541-1552

33 Kessler C (1994), "Non-radioactive analysis of biomolecules", Journal of Biotechnology, 35, pp 165-189

34 Lahtinen S., Gueimonde M., Ouwehand A., Reinikainen J., Salminen S

(2005), "Probiotic bacteria may become dormant during storage", Applied and Environmental Microbiology, 71, pp 1662-1663

35 Landry M L (1990), "Nucleic acid hybridization in viral diagnosis", Clin Biochem, 23, pp 267-277

36 Leary J., Brigati D J., Ward D C (1983), "Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA

immobilized on nitrocellulose: Bio-blots”, Proc Natl Acad Sci USA, 80, pp

4045-4049

37 Li D., Liao C., Xie X., Huang Y., Zhong H., Wei J (2006), "Prenatal

diagnosis of β-thalassemia in Southern China", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 128, pp 81–85

38 Lin M., Zhu J J., Wang Q., Xie L X., Lu M., Wang J L., Wang C F., Zhong

T Y., Zheng L., Pan M C., Wu J R., Wen Y F., Liu G R., Zhan X F., Lin

F., Yang L Y (2012), "Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common alpha and beta thalassemia in

Chinese", Blood Cells, Molecular, and Diseases, 48, pp 86-90

39 Liu Y., SunB., Wang X., Zheng C., Zhou G (2007), "Three digoxigenin-labeled cDNA probes for specific detection of the natural population of Barley

yellow dwarf viruses in China by dot-blot hybridization", Journal of Virological Methods, 145, pp 22-29

40 Lo Y M D., Mehal W Z., Fleming K A (1988), "Rapid production of

vector-free biotinylated probes using the polymerase chain reaction", Nucleic Acids Research, 16, pp 8719

41 Lodish H., Berk A., Zipursky S L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J

(2000), Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W H Freeman

42 Lu X., Hua L., Zhang T., Li S., Fan X., Peng Q., Li W., Ye J., Long J., He X (2013), "A reverse dot blot assay for the expanded screening of eleven

Chinese G6PD mutations", Clinica Chimica Acta, 418, pp 45-49

43 Machado A., Almeida C., Carvalho A., Boyen F., Haesebrouck F., Rodrigues

L., Cerca N., Azevedo N F (2013), "Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Lactobacillus spp in milk samples", International Journal of Food Microbiology, 162, pp

64-70

44 Madrid M A., Lo R W (2004), "Chromogenic in situ hybridization (CISH): a

novel alternative in screening archival breast cancer tissue samples for HER-2/neu status", Breast Cancer Research, 6, pp 593-600

45 Matsumoto K., Takada T., Shimizu K., Kado Y., Kawakami K., Makino I., Yamaoka Y., Hirano K., Nishimura A., Kajimoto O., Nomoto K (2006), "The

effects of a probiotic milk product containing Lactobacillus casei strain

Shirota on the defecation frequency and the intestinal microfola of sub-optimal health state volunteers: a randomized placebo-controlled cross-over study",

Bioscience and Microfola, 25, pp 39-48

46 Metaferia B., Wei J S., Song Y K., Evangelista J., Aschenbach K., Johansson P., Wen X., Chen Q., Lee A., Hempel H., Gheeya J S., Getty S., Gomez R.,

Khan J (2013), "Development of peptide nucleic acid probes for detection of

the HER2 oncogene", Plos One, 8, e58870

47 Mifflin T E (1989), "Use and applications of nucleic acid probes in the

clinical laboratory", Clin, Chem., 35, pp 1819-1825

48 Mo Q H., Li X R., Li C F., He Y L., Xu X M (2005), "A novel frameshift mutation (+G) at codons 15/16 in a β0

thalassaemia gene results in a

significant reduction of β-globin mRNA values", J Clin Pathol, 58, 923-926

49 Moliaka I., Ovchinnikov I.V., Shlenskii A.B., Korovaitseva G.I., Rogaev E.I (1997), "DNA genotyposcoy in determining paternity: use of hybridized

probes", Genetika, 33, pp 831-835

50 Nakamura R M (1990), "Overview and principles of in situ hybridization", Clin Biochem, 23, pp 255-259

51 Osiowy C., Giles E (2003), "Evaluation of the INNO-LiPA HBV Genotyping

Assay for determination of Hepatitis B Virus genotype", Journal of Clinical Microbiology, 41, pp 5473-5477

