TÌM HIỂU CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

Theo dự đoán dân số nước ta sẽ tăng lên gấp đôi và năm 2050. Tại châu Á, người ta hi vọng đến năm 2013 nhu cầu thực phẩm sẽ được đáp ứng tốt hơn. Điều này đã đặt ra một thách thách lớn đối với từng quốc gia. Công nghệ biến đổi di truyền la một chiến lược hiện đại nhiều triển vọng và chính xác để năng cao chất lượng và năng suất lương thực theo nhu cầu của xã hội bằng cách giảm thất thoát mùa màng và tăng năng suất trong khi vẫn giữ nguyên diện tích đất trồng trọt. Tuy nhiên, khi các sinh vật biến đổi gen được đưa vào nông nghiệp với quy mô lớn thì chính phủ nhiều nước trên thế giới đều có chung một mối quan tâm, đó là ảnh hưởng trước mắt và hệ quả lâu dài của việc sử dụng các GMO trong thực phẩm cho người và vật nuôi trong công nghiệp chế biến thực phẩm, trong y tế và bảo vệ cuộc sống.Các kết luận của giới khoa học cũng còn mâu thuẫn đặc biệt còn chưa đủ thời gian để kết luận ảnh hưởng lâu dài của các GMO đối với sức khoẻ con người và môi trường.

MỤC LỤC

I TỔNG QUAN 3

1.1 Khái niệm cây chuyển gen 3

1.2 Đặt vấn đề 4

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN CÂY TRỒNG 6

2.1 Lựa chọn đối tượng cây trồng chuyển gen 6

2.2 Phương pháp chuyển gen vào thực vật 7

2.2.1 Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen 8

2.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A tumefaciens 9

III Các cây trồng quan trọng đã được phát triển 18

IV Đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen 25

4.1 Cơ sở khoa học 25

4.2 Đánh giá cây chuyển gen ở mức độ phòng thí nghiệm 25

4.3 An toàn sinh học 26

v Tài liệu tham khảo 28

I TỔNG QUAN

1.1 Khái niệm cây chuyển gen

Muốn tạo một sinh vật biến đổi gen (genetically modified GMO) cần phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào trong tế bào của chúng Ở vi khuẩn, tế bào được xử lý bằng dung dịch muối calcium chloride Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi

organism-tế bào tiếp xúc với lithium chloride hoặc lithium acetate Tuy nhiên, đối với phần lớn sinh vật bậc cao cần phải có các phương pháp khác tinh vi hơn

Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nó đã trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thực vật Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng, các kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen

Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) của một sinh vật được gọi là quá trình biến nạp (transformation) Những cây được biến nạp được gọi

là cây biến đổi gen (genetically modified plant-GMP) Ứng dụng công nghệ gen trong công tác giống cây trồng hiện đại có rất nhiều ưu điểm, chẳng hạn như:

- Bằng việc biến nạp một ho ặc một số gen có thể thu được cây mang một đặc tính mới xác định

- Rào cản về loài không còn có tác dụng, vì không chỉ các gen từ thực vật mà còn từ vi khuẩn, nấm, động vật hoặc con người được chuyển thành công vào thực vật Về nguyên tắc chỉ thay đổi vùng điều khiển gen, promoter ( gen khởi động quá trình phiên mã) và terminator (gen kết thúc quá trình phiên mã) Tuy nhiên, trong một số trường hợp đòi hỏi những thay đổi tiếp theo như sự phù hợp codon

- Những đặc điểm không mong muốn của thực vật Chẳng hạn, sự tổng hợp các chất độc hoặc chất gây dị ứng có thể được loại trừ bằng công nghệ gen

- Thực vật biến đổi gen có thể là lò phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất hiệu quả các protein và các chất cần thiết dùng trong dược phẩm và thực phẩm

- Mở ra khả năng nghiên cứu chức năng của gen trong quá trình phát triển của thực vật và các quá trình sinh học khác Vì vậy,thực vật biến đổi gen có ý nghĩa trong nghiên cứu cơ bản

- Trong lai tạo giống hiện đại, công nghệ gen giúp làm giảm sự mâu thuẫn giữa kinh tế và môi trường sinh thái Bằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt

cỏ có thể giảm được lượng thuốc bảo vệ thực vật

Mục đích của nông nghiệp hiện đại không chỉ là tăng năng suất mà còn hướng đến những lĩnh vực quan trọng sau:

+ Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity)

+ Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các điều kiện bất lợi)

+ Nâng cao chất lượng sản phẩm

+ Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng

+ Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học

+ Tạo ra sản phẩm không gây hại môi trường

1.2 Đặt vấn đề

Kể từ khi bắt đ ầu có sự sống, gen đã đã vượt ra ngoài giới hạn của các lòi sinh vật họ hàng và không có họ hàng trong tự nhiên Các ứng dụng của công nghệ sinh học đã có từ năm 1800, khi con người bắt đầu sử dụng nấm men để làm dậy men bánh mì và lên men rượu Vào những năm 1860, con ngừi

đã bắt đầu lai tạo cây trồng thông qua sự thụ phấn chéo Họ đã chuyển và chọn lọc các gen để tăng cường những tính chất có lợi của cây trồng thông qua phương pháp lai chéo mà không cần biết tới các tính trạng gen đó mã hoá Hầu hết các thực phẩm, bao gồm lúa, ngô, chuối, khoai tây, đu đủ,…đều là các sản phẩm của phương pháp lai chéo truyền thống Công việc đã được kiểm định qua thời gian này tiếp tục tạo ra các giống cây trồng với các giống cây trồng với các tính trạng mong muốn

Tuy nhiên, phương pháp lai chéo truyền thống cũng có nhuững hạn chế của nó Nó chỉ có thể tiến hành ở các loài thực vật giố ng nhau hoặc có quan hệ

họ hàng với nhau Do vậy nguồn gen có sẵn đối với mỗi loài có giới hạn Hơn nữa, khi lai chéo các gen, t ất c ả 100.000 gen – số lượng gen của mỗi thực vật

sẽ trộn lẫn, tạo thành các hỗn hợp ngẫu nhiên Do cuối cùng những người lai tạo giống truyền thóng cũng chỉ muốn một vài gen hay tính trạng được trao đổi

Công nghệ sinh học hiện đại và các biến đổi di truyền đã giúp các quá trình này chính xác và nhanh hơn rất nhiều Đây là kết quả của các nhà khoa học nhờ đã hiểu biết và tận dụng được các đặc tính của tự nhiên

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Công nghệ sinh học ngày nay đã có những đóng góp quan trọng để nâng cao hiệu quả sản suất, chỉ trong lĩnh vực nông nghiệp nhiều giống gen quý đã được phân lập và chuyển vào cây trồng tạo ra những cây lý tưởng

Sinh vật chuyển gen ( GMO ) cho năng suất cao, đem lại lợi ích cho người sản xuất là điều đã được khẳng định qua khoa học và thực tiễn Một số phòng thí nghiệm đã và đang được đầu tư công nghệ cao và đưa nhà khoa học

đi tập huấn ở nước ngoài Do vậy, chúng ta đã làm chủ được các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen như phân lập và xác định trình tự gen, thiết kế và biến nạp gen vào tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật, vv…

Trong những năm qua, trên thế giới CN sinh học mà nòng cốt là CN gen

đã có những bước tiến vượt bậc Cây trồng biến đổi gen (GMC) đã đạt diện tích

102 triệu ha vào năm 2006 Đó là tốc độ chấp nhận kỷ lục của sx đối với một công nghệ ứng dụng trong sx nông nghiệp mà lịch sử từng biết đến Dự kiến đến 2015, số nước trồng cây biến đổi gen sẽ tăng từ 22 Qgia như hiện nay lên hơn 40 QG, sẽ chiếm diện tích trồng trọt hơn 200 tr Ha Tuy nhiên , ở VN, cây trông biến đổi gen chưa được chính thức chấp nhận đưa vào sx, mặcdù CNSH

là 1 trong 5 lĩnh vực ưu tiên, chỉ đứng sau CN thông tin Về nghiên cứu, trong giai đoạn 1990-2000, ở nước ta chưa có các đề tài, dự án tạoGMC trong nước

trồng, vật nuôi Tuy nhiên, kết quả của các dự án này mới dừng lại trong khuôn khổ phòng thí nghiệm mà chưa tạo được GMC có giá trị ứng dụng cho sx nông nghiệp

Giai đoạn 2006-2010, chương trình CNSH nông nhiệp đã được xét duyệt và đưa vào thực hiện đề tài tạo giống GMC ở ngô và đậu tương Dự kiến đến 2010 các đề tài này mới có kết quả và đến giai đoạn 2013-2015 VN sẽ có cây trồng biến đổi gen do chính các nhà KH Việt Nam tạo ra nếu kết quả đó được áp dụng thành công

Vì vậy, trong giai đoạn từ nay đến 2010 mục tiêu của chương trình CNSH nông nghiệp là tạo cơ sở pháp lý cho việc ứng dụng những thành tựu tạo giống GMC cuả nước ngoài ở VN Dự thảo quy định quản lý an toàn sinh học GMC đã bước vào giai đoạn cuối, dự kiến được ban hành trong năm 2007 Đây

là một quy định quan trọng sẽ tạo bước ngoặt về ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp ở VN, góp phần thúc đẩy các nghiên cứu & ứng dụng công nghệ gen trong sx Mặt khác là công cụ hữu hiệu cho các nhà quản lý trong việc định hướng ứng dụng công nghệ này theo hướng có lợi nhất cho sx, môi trường, đa dạng sinh học và sức khỏe con người

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

a Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ

Nhiều lo ại cây trồng đã được biến đổi gen nhằm kháng lại thuốc diệt cỏ phổ rộng Các cây trồng chuyển gen nàychứa các gen giúp chúng phân huỷ các thành phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ, khiến chúng trở thành vô hại Nông dân có thể dễ dàng loại bỏ cỏ dại trong suốtvụ mùa và thoải mái chọn lựa thời điểm phun thuốc Cây trồng kháng thuốc diệtcỏ không cần hoặc cần rất ít việc làm đất Những người phản đối cho rằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể dẫn đến tăng sử dụng thuốc diệtcỏ, kích thích sự kháng thuốc diệt

cỏ ở cỏ dại, và hủy hoại đa dạng sinh học nông nghiệp

Gần đây, hai hệ thống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được phát triển đối với đậu nành, ngô, củ cải dầu và bônglà: RoundupReady và Liberty Link

b Cây trồng kháng bệnh

Các cây trồng có thể bị bệnh gây rabởi các loài nấm, vi khuẩn, vi rút, giun tròn và các tác nhan khác Nhiều các phương pháp công nghệ cao được đề xuất nhằm bảo vệ thực vật khỏi các tác hạinày đến nay, hầu hết các mối quan tâm tập trung vào các thực vật chuyển gen kháng virus, nhưng việc sử dụng công nghệ sinh học để kháng nấm, vi khuẩn hay giun tròn cũng được quan tâm

c Thực vật với thành phần thay đổi

Ngày càng nhiều giống cây trồngchuyển gen mới được khảo nghiệm với đặc tính tăng giá trị và chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp và của người tiêu dùng

Các thực vật chuyển gen mới vớithành phần biến đổi đem lại nhiều lợi ích cho công nghiệp và người tiêu dùng Chẳng hạn khoai tây với thành phần tinh bột

biến đổi và các hạt dầu được dùng để thay thế các sản phẩm dầu mỏ là mối quan tâm của công nghiệp Người tiêu dùng có nhiều lợi ích từ thế hệ cây trồng biến đổi gen tiếp theo, thế hệ củagạo với mức độ tăng cường cao của sắt, vitamin A hay dầu thực vật có thể làmgiảm nguy cơ bệnh tim…

d Cây trồng chống chịu áp lực

Các nhà sinh học thực vật sử dụng công nghệ sinh học để hoàn thiện cách thức khiến các thực vật có thể thích nghi hơn với các thách thức môi trường như hạn hán, mặn hay nhiệt độ khắc nghiệt

- Chịu hạn: Một cách tạo ra thực vậtchịu hạn là lấy gen từ thực vật có khả năng chịu hạn và chuyển vào cây trồng Các thực vật hồi sinh (Xerophyta viscosa), nguồn gốc từ vùng khô hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hoá duy nhất một protein trong thành tế bào Thực nghiệm chỉ ra rằng các thực vật nhận gen này

có khả năng chịu áp lực của hạn hán và độ mặn cao

- Chịu mặn: Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng các thực vật có khả năng chịu mặn cao chứa nồng độ cao chất glycinebetaine Hơn nữa, thực vật có khả năng chịu mặn trung bình có nồng độ trung bình và thực vật với khả năng chịu mặn thấp có ít hay không chứa chấtglycinebetaine Khoai tây chuyển gen với khả năng sản sinh nhiều glycinebetaine tăng khả năng chịu mặn

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN CÂY TRỒNG

2.1 Lựa chọn đối tượng cây trồng chuyển gen

Trên thế giới người ta tập trung chọn những đối tượng có tính khả thi cao để tiến hành tạo cây trồng chuyển gen theo những tiêu chí sau:

 có khả năng thích ứng và thành công cao trong nuôi cấy in vitro

 có gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn như tạo tính kháng bệnh virus, kháng chất diệt cỏ, kháng côn trùng, tăng chất lượng dinh dưỡng…

 có giá trị thương mại cao

 có khả năng bảo vệ quyền sở hữu trí tuệ khi đưa ra thị trường

2.2 Phương pháp chuyển gen vào thực vật

Genom của thực vật có các phần khác nhau, phần chính nằm ở nhân, một phần nhỏ nằm ở lục lạp và nằm ở ti thể Hầu hết các nghiên cứu chuyển gen đều thử nghiện việc đưa gen lạ vào nhân Có hai nhóm phương pháp chuyển gen chính trong thực vật là:

 Phương pháp trực tiếp: kỹ thuật bắn gen, kỹ thuật vi tiêm, kỹ thuật siêu

âm, kỹ thuật PEG

 Phương pháp gián tiếp: chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen nhờ virus và phage

Một số nguyên tắc trong chuyển công nghệ chuyển gene thực vật

Khi đặt ra mu ̣c đích và thực hiện thí nghiệm chuyể n gen cầ n chú ý một số vấ n đề sinh ho ̣c ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:

- Không phải toàn bộ tế bào đề u thể hiện tính toàn năng (totipotency)

- Các cây khác nhau có phả n ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoa ̣i lai

- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biế n na ̣p vào genome

- Mô thực vật là hỗ n hơ ̣p các quần thể tế bào có khả năng khác nhau Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biế n na ̣p và tái sinh cây Ở các tế bào khác có hai trường hơ ̣p có thể xảy ra: một số tế bào nếu được

ta ̣o điề u kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến na ̣p và tái sinh cây

- Thành phần của các quần thể tế bào đ ươ ̣c xác định bởi loài, kiể u gen, từng cơ quan, từ ng giai đoa ̣n phát triể n của mô và cơ quan

- Thành tế bào ngăn cả n sự xâm nhập của DNA ngoa ̣i lai Vì thế , cho đến nay chỉ có thể chuyể n gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắ n gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm

- Khả năng xâm nhập ổn đi ̣nh của gen vào genome không tỷ lệ với sự biể u hiện

ta ̣m thờ i của gen

- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm

bảo là đã liên kế t ổn định với genome

- Các DNA (trừ virus) không chuyể n từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi

mà nó được đưa vào

- Trong khi đó, DNA củ a virus khi xâm nhập vào genom cây chủ la ̣i không liên kế t vớ i genome mà chuyể n từ tế bào này sang tế bào khác ngoa ̣i trừ mô phân sinh (meristem)

2.2.1 Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility,

Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990

Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học)

và ballistics (sự bắn tung))

Nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt

Cấu tạo súng bắn gen:

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6″x7″x10″ nối với hai bơm chân không

Đạn ở đây là các hạt tungsen có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm chứa DNA ngoại lai (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt)

Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ

1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng

 Ưu điểm của kỹ thuật dùng súng bắn gen:

- Chuyển được gen cho các khối mô có tổ chức Ưu điểm này cho phép chọn những loại mô có triển vọng tái sinh tốt để chuyển gen

- Hệ thống chuyển gen toàn năng: Về nguyên tắc có thể bắn bắt kỳ loại

mô, cơ quan

- Chuyển được gen cho các giống cây trồng có giá trị Không những áp dụng tốt cho cây mô hình mà ngay những giống cây đang phổ biến như: đậu tương, lúa, ngô, khoai tây, chuối…cũng cho phép tiến hành chuyển gen

2.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A tumefaciens

Mục đích của công nghệ gen thực vật là tạo ra những cây biến đổi gen có những đặc tính mới Ở đây DNA lạ được đưa vào tế bào thực vật và tồn tại bền vững trong hệ gen Các vi khuẩn đất A tumefaciens và một số loài họ hàng có khả năng chuyển một phần

nhỏ DNA của nó vào tế bào thực vật và qua đó kích thích tạo khối u Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong những khối

u này Những opine phổ biến nhất là nopalin và octopin.

Về hóa học opine là những sản phẩm ngưng tụ của một amino acid với một cetoacid hoặc một amino acid với đường Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ arginine và α-cetoglutaraldehyd Công thức cấu tạo của opine được trình bày ở hình 2.2.a

Hình 2.2.a cấu tạo hoá học Octopin và Nopalin

nó Như vậy, sự khẳng đi ̣nh kỹ thuật gen là một quá trình nhân ta ̣o là không đúng

Khả năng chuyể n DNA của A tumefaciens đươ ̣c sử du ̣ng trong công nghệ gen

hiện đa ̣i Để hiể u đươ ̣c quá trình này, điề u đầ u tiên cần thiế t là làm rõ sự tương

tác sinh ho ̣c giữa Agrobacterium với thực vật

Việc sử du ̣ng A tumefaciens đã bắt đầ u từ 1907, khi người ta phát hiện vi

khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bi ̣ thương, được go ̣i là khối u cổ rễ (Hình) Trong những năm bảy mươi người ta tìm thấy trong các chủ ng A tumefaciens ta ̣o khối u có một plasmid rất lớn có kích thước 200 đế n

800 kb Qua nhữ ng thí nghiệm chuyể n đế n những chủng không độc (không có plasmid này), đã khẳ ng đi ̣nh plasmid này cầ n thiế t cho việc ta ̣o khối u Vì vậy, plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid)

Hình 2.2.b Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a: Dưới kính

hiển vi điện tư ̉ b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên.

Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân gi ải opine, nhận biế t những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoa ̣n đươ ̣c go ̣i là T- DNA T-DNA

là một phầ n của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật (transfer-DNA) Trên đó định vị những gen ta ̣o khối u và tổng hợp opine T- DNA được giới ha ̣n bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải (LB : left border và RB: right border) Các bờ này gồm một trình tự lặp la ̣i củ a 25 bp, là trình tự nhận biế t cho việc cắt T-DNA T-DNA được đưa vào DNA thực vật trong nhân tế bào Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép Quá trình lây nhiễm được mô tả ở hình 2.2.c

Hình 2.2.c Sơ đồ lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

Ở opine người ta phân biệt octopin và nopalin Một số loài vi khuẩn A.tumefaciens chứ a Ti-plasmid của loa ̣i octopin và loa ̣i khác của nopalin

Những plasmid octopin chỉ có thể tạo octopin và phân giải chúng, nhưng không

ta ̣o và phân giải đươ ̣c nopalin

Một sự khác biệt khác củ a các loa ̣i plasmid ở Agrobacterium là Ti- plasmid của loa ̣i nopalin chứ a một bản copy của T-DNA, ngươ ̣c la ̣i plasmid octopin chứa

Hình 2.2.d Ti-Plasmid của Agrobacterium da ̣ng nopalin T-DNA:

Transfer-DNA, LB: Bờ trái RB: Bờ phải, ori: khởi đầ u sao chép của A tumefaciens noc: Phân giải nopalin, noc: Tổng hợp nopalin tmr: Tổng hợp cytokinin, tms: Tổng hơ ̣p auxin, tra: Vận chuyể n tiế p hơ ̣p, vir: Vùng virulence (vùng độc tính)

Điề u kiện cho việc chuyể n T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bi ̣ thương Khi tế bào bị thương chúng tiế t ra các hơ ̣p chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan tro ̣ng trong việc nhận biết và sự gắn kế t giữa vi khuẩn và tế bào thực vật

Cơ chế nhận biết đươ ̣c giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A tumefaciens với

cây hai lá mầ m, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ ở một ít loài Vì vậy,

sung syringon người ta có thể biế n na ̣p nấ m bằ ng A tumefaciens Thực vật một

lá mầm quan tro ̣ng như ngô có thể được biến na ̣p bằng A tumefaciens

+ Khối u xuất hiện bằng những gen củ a A tumefaciens

Sự phát triể n khối u sau khi nhiễm A tumefaciens dựa trên tác du ̣ng c ủ a hai phytohormone Các enzyme cầ n thiế t cho tổng hơ ̣p phytohormone được mã hóa chủ yế u từ những gen trên T-DNA Sự tổng hơ ̣p auxin đươ ̣c thực hiện bởi hai

gen là tms1 và tms2 Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác

cho sự biế n đổi tryptophan thành indol-3-aceamid Sả n phẩm của gen tms2 là

indol-3-acetamid-hydrogenase, xúc tác để ta ̣o ra auxin: indolylacetic acid

Ngoài raT-DNA còn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase

Enzyme này gắ n 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hơ ̣p nên tiề n

cytokinin là isopentenyladenin và isopentenyladenosin Hydroxyl hóa tiề n cytokinin bằ ng nhữ ng enzyme thực vật để ta ̣o nên cytokinin Auxin đ ươ ̣c ta ̣o nên cùng với cytokinin làm cho khối u lớn lên, trong đó sự phân chia tế bào không phân hóa được kích thích

Hình 2.2.e Cấu ta ̣o của indol-3-acetate (một auxin) và zeatin (một cytokinin)

một gen ở vùng vir Sự nhận biế t bằ ng chất nhận dẫn đế n sự hoa ̣t hóa của tất cả gen vir Vùng vir bao gồm nhiề u gen Một sa ̉n phẩ m gen vir khác là một

endonuclease nhận biế t bờ phải và trái của T-DNA và cắt T- DNA ở những vi ̣ trí này Sau đó, một protein gắn vào sơ ̣i đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyể n vào thực vật dưới tác du ̣ng củ a các sản phẩm gen vir