Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tách và chọn chủng vi
Trang 1I- GIỚI THIỆU
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học
và kỹ thuật chú ý từ lâu Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn
Ngoài số enzyme đa được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôtêaza…), còn
có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế
Trước đây, các enzyme dùng nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường thu nhận từ động vật, thực vật Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi sinh vật Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước phương đông( Trung Quốc, Nhật Bản…)
Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm enzyme
Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên sự phân
bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau Một số loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hay một số protesae nhất định
có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào( protease nội bào ) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy( protease
Trang 2Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kĩ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học Trong bài này chúng tôi xin giới thiệu một phương pháp tách chiết enzyme
prôtêaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
II- CHUẨN BỊ GIỐNG – TẠO SINH KHỐI
2.1 Phân lập giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae.
Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì khác nhau hoàn toàn
Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện
2.1.1 Vai trò của giống trong công nghệ enzyme.
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy
Trang 3- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt tính enzyme)
- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất
- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm
Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV
2.1.2 Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme.
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định Đó là:
- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn Sản phẩm này phải có
số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng
- Giống phải cho năng suất sinh học cao
- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp
- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh
- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết
Trang 42.1.3 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Aspergillus oryzae
Asp oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang
khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào
tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía
đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những
tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào tử của
Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc,
có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới
Trang 52.1.4 Quá trình phân lập giống VSV.
VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất
Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho phù hợp nhất Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt Sau đây là 1 số ưu điểm:
a Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên.
Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh
Trang 6Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn
Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại Chúng đã quá quen thuộc với
sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên Khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung
ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng Dựa và đặc điểm này để chúng ta
có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần
Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao, ta phải
tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả
năng sinh tổng hợp protease ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein trong tự
nhiên
Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến Những đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp
Trang 7b Phân lập giống trong điều kiện sản xuất.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại
Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao Do đó, khả năng thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao
c Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng.
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản Do bị nhiễm, có thể rất nhiều
tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt
2.2 Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme protease này
là protein Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm
Trang 8Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây Sau đó cho vào bao nyclon và mang
về phòng thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng
Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo
Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar)
Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông
Trang 9Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm
KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1
NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 PH = 6,5 KCl 0,5 hồ tinh bột 20
Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó đem
ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp
III: CÔNG NGHỆ LÊN MEN TẠO ENZYME PROTEASE
3.1 Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh
và một số quá trình lên men truyền thống
Trang 10Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
- Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện Quy trình công nghệ thường không phức tạp
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn
Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục
và hoàn thiện dần phương pháp này Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích
a Môi trường lỏng
Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV