Sản xuất sản phẩm từ vi sinh vật

• Một số lĩnh vực hỗ trợ quá trình sản xuất aa: – Phân lập vsv sinh aa, tạo vsv mới bằng công nghệ gen có hoạt tính sinh aa cao – Kết hợp tổng hợp hóa học và enzyme và vsv – Sử dụng nguy

CHƯƠNG 3:

SẢN XUẤT SẢN PHẨM TỪ

VI SINH VẬT

NỘI DUNG

3.1 Sản xuất amino acid

3.2 Sản xuất enzyme

3.3 Sản xuất chất kháng sinh

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Đặc tính và vai trò của amino acid:

– Là thành phần cấu tạo nên ……

– Hầu hết aa trong tự nhiên đều có dạng L,

sinh vật sử dụng aa dạng L là chủ yếu

– Một số aa dạng D mà gia cầm và heo có thể

sử dụng: Lysine, Valine, Methionine

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Vì sao phải sản xuất amino acid?

• Cần sản xuất loại amino acid nào?

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Aa dễ được hấp thu

• Aa cần thiết cho người và vật nuôi

– Cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp

một số aa thiết yếu

– Số lượng aa thiết yếu phụ thuộc vào giống loài và

giai đoạn phát triển

– Vd: ở người, có … aa thiết yếu ở giai đoạn …

→ cần bổ sung nguồn aa từ động thực vật hoặc

sản xuất công nghiệp

Nếu thiếu một số aa hay một aa nào đó → trạng thái

Các aa dùng trong công nghiệp thực phẩm

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Trong chăn nuôi, vật nuôi cũng cần lượng aa từ bên

ngoài, nhưng thức ăn cung cấp thường không đủ

– Aa giới hạn là aa thiết yếu có hàm lượng trong

thức ăn thấp hơn so với nhu cầu của vật nuôi

I need more L-Lysine

Aa giới hạn

• Chỉ số aa giới hạn

Paa= (aa khẩu phần/ aa nhu cầu)*100

• Axit amin nào có Paa thấp nhất là aa giới hạn thứ nhất

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Cân bằng aa trong khẩu phần

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Sản lượng aa được sản xuất công nghiệp ngày càng tăng

• Một số lĩnh vực hỗ trợ quá trình sản xuất aa:

– Phân lập vsv sinh aa, tạo vsv mới bằng công nghệ gen có hoạt tính sinh aa cao

– Kết hợp tổng hợp hóa học và enzyme và vsv – Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền

– Tối ưu hóa các điều kiện lên men nhằm thu nhận tối đa lượng aa từ vsv

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Một số aa được sản xuất và ứng dụng: (thống kê 2003)

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Các phương pháp sản xuất aa:

1 Tách chiết aa từ dịch thủy phân protein

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Các phương pháp sản xuất aa:

2 Tổng hợp hóa học

– Dây chuyền phản ứng hóa học từ các tiền chất

– Thường tạo ra 2 dạng đồng phân D và L, khó tách ra – Một số aa tổng hợp được: M, K, W, T, G

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Các phương pháp sản xuất aa:

3 Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật

– Lên men trực tiếp trong môi trường

– Chuyển hóa tiền chất của aa nhờ vsv

– Sử dụng enzyme tự do hoặc cố định hoặc tế bào sinh enzyme được cố định

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Các phương pháp sản xuất aa:

3 Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật

Các phương pháp sản xuất aa:

3 Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật

• Nguyên liệu: Đảm bảo cung cấp nguồn carbon, nitơ, và các nguyên tố khác để vi sinh vật phát triển và tổng hợp được nhiều sản phẩm

– Nguồn carbon: rỉ đường, nguyên liệu giàu tinh bột (khoai mì, bắp ) …

– Nguồn nitơ: ure, muối amoni,…

– Các hợp chất khoáng – Các chất kích thích sinh trưởng: vitamin, aa cần thiết cho quá trình tổng hợp aa mong muốn trong vi sinh vật

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

 Nồng độ và thành phần thích hợp phụ thuộc vào chủng vi sinh vật và giống sản xuất

 Điều chỉnh pH và thanh trùng môi trường

Các phương pháp sản xuất aa:

3 Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

Chuẩn bị giống

• Chủng vi sinh vật trong môi trường bảo quản

• Nhân giống các cấp

Lên men

 Chú ý điều chỉnh các thông số kỹ thuật

 pH, nhiệt độ, thông khí, bổ sung chất dinh dưỡng…

Xử lý và thu nhận sản phẩm

• Tùy vào mục đích sử dụng mà thực hiện các biện

pháp xử lý và thu nhận khác nhau:

– Dùng để chế biến thức ăn gia súc: cần dạng tinh

khiết hoặc chỉ cần chế phẩm thô – Dùng trong chế biến thực phẩm hoặc y học: cần độ tinh sạch cao hơn

Các con đường biến dưỡng aa

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Các chủng vsv dùng sản xuất aa

Cryptococcus laurentii Corynebacterium glutamicum

3.1 SẢN XUẤT AMINO ACID

• Các chủng vsv dùng sản xuất aa

Cryptococcus laurentii Corynebacterium glutamicum

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

• Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme

• Hệ enzyme phong phú: protease, cellulase, racemase, amylase, …trong vsv có thể phục

vụ nhiều nhu cầu khác nhau

• Enzyme của VSV có hoạt tính cao hơn

enzyme từ sinh vật khác

• VSV sinh trưởng và phát triển nhanh, lượng enzyme trong tế bào lớn → thích hợp cho sản

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

• Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme

• Quy trình nuôi dễ công nghiệp hóa, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền → hiệu quả kinh

tế cao

• Các chu kỳ lên men ngắn ngày

• Có thể kiểm soát trạng thái sinh lý của vi sinh vật trong quá trình lên men và đảm bảo được tính đồng nhất của các mẻ lên men

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

• Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme

• VSV có khả năng điều chỉnh quá trình trao đổi chất để thích nghi với môi trường→ thay đổi thành phần môi

trường để thu nhận enzyme mong muốn

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

• Ưu thế của việc dùng VSV tổng hợp enzyme

• Một số VSV có khả năng tiết enzyme ngoại bào → không phải phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme → tái

sử dụng nhiều kỳ và dễ dàng thu nhận sản phẩm

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

• Các công đoạn chính:

1 Lựa chọn chủng: dựa vào nhu cầu thực tế

– VD: thu nhận protease loại nào? với mục đích gì? – Thu nhận chitinase, để phân giải chitin từ vỏ tôm

2 Sử dụng các kỹ thuật trên giống

– Phân lập từ mẫu thích hợp – Huấn luyện thích nghi

– Cải tạo

– Nguồn N: nước chiết bắp, bột đậu nành, dịch thủy

phân casein, cao nấm men, …

– Nhu cầu về vitamin hay chất sinh trưởng

Việc xác định thành phân môi trường thường qua nhiều nghiên cứu với quy mô rộng dần (scale up)

• Hãy thiết kế thí nghiệm xác định thành phần dinh

dưỡng để nuôi cấy Bacillus cho việc sản xuất

protease cao nhất

• Nêu cách thức phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh cellulase

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

• Các công đoạn chính:

5 Thu nhận enzyme và xử lý an toàn chất thải

– Chế phẩm enzyme thô: sử dụng toàn bộ canh

trường lên men

• Không tinh khiết

• Không bảo quản lâu

– Chế phẩm enzyme kỹ thuật:

• Đối với enzyme ngoại bào: thu dịch, trích ly enzyme

• Đối với enzyme nội bào: phá vỡ tế bào, thu nhận enzyme

qua tủa phân đoạn, hoặc tách qua cột sắc ký sau đó cô

• Thu nhận enzyme bằng sắc ký ái lực

• Thu nhận

enzyme bằng tủa phân đoạn

3.2 SẢN XUẤT ENZYME

Một số vi sinh vật sinh enzyme protease:

• Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng

pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Được sinh

ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số chủng thuộc chi Clostridium

• Nấm sinh protease được ứng dụng trong công nghiệp thực

phẩm: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti, … có khả

năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

• Xạ khuẩn: một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao

như: Streptomyces grieus, S fradiae, S trerimosus…

• Vi sinh vật: vi khuẩn, nấm sợi, nấm men

– Nấm sợi: Aspergilus niger, A oryzae, A

candidus, …

– Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Kháng sinh (Antibiotic) là gì?

Những chất hóa học có tác động chống lại sự sống của VSV ở nồng độ thấp, ức chế hoặc tiêu diệt VSV

bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa hoặc thay

đổi cân bằng lý hóa của VSV mà vẫn an toàn cho người và vật nuôi

• Nấm Penicillium notatum

• Chất có tác dụng diệt khuẩn : penicillin

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Lịch sử

– 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (ĐH Oxford) bắt đầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin

– 25/5/1940 thử nghiệm thành công trên chuột

Edward Abraham nghiên cứu điều chế

penicillin tinh chất

– 1942 triển khai công nghệ lên men chìm sản xuất penicillin G

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• VK G (-) có vách không hoàn chỉnh (spheroplast)

•  tế bào dễ vỡ ở môi trường có trương lực bình

thường

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Cơ chế tác động

– Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào

• Mất sự toàn vẹn của màng tế bào  đại phân tử

và ion thoát ra khỏi tế bào  tế bào chết

• Màng tế bào VK và vi nấm dễ bị phá hủy bởi một số tác nhân

Imidazole làm suy yếu sự toàn vẹn của màng tế bào vi nấm bằng cách ức chế sự tổng hợp lipid

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Cơ chế tác động

– Ức chế sự tổng hợp protein

Aminoglycosides : Streptomycin

– GĐ 1 : thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S

– GĐ 2 : phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quá trình thành lập chuỗi peptid

– GĐ 3 : thông tin mRNA bị đọc sai  1 acid amin không phù hợp

– GĐ 4 : làm vỡ các polysomes thành monosomes 

Lincomycins

– Cơ chế giống nhóm Macrolides

Mitomycin

– Thuốc gắn vào 2 chuỗi DNA ngăn 2 chuỗi tách rời ra  không sao chép được

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Biểu diễn nồng độ kháng sinh

– mg/ml, ug/ml, UI/ml, UI/g

• Xác định nồng độ kháng sinh gây ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn

– MIC, MBC

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Cách xác định MIC, MBC

3.3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH

• Điều chỉnh tổng hợp chất KS

– Tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp siêu

sản xuất kháng sinh:

• Tuyển chọn quy mô PTN: đặc tính sinh lý, sinh

hóa, động học phát triển, động học quá trình tạo sản phẩm, nguồn cơ chất, điều kiện lên men, các công nghệ thu sản phẩm

• Tuyển chọn quy mô sản xuất thử và sản xuất

• Nguồn N: bột đậu nành, cao nấm men, …

• Khoáng đa lượng: P, S, Mg,Fe, Ca, K, Na …

• Khoáng vi lượng

• Chất cảm ứng, chất phá bọt, chất kìm hãm, chất

SẢN XUẤT PENICILLIN

SẢN XUẤT PENICILLIN

SẢN XUẤT PENICILLIN

SẢN XUẤT PENICILLIN

heat_sterilization

SẢN XUẤT PENICILLIN

Fermenters

Chủng vsv vào nồi lên men

SẢN XUẤT PENICILLIN

SẢN XUẤT PENICILLIN

Rotary_vacuum_filter

To remove biomass

SẢN XUẤT PENICILLIN

disk_centrifuge

SẢN XUẤT PENICILLIN

• Batch_extraction

Penicillin được hòa tan trong phosphate buffer, sau đó là chloroform, hòa lại trong phosphate buffer và cuối cùng là ether (ê-te)

Sau đó, được trộn với sodium bicarbonate để

Ôn tập

• Vì sao cần sản xuất aa quy mô công nghiệp?

• So sánh các phương pháp sản xuất aa

• Aa thiết yếu là gì? Aa giới hạn là gì?

• Nhận biết aa dạng L, D, học các chữ viết tắt

của 20 loại aa

• Cho ví dụ ứng dụng của 3 loại aa trong thực

phẩm hay trong thức ăn vật nuôi

• Vẽ quy trình sản xuất vsv sinh aa từ giống bảo

quản ban đầu

Ôn tập

• Nêu được các loại vsv có khả năng sản xuất aa, enzyme, kháng sinh cho nhu cầu con người?

• Nêu ưu điểm của việc sản xuất enzyme từ vsv

• Giải thích các cách thu nhận enzyme từ dịch nuôi cấy vsv

• Định nghĩa kháng sinh Liệt kê các cơ chế tác động của kháng sinh

• Nêu cách thu nhận penicillin tinh khiết từ dịch