52 Pas S D., Tran N., Man R A., Burghoorn-Maas C., Vernet G., Niesters H G

M (2008), "Comparison of reverse hybridization, microarray, and sequence

analysis for genotyping Hepatitis B Virus", Journal of clinical microbiology,

46, pp 1268-1273

53 Richards J C (1991), "Gene probes", Current Opinion in Biotechnology, 2,

pp 76-85

54 Saiki R K., Walsh P S., Levenson C H., Erlich H A (1989), "Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific

oligonucleotide probes", Genetics, 86, pp 6230-6234

55 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, New York

56 Shawky R M., Kamal T M (2012), "Thalassemia intermedia: An overview",

The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 13, pp 245-255

57 Stahl D A., Kane M D (1992), "Methods in microbial identification, tracking

and monitoring of function", Curr Opin Biotechnol., 3, pp 244–252

58 Strachan T., Read A P (2004), Human Molecular Genetics, 3rd edition,

Garland Science

59 Svasti M L S., Tran M H., Mukongdee T., Winichagoon P., Tran V B., Tran

V B., Fucharoen S (2002), "Molecular analysis of β-thalassemia in south

Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp 85-88

60 Sun Y., Perch-Nielsen I., Dufva M., Sabourin D., Bang D D., Hogberg J., Wolff A (2012), "Direct immobilization of DNA probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration in microfluidic devices for rapid

bioassay", Anal Bioanal Chem, 402, pp 741-748

61 Sutcharitchan P., Saiki R., Huisman T H J., A Kutlar, McKie V., Erlich H., Embury S H (1995), "Reverse dot-blot detection of the African-American

β-thalassemia mutations", Blood, 86, pp 1580-1585

62 Svasti M L S., Tran M H., Munkongdee T., Winichagoon P., Tran V B., Tran V B., Fucharoen S (2002), "Molecualr analysis of β-thalassemia in

south Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp 85-88

63 Syrjanen S., Andersson B., Juntunen L., Syrjanen K (1991), "The use of polymerase chain reaction in generation of biotinylated human papillomavirus

DNA probes for in situ hybridization", Journal of Virological methods, 31, pp

147-160

64 Takahashi T., Mitsuda T., Okuda K (1989), "An alternative nonradioactive

method for labeling DNA using biotin", Analytical biochemistry, 179, pp

77-85

65 Tenover F C (1988), "Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious

diseases", Clinical Microbiology Reviews, 1, pp 82-101

66 Twomey T A., Krawetz S A (1990), "Parameters affecting hybridization of

nucleic acids blotted onto nylon or nitrocellulose membranes", Biotechniques,

8, pp 478-482

67 Uhlmann V., Prasad M., Silva I., Luettich K., Grande L., Alonso L., Thisted M., Pluzek K L., Gorst J., Ring M., Sweeney M., Kenny C., Martin C., Russell J., Bermingham N., O'Donovan M., Sheils O., O'Leary J J (2000),

"Improved in situ detection method for telomeric tanddem repeats in metaphase spreads and interphase nuclei", Mol Pathol, 53, pp 48-50

68 Velazquez W A C., Hernandez H C., Marquez C A., Hernandez A F O., Rodriquez C M., Salamanca G F., Coral V R (2008), "Identification of

duchence muscular dystrophy female carriers by fluorescence in situ hybridization and RT-PCR", Genet Test, 12, pp 221-223

69 Ward D M., Bateson M M., Weller R., Ruff-Roberts A L (1992),

"Ribosomal RNA analysis of micro-organisms as they occur in nature", Adv Microb Ecol., 12, pp 219–286

70 Weeks I., Behesti I., McCapra F., Campbell A K., Woodhead J S (1983),

"Acridinum ester as high-specific-activity labels in immunoassay", Clin Chem., 29, pp 1474-1479

71 Wetmur J G (1991), "DNA probes: Applications of the principles of nucleic

acid hybridization", Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,

26, pp 227-259

72 Wang W., Kham S K Y., Yeo G., Quah T., Chong S S (2003), "Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian β-thalassemia

mutations", Clinical Chemistry, 49, pp 209-218

73 Yamsri S., Sanchaisuriya K., Fucharoen G., Sae-ung N., Fucharoen S (2011),

"Genotype and phenotype characterizations in a large cohort of β-thalassemia heterozygote with different forms of α-thalassemia in northeast Thailand",

Blood Cells, Molecules, and Diseases, 47, pp 120-124

74 Yang T., Yuan L., Huang S., Zhao S (1998), "Screening mutations in phenylketonuria by means of non-radioactive reverse dot blot hybridization",

Zhonghua Yi Xue Chuan Xue Za Zhi, 15, pp 307-309

75 Zakrzewska K., Ciappi S., Azzi A (1993), "Polymerase chain reaction for synthesis of digoxigenin-labelled DNA probe: application to parvovirus B19

and to polyomavirus BK", Molecular and Cellular Probes, 7, pp 55-60