Phân lập các gen có giá trị kinh tế của cây trồng nông lâm nghiệp việt nam, thiết kế vector, tạo các chủng agrobacterium phục vụ cho tạo giống cây trồng chuyển gen

Nông Văn Hải & Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Chịu trách nhiệm và thực hiện chính phần lớn các nội dung của đề tài; điều phối toàn bộ đề tài; Phân lập, xác định

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

PHÂN LẬP CÁC GEN CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA CÂY TRỒNG NÔNG LÂM NGHIỆP VIỆT NAM, THIẾT KẾ VECTOR,

TẠO CÁC CHỦNG AGROBACTERIUM PHỤC VỤ

CHO TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

CNĐT : NÔNG VĂN HẢI

8907

HÀ NỘI – 2011

Hà Nội, ngày tháng năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên: Nông Văn Hải

Ngày, tháng, năm sinh: 01/12/1953 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: PGS.TS

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp

Chức vụ: Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng TN trọng điểm Công nghệ gen

Điện thoại: Tổ chức: 04 38363222 Nhà riêng: 04 38562380 Mobile: 0904102458 Fax: 04 38363222

E-mail: vhnong@ibt.ac.vn

Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học

và công nghệ Việt Nam

Địa chỉ tổ chức: 18-Hoàng Quốc Việt, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: 11/44 Nguyễn Phúc Lai, Đống Đa, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học

Điện thoại:04 38362599 Fax: 04 38363144

Website: www.ibt.ac.vn

Địa chỉ: 18-Hoàng Quốc Việt, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Trương Nam Hải

Số tài khoản: 931 01 064

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: 48 tháng từ năm 2006 đến tháng 10/ năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 07/năm 2006 đến tháng 2/năm 2011

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi: Số kinh phí thực tế đạt được thấp hơn so với tổng kinh phí

được duyệt theo hợp đồng số 16HĐ/TC-KHCN ngày 25/06/2007 và số11HĐ/

TC-KHCN ngày 03/07/2008 là do kinh phí đã bị trừ tiết kiệm năm 2008 và

kinh phí điều chỉnh theo QĐ số 1776/QĐ- BNN-KHCN ngày 23/06/2010

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn,

phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn

bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

2 492/BNN-KHCN

ngày 18/01/2007

Thông báo kế hoạch vốn sự nghiệp khoa học năm 2006 cho các đề tài CNSH NN 2006

3

16HĐ/TC-KHCN ngày

25/06/2007

Hợp đồng trách nhiệm về việc thực hiện đề tài NCKH

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

KH&CN Việt Nam: (Phụ trách: PGS

TS Nông Văn Hải)

& Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện CNSH, Viện KH&CN Việt

Chịu trách nhiệm và thực hiện chính phần lớn các nội dung của đề tài; điều phối toàn bộ đề tài;

Phân lập, xác định trình tự 5-

10 (gen/promoter);

thiết kế 5-10 vector biểu hiện;

được 11 chủng

Agrobacterium;

biểu hiện tạm thời 5 cấu trúc vector; chuyển gen vào cây thuốc lá kiểm tra mức độ tồn tại và sự biểu hiện của 6 cấu trúc vector, chuyển giao 4

TS Nông Văn Hải, Phó Trưởng phòng: TS

Lê Thị Thu Hiền)

giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

chủng cho các đơn vị khác

KH&CN Việt Nam (Trưởng phòng:

PGS.TS Lê Trần Bình;

Phó Trưởng phòng: TS

Chu Hoàng Hà)

Phân lập xác định trình tự 2-

4 (gen/promoter);

thiết kế 2-4 vector tạo 2-4 chủng

Agrobacterium;

kiểm tra trên cây mô hình;

chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Phân lập và xác định trình

tự được 3 gen; Phối hợp chuyển gen vào cây mô hình thuốc lá 6 cấu trúc; Phối hợp trong nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời trên lá thuốc lá

TS Đỗ Năng Vịnh, Phó Trưởng Bộ môn: TS

Nguyễn Văn Đồng)

Phân lập, xác định trình tự 1-

2 (gen/promoter), thiết kế 1-2 vector biểu hiện; tạo 1-2 chủng

Agrobacterium;

kiểm tra trên cây mô hình

Phân lập và xác định trình

tự 1 promoter

từ cây lúa, thiết

kế được 1 vector, tạo được 2 chủng

Agrobacterium;

chuyển gen gus

và promoter vào cây lúa để kiểm tra trên cây mô hình

KH&CN Việt

Phân lập, xác định trình tự 1-

2 (gen/promoter);

thiết kế 1-2 vector biểu

Phân lập và xác định trình

tự 2 gen liên quan đến tính chịu hạn từ cây lúa;

PGS.TS Nguyễn

Đức Thành)

Nam (Trưởng phòng:

PGS.TS

Nguyễn Đức Thành)

hiện; tạo 1-2 chủng

Agrobacterium

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 PGS TS Nông

Văn Hải

PGS TS

Nông Văn Hải

Chịu trách nhiệm và thực hiện chính phần lớn các nội dung của

đề tài; điều phối toàn bộ

đề tài;

Chịu trách nhiệm

và thực hiện chính phần lớn các nội dung của đề tài;

điều phối toàn bộ

đề tài; tham gia phân lập được 6 promoter; 5 gen;

thiết kế được 11 cấu trúc vector, tạo được 11

và sự biểu hiện của 6 cấu trúc vector, chuyển giao 4 chủng cho các đơn vị khác

2 TS Lê Thị Thu

Hiền

TS Lê Thị Thu Hiền

Phân lập, xác định trình tự 5-

10 (gen/promoter); thiết kế 5-10 vector biểu hiện; tạo 5-10

Tham gia phân lập được 6 promoter; 5 gen;

thiết kế được 11 cấu trúc vector, tạo được 11

chủng

chủng

Agrobacteriu m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Agrobacterium;

biểu hiện tạm thời

5 cấu trúc vector; chuyển gen vào cây thuốc lá kiểm tra mức độ tồn tại

và sự biểu hiện của 6 cấu trúc vector, chuyển giao 4 chủng cho các đơn vị khác

3 TS Lê Văn

Sơn

TS Lê Văn Sơn

Phân lập xác định trình tự 2-4

(gen/promoter); thiết kế 2-

4 vector tạo 2-4 chủng

Agrobacteriu m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Tham gia phân lập và xác định trình tự được 3 gen; Phối hợp chuyển gen vào cây mô hình thuốc lá 6 cấu trúc; Phối hợp trong nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời trên lá thuốc

lá

4 TS Trần Thị

Phương Liên

TS Trần Thị Phương Liên

Phân lập, xác định trình tự 5-

10 (gen/promoter); thiết kế 5-10 vector biểu hiện; tạo 5-10 chủng

Agrobacteriu m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Tham gia phân lập được 6 promoter; 5 gen; thiết kế được 11 cấu trúc vector, tạo được 11

chủng

Agrobacterium;

biểu hiện tạm thời

5 cấu trúc vector; chuyển gen vào cây thuốc lá kiểm tra mức độ tồn tại

và sự biểu hiện của 6 cấu trúc vector, chuyển giao 4 chủng cho

các đơn vị khác

5 PGS TS Chu

Hoàng Hà

PGS TS Chu Hoàng Hà

Phân lập xác định trình tự 2-4

(gen/promoter); thiết kế 2-

4 vector tạo 2-4 chủng

Agrobacteriu m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Tham gia phân lập và xác định trình tự được 3 gen; Phối hợp chuyển gen vào cây mô hình thuốc lá 6 cấu trúc; Phối hợp trong nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời trên lá thuốc

Phân lập, xác định trình tự 5-

10 (gen/promoter); thiết kế 5-10 vector biểu hiện; tạo 5-10 chủng

Agrobacteriu m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Tham gia phân lập được 6 promoter; 5 gen; thiết kế được 11 cấu trúc vector, tạo được 11

chủng

Agrobacterium;

biểu hiện tạm thời

5 cấu trúc vector; chuyển gen vào cây thuốc lá kiểm tra mức độ tồn tại

và sự biểu hiện của 6 cấu trúc vector, chuyển giao 4 chủng cho các đơn vị khác

Phân lập, xác định trình tự 5-

10 (gen/promoter); thiết kế 5-10 vector biểu hiện; tạo 5-10 chủng

Agrobacteriu

Tham gia phân lập được 6 promoter; 5 gen; thiết kế được 11 cấu trúc vector, tạo được 11

chủng

Agrobacterium;

biểu hiện tạm thời

m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

5 cấu trúc vector; chuyển gen vào cây thuốc lá kiểm tra mức độ tồn tại

và sự biểu hiện của 6 cấu trúc vector, chuyển giao 4 chủng cho các đơn vị khác

8 PGS (GS) TS

Lê Trần Bình

GS TS Lê Trần Bình

Phân lập xác định trình tự 2-4

(gen/promoter); thiết kế 2-

4 vector tạo 2-4 chủng

Agrobacteriu m; kiểm tra

trên cây mô hình; chuyển giao, phối hợp thử nghiệm trên cây trồng đích

Tham gia phân lập và xác định trình tự được 3 gen; Phối hợp chuyển gen vào cây mô hình thuốc lá 6 cấu trúc; Phối hợp trong nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời trên lá thuốc

Phân lập, xác định trình tự 1-2

(gen/promoter); thiết kế 1-

2 vector biểu hiện; tạo 1-2 chủng

Agrobacteriu

m

Phân lập và xác định trình tự 2 gen liên quan đến tính chịu hạn từ cây lúa;

10 TS Nguyễn

Văn Đồng

TS Nguyễn Văn Đồng

Phân lập, xác định trình tự 1-2

(gen/promoter), thiết kế 1-

2 vector biểu hiện; tạo 1-2 chủng

Agrobacteriu

Phân lập và xác định trình tự 1 promoter từ cây lúa, thiết kế được 1 vector, tạo được 2 chủng

Agrobacterium;

chuyển gen gus

m; kiểm tra

trên cây mô hình

và promoter vào cây lúa để kiểm tra trên cây mô hình

- Lý do thay đổi ( nếu có):

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1 Tư vấn và đào tạo cán bộ về

vấn đề thiết kế vector chuyển

gen thực vật, giúp đỡ về đánh

giá sự biểu hiện gen trên cây

mô hình Cử một cán bộ đi học

tại Viện Di truyền thực vật và

Nghiên cứu cây trồng (IPK),

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Người,

cơ quan thực hiện

1 Báo cáo tổng quan và cơ sở

dữ liệu đủ thông tin về các

sáng chế liên quan đến cây

trồng biến đổi gen, các gen

có giá trị kinh tế và các

promoter cho chuyển gen

thực vật

11/2006 12/2010

11/2006 12/2010 PGS.TS NVHải, TS LTTHiền

-&CS.(PTNTĐCNGen& PCNADNƯD, VCNSH)

2 Bộ sưu tập 15 mẫu DNA và

RNA/cDNA từ các nguồn

tài nguyên sinh vật

11/2006- 3/2010

11/2006- 12/2010

PGS.TS NVHải,

TS CHHà, PGS

TS NĐThành &

CS (VCNSH); TS NVĐồng &CS (VDTNN)

các gen và promoter, tối ưu

hóa mã của các gen vi sinh

vật cho thích hợp biểu hiện

thực vật

- Triển khai thiết kế

Ti-plasmid vector tái tổ hợp và

tạo chủng Agrobacterium

mang các kết cấu gen mới

10/2007

11/2006-11/2006- 12/2007

PGS.TS NVHải,

TS LTTHiền, TS TTPLiên, TS CHHà, TS.LVSơn, ThS NCS NĐTôn, ThS HTTHuệ, PGS TS LTBình, PGS TS NĐThành

& CS (VCNSH);

TS NVĐồng &CS (VDTNN)

4 - Tiếp tục thiết kế và tổng

hợp các cặp mồi; nhân và

xác định trình tự các gen/

promoter khác; tối ưu hóa

mã của các gen vi sinh vật

cho thích hợp biểu hiện

thực vật

-Tiếp tục triển khai thiết kế

Ti-plasmid vector tái tổ hợp

và tạo chủng

Agrobacterium mang các

kết cấu gen mới

- Xây dựng và hoàn thiện

các quy trình đánh giá cây

mô hình chuyển gen

- Tiếp tục liên kết với các

đề tài trong Chương trình

10/200711/2006 12/2010

-PGS.TS NVHải,

TS LTTHiền, TS TTPLiên, TS CHHà, TS.LVSơn, ThS NCS NĐTôn, ThS.HTTHuệ, PGS TS LTBình, PGS TS.NĐThành

& CS (VCNSH);

TS NVĐồng &CS (VDTNN)

5 Báo cáo tổng kết hoàn

chỉnh được nghiệm thu

10/2010

8/2010-12/2010 – 2/2011

PGS.TS NVHải

&CS.(PTNTĐCN Gen,VCNSH)

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

theo

≥ 15 16

2 Bộ sưu tập các

promoter điều khiển

biểu hiện đặc hiệu

mô và cơ quan cũng

như đặc hiệu cho

từng loài khác nhau

Promoter

Bộ sưu tập các promoter điều khiển biểu hiện đặc hiệu mô

cơ quan và đặc hiệu cho từng loài, từng cơ quan khác nhau

gen liên quan đến

sinh trưởng ở cây

lâm nghiệp

Gen

3-6 gen kháng sâu, kháng bệnh vi khuẩn, virus, gen liên quan đến khả năng chín chậm của quả ở cây nông nghiệp;

- 1-2 gen liên quan đến chất lượng gỗ ở cây lâm nghiệp;

- 1-2 gen liên quan đến sinh trưởng ở cây lâm nghiệp

có giá trị kinh tế đã phân lập và sưu tập

5-10 13

vụ cho mục đích phân lập được các đoạn điều khiển

và các gen có giá trị

-1 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ các mẫu thực vật và sinh vật khác

-1 Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ các mẫu thực vật và sinh vật khác

kế và phân lập được các promoter mong muốn

- 1 Phương pháp phân lập promoter chưa biết trình tự (sử dụng

kỹ thuật genome walking)

-1 Phương pháp phân lập promoter đã biết trình tự

tổ hợp mang các kết cấu (promoter + gen có giá trị kinh tế) để chuyển vào

Agrobacterium

-1 Phương pháp thiết

kế Ti-plasmid dựa trên các vector mang gen kháng kháng sinh

và gen mã hóa enzyme chuyển hóa manose

4 Phương pháp đánh giá

sự tồn tại và mức độ

biểu hiện của các kết

cấu gen quan tâm

1-2 phương pháp đánh giá sự tồn tại

và mức độ biểu hiện của các kết

- 1 Phương pháp đánh giá sự tồn tại/ biểu hiện của gen chuyển trên cây thuốc lá

trong cây mô hình cấu gen quan tâm

trong cây mô hình

chuyển gen bằng PCR, Southern blot

và nhuộm hóa mô tế bào với X-gluc

- 1 Phương pháp biểu hiện tạm thời gen trên

lá cây thuốc lá

5 Quy trình chuyển gen

vào cây mô hình thông

qua Agrobacterium

1-2 quy trình chuyển gen vào cây mô hình

- 1 Quy trình chuyển gen vào cây mô hình thông qua

Số lượng, nơi công bố

và quốc tế

7 bài báo đã được công bố

- 5 bài trong Tạp chí Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ

- 2 bài tại Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, tổ chức tại Thái Nguyên tháng 11/2009

d) Kết quả đào tạo:

2 Tiến sỹ 1 -1 NCS đã bảo vệ cơ sở,

đang chờ bảo vệ nhà nước 2011

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Đề tài đã góp phần hỗ trợ và hợp tác với các đề tài khác trong cùng Chương trình CNSHNN về nguyên vật liệu, trao đổi thông tin và kinh nghiệm nghiên cứu, qua đó góp phần thúc đẩy các nghiên cứu theo hướng CNSH hiện đại Đề tài cũng góp phần đào tạo cán bộ có trình độ chuyên môn và hợp tác quốc tế

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Ghi chú

I Báo cáo

định kỳ

Lần 1 3/12/2007 Thu thập, tách chiết DNA, RNA từ 8 mẫu nghiên

cứu, phân lập được 2 promoter và 3 gen có giá trị

Do đề tài mới bắt đầu nên một phần nội dung khoa học được đề nghị tiếp tục thực hiện trong năm sau Lần 2 10/11/2008 Đã thu thập và tách chiết DNA, RNA từ 12 mẫu

nghiên cứu, phân lập được 6 promoter và 5 gen có giá trị, thiết kế và thử nghiệm biểu hiện tạm thời được 2 cấu trúc Đề tài cơ bản đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo thuyết minh

Lần 3 10/08/2009 Đã phân lập được 7 promoter và 10 gen có giá trị,

thiết kế được 7 cấu trúc và tạo được chủng

Agrobacterium mang các cấu trúc trên Chuyển

giao được 2 chủng cho các đơn vị nghiên cứu khác

Lần 4 23/12/2010 Đã phân lập được 7 promoter và 10 gen có giá trị,

thiết kế được 12 cấu trúc và tạo được chủng

Agrobacterium mang các cấu trúc trên Thử

nghiệm biểu hiện tạm thời được 5 cấu trúc vector Chuyển vào cây thuốc lá 2 gen và promoter đã chứng minh mức độ tồn tại và biểu hiện của gen

chuyển Chuyển giao được 3 chủng cho các đơn vị nghiên cứu khác

II Kiểm tra

định kỳ

Lần 1 13/11/2007 Đề tài đã thực hiện các nội dung theo thuyết minh

được duyệt Sản phẩm là các tài liệu về chuyển gen cây trồng, 8 mẫu DNA, RNA, 2 promoter, 5 gen và 2 vector

Lần 2 23/12/2010 Đề tài đã thiết kế được vector chứa promoter

4CL1, promoter từ Ngô + gen cryIAc, tạo chủng

Agrobacterium, promoter OsNAC6 từ lúa Chuyển

giao 3 chủng Agrobacterium cho Viện KH sự sống

ĐH Thái nguyên, Viện NV Ngô

III Nghiệm

thu hàng

năm

Năm 2008 14/01/2009 Đã tiến hành thu thập thông tin của trên 500 sáng

chế, Đã thu thập được các mẫu cần thiết làm nguồn nguyên liệu để phân lập gen và promoter (ngô, cà chua, bạch đàn …) Đã tiến hành xác định được trình tự của 2 gen FT và FLC từ cây

Arabidopsis Đã phân lập được promoter 4CL từ

cây bạch đàn Đã phân lập được promoter Actin từ lúa, Ubiquitin promoter từ ngô, Sucrose Synthase promoter từ cây lúa Đã phân lập được gen mã hóa ACC oxidase từ cà chua Đã sửa được 18 điểm trên gen VIP phù hợp với mã thực vật Đã thiết kế được Ti-plasmid vector mang cấu trúc: 35S + GA20; 35S promoter + VIP sửa mã; E4 promoter + antisense ACC oxidase Đã thử nghiệm biểu hiện thành vector chuyển gen mang cấu trúc promoter và gen mã hóa Cry bằng mô hình biểu hiện tức thời trên lá; Đã thử nghiệm biểu hiện cấu trúc mang gen mã hóa VIP đã được sửa mã

Năm 2009 21/01/2010 Đã phân lập và đọc trình tự GA20 oxidase

promoter từ cây Keo tai tượng (Acacia mangium); trình tự 4CL1 promoter từ cây Bạch đàn trắng

(Eucalyptus calmadulensis); Đã phân lập được và

đang tiến hành đọc trình tự gen CryIII từ Bacillus

thuringiensis; Đã thiết kế được Ti plasmid vector

pCB301 chứa GA20 oxidase promoter + gen

GA20 oxidase, tạo chủng Agrobacterium chứa

vector tái tổ hợp này; Đã thiết kế được Ti plasmid

vector pCB301 chứa 35S promoter + gen vip3A

sửa mã, tạo chủng Agrobacterium chứa vector tái

tổ hợp này; Đã thiết kế được vector pNOV2819 chứa E4 promoter + antisense của ACC oxidase+NOS; Đã tiến hành biểu hiện thử nghiệm cấu trúc

pCB301 chứa 35S promoter + gen vip3A sửa mã;

Chuyển giao hai chủng Agrobacterum chứa vector

pCB301 tái tổ hợp cryIA(c) và SP-cryIA(c) cho đề tài ”Nghiên cứu ứng dụng

pCB301-công nghệ gen để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm”

Năm 2010 30/12/2010 Đã thu thập và phân tích thông tin của các sáng

chế liên quan đến cây trồng biến đổi gen, các gen

có giá trị kinh tế và các promoter cho chuyển gen

thực vật; Đã thiết kế được bốn Ti plasmid vector

pBI101 chứa promoter 4CL1 từ Bạch đàn trắng +

gen GUS, tạo chủng Agrobacterium chứa các

vector tái tổ hợp này; Đã thiết kế được Ti plasmid

vector pCB301 chứa Suc1 promoter từ Ngô +

gen cryIA(c), tạo chủng Agrobacterium chứa

vector tái tổ hợp này; Đã thiết kế được Ti plasmid

vector pBIH chứa promoter OsNAC6 từ lúa + gen

gus, tạo chủng Agrobacterium chứa vector tái tổ

hợp này; Đã tiến hành biểu hiện thử nghiệm cấu trúc pCB301 chứa 35S promoter + gen GA20 oxidase; Đã tiến hành biểu hiện thử nghiệm cấu trúc pCB301 chứa GA20 oxidase promoter + gen GA20 oxidase; Đã tiến hành biểu hiện thử nghiệm cấu trúc pCB301 chứa Suc1 promoter từ Ngô + gen cryIA(c); Đã chuyển gen và kiểm tra sự có

mặt của các gen vip3A tự nhiên, vip3A đã sửa mã (mvip3A) trong cây thuốc lá chuyển gen; Đã

chuyển gen và kiểm tra sự có mặt của 4CL1 promoter + gen Gus trong cây thuốc lá chuyển gen; Đã chuyển gen vào cây lúa và kiểm tra sự có mặt promoter OsNAC6 từ lúa và gen Gus bằng phản ứng PCR và nhuộm hóa mô tế bào; Chuyển

giao hai chủng Agrobacterium chứa vector pCB301 tái tổ hợp pCB301-cryIA(c);pCB301-SP-

cryIA(c) và một chủng pCB301- SP- mvip3A cho

Bộ môn Công nghệ tế bào thuộc Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên; Chuyển giao một

chủng Agrobacterium chứa vector pBI101 -

promoter 4CL1 + gen GUS cho Viện Nghiên cứu Ngô để hoàn thiện hệ thống chuyển gen trên cây

Ngô

IV Nghiệm thu

cơ sở

28/02/2011 Phương pháp nghiên cứu hiện đại, phù hợp với nội

dung nghiên cứu, có độ tin cậy cao

Đã hoàn thành đầy đủ về khối lượng, số lượng các sản phẩm khoa học như đã đăng ký, một số nội dung vượt mức Tuy nhiên, phần sản phẩm cần trình bày dạng 1,2, 3 rõ ràng để tiện theo dõi Cần

bổ sung báo cáo tóm tắt nội dung khoa học và tài liệu tập hợp sơ đồ thiết kế các vector

Các kết quả trong nghiên cứu có tính khoa học và thực tiễn cao, đề tài nên được tiếp tục và tập trung vào các gen có giá trị

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

MỞ ĐẦU

Các kỹ thuật sinh học truyền thống, như kỹ thuật lai chọn giống đã được con người sử dụng hàng ngàn năm qua để tạo ra những cây trồng có các đặc tính riêng biệt Tuy nhiên, những kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải qua nhiều thế hệ mới có được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những đặc tính không cần thiết Công nghệ sinh học sử dụng kỹ thuật gen để biến đổi cây trồng bằng cách đưa những gen có giá trị vào bộ gen của cây trồng đích và nhanh chóng, tạo ra các cây trồng biến đổi gen (GMO) mang những đặc tính mong muốn Các cây trồng này có thể đem lại những lợi ích quan trọng như tăng tính chống chịu, tăng năng suất, giảm chi phí sử dụng thuốc trừ sâu hoá học, tăng lợi nhuận và cải thiện môi trường cũng như sức khoẻ con người

Với sự phát triền mạnh mẽ của công nghệ sinh học, nhiều cây trồng biến đổi gen (GMO) đã được con người tạo ra Diện tích trồng GMO ngày càng tăng lên rõ rệt Việc sử dụng sản phẩm GMO đã trở thành hiện thực Các nước phát triển đi vào quản lý các sản phẩm GMO sao cho chúng luôn giữ được các đặc tính tốt mà không bị đào thải trong môi trường

Tuy vậy, ở nước ta, nghiên cứu và phát triển GMO ở diện rộng mới bắt đầu được khởi động Trước đây, những nghiên cứu thử nghiệm thiết kế các vector mang gen chỉ thị, thử nghiệm chuyển gen trên cây mô hình đã có những kết quả bước đầu Để tạo được những GMO đặc thù cho nền nông, lâm nghiệp nước ta, cần có những nghiên cứu sâu về phân lập các gen, các promoter đặc hiệu từ các loài cây trồng Việt Nam Tiếp theo đó, thiết kế các vector chuyển gen thích hợp để đưa vào thực vật bằng các phương pháp chuyển gen có hiệu quả là một khâu chủ chốt, quyết định thành công của quá trình này Việc thử nghiệm chuyển gen trên cây mô hình, như thuốc lá,

Arabidopsis, lúa là bước đầu tiên minh chứng cho khả năng biểu hiện của gen

khi sử dụng các vector đã thiết kế

Tạo được cây chuyển gen hữu hiệu là một quá trình kéo dài nhiều năm (10-15 năm, thậm chí lâu hơn), bao gồm nhiều bước từ phân lập gen, thiết kế vector, chuyển gen vào cây trồng mong muốn để tạo được cây vừa có tính trạng mong muốn, vừa có năng suất cao, chất lượng tốt

Đề tài “ Phân lập các gen có giá trị kinh tế của cây trồng nông lâm

nghiệp Việt Nam, thiết kế vector, tạo các chủng Agrobacterium phục vụ cho tạo giống cây trồng chuyển gen” là một trong những đề tài đầu tiên được

Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến năm 2020, phê duyệt thực hiện trong giai đoạn 2006-2010, góp phần tham gia khởi động các nghiên cứu

và phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về cây trồng biến đổi gen

Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen (GMO) là một lĩnh vực công nghệ cao

có lịch sử phát triển hơn ba thập kỷ vừa qua Việc áp dụng kỹ thuật gen để tạo cây trồng biến đổi gen nói chung phải mất một thời gian lâu dài hàng chục năm mới thu được kết quả Những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên đã sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium để đưa gen ADH của nấm men và gen kháng kanamycin vào cây

thuốc lá Đến nay, rất nhiều loài cây trồng đã được chuyển gen thành công, như đậu tương, ngô, bông, cà chua, khoai tây, cải dầu, hướng dương, dưa hấu, khoai lang… Thông thường chuyển gen sử dụng hai nhóm phương pháp chính: chuyển gen gián

tiếp thông qua Agrobacterium và chuyển gen trực tiếp (xung điện, bắn gen )

Các nghiên cứu bao gồm: hoàn thiện các quy trình, phương pháp chuyển gen; thực hiện việc chuyển gen có hiệu quả cho nhiều đối tượng cây trồng, thực vật khác nhau; tìm biện pháp tăng cường sự biểu hiện của các gen có giá trị trong cây trồng (sử dụng promoter mạnh để điều khiển gen, cắt bớt gen và biến đổi mã di truyền của chúng cho phù hợp với mã thực vật ) Nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp nhân tạo một phần hoặc toàn phần trình tự gen có giá trị và sử dụng các

mã di truyền phù hợp với từng loài cây trồng nhất định (Perlak et al., 1991; Altosaar et al., 1997) Với những cải tiến đa dạng, hiệu quả chuyển gen và mức độ

biểu hiện của hàng loạt gen có giá trị trong cây trồng biến đổi gen đã tăng lên rất nhiều Hoạt tính gây độc của protein Cry cải biến – protein độc tố có hoạt tính diệt

côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) do gen cry mã hoá, có thể cao gấp 100 lần so với hoạt tính của protein độc tố tự nhiên (Perlak et al., 1991; Cheng

et al., 1998) Ishida et al (1996) với phương pháp nuôi cấy Agrobacterium mang

vector hai nguồn với phôi ngô chưa trưởng thành cho hiệu quả chuyển gen tăng từ

5% lên 30% Sử dụng hệ thống vector hai nguồn chuẩn, Frame et al (2002) đã

hoàn chỉnh quy trình chuyển gen vào ngô với hiệu quả cao Đến nay, những nghiên

cứu tạo cây trồng biến đổi gen và triển khai ứng dụng chúng vào thực tiễn đời sống

đã phát triển sâu rộng trên phạm vi toàn cầu và đem lại những lợi ích to lớn cho toàn nhân loại Nhờ sử dụng kỹ thuật hiện đại này, số lượng các gen có giá trị kinh

tế được chuyển vào bộ gen thực vật cũng như số lượng các loài cây trồng có giá trị

đã được cải biến di truyền theo hướng tăng chất lượng sản phẩm, tạo tính kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng… đã tăng lên nhanh chóng Hàng năm, nhiều triệu hecta diện tích đất canh tác trên thế giới đã được gieo trồng đại trà các giống cây trồng này

Trong giai đoạn 10 năm (1996-2005), diện tích đất canh tác cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu đã tăng liên tục tới hơn 50 lần (từ 1,7 triệu hecta vào năm 1996 lên 90 triệu hecta trong năm 2005) Năm 2005, GMO đã được gieo trồng ở 21 quốc gia với sự tham gia của 8,5 triệu nông dân Trong đó, gần hai phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia phát triển như Hoa Kỳ, Canada, Australia, Tây Ban Nha và hơn một phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia đang phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines (châu Á); Argentina, Brazil, Mexico, Uruguay, Paraguay (Mỹ Latin) và Nam Phi (châu Phi) Tới 60% của tổng diện tích đất canh tác đậu tương trên thế giới (90 triệu hecta) đã gieo trồng các giống đậu tương biến đổi gen Con số này là 56% trong năm 2004 Đối với ngô, 14% trên tổng số 147 triệu hecta diện tích đất trồng ngô đã sử dụng các giống ngô biến đổi gen Ở bông, con số này là 28% trên tổng số 35 triệu hecta Trong khi đó, cây cải dầu biến đổi gen được gieo trồng khoảng 18% trên tổng số 26 triệu hecta đất canh tác cây trồng này (James, 2005)

Năm 2010 đánh dấu 15 năm thương mại hóa GMO, các quốc gia đã và đang tham gia mạnh mẽ vào lĩnh vực nghiên cứu và thương mại GMO trải khắp 6 lục địa: Bắc Mỹ, Mỹ Latinh, châu Á, châu Đại Dương, châu Âu và châu Phi, trong đó, dẫn đầu là Hoa Kỳ (64 triệu hecta), Brazil (21,4 triệu hecta), Argentina (21,3 triệu hecta); Ấn Độ (8,4 triệu hecta) và Canada (8,2 triệu hecta) (James, 2010) Trong những năm từ 1996-2009 , diện tích đất canh tác GMO trên quy mô toàn cầu đã

tăng liên tục Đến năm 2010, diện tích canh tác GMO là 148 triệu ha, làm cho tổng diện tích tính gộp cho tất cả các năm đã vượt lên trên 1 tỷ ha (lớn hơn cả diện tích toàn bộ nước Mỹ - 937 triệu ha hay Trung Quốc – 956 triệu ha) và đạt kỷ lục tăng

87 lần diện tích kể từ năm 1996 Năm 2010, GMO đã được gieo trồng ở 29 quốc gia (so với 2005 có thêm 8 nước) với sự tham gia của 15,4 triệu nông dân, trong đó

có 10 nước gieo trồng trên 1 triệu ha (Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Ấn Độ, Canada, Trung Quốc, Paragoay, Pakistan, Nam Phi và Urugoay) Các loại GMO được trồng nhiều nhất hiện nay là đậu tương, bông, ngô và cải dầu với hai tính trạng được sử dụng phổ biến là tính trạng kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng Các quốc gia đang phát triển ở châu Á, dẫn đầu là Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan một số nước ASEAN như Philippines, Myanma đã nằm trong số các nước sản xuất thương mại các giống GMO (James, 2010) Trung Quốc đứng thứ hai sau Hoa Kỳ về đầu tư cho công nghệ sinh học nông nghiệp, đã đưa vấn đề nghiên cứu và phát triển GMO thành một trong các hướng khoa học và công nghệ ưu tiên với sự tham gia của hàng trăm phòng thí nghiệm

1.2 Một số tính trạng thường được nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng

Cho đến nay, hai tính trạng được sử dụng phổ biến là tính trạng kháng thuốc

diệt cỏ và kháng côn trùng Đậu tương có khả năng kháng thuốc diệt cỏ là GMO được trồng trên diện rộng nhất Nếu tính trên tổng diện tích đất canh tác cây GMO trên toàn cầu thì diện tích đất canh tác giống cây trồng này chiếm tới 60% (54,4 triệu hecta/ tổng 90 triệu hecta) Chúng được trồng để thương mại ở Hoa Kỳ, Argentina, Brazil, Paraguay, Canada, Uruguay, Romania, Nam Phi và Mexico Ngô

Bt là giống cây trồng thứ hai được canh tác trên diện rộng (chiếm 13% tổng diện

tích đất canh tác GMO trên toàn cầu) Ngoài ra, các giống cây trồng mang cả hai tính trạng trên có mặt trên 7% diện tích đất canh tác (James, 2005) Ngoài ra, rất nhiều tính trạng khác cũng được chuyển vào cây trồng Tuy nhiên, các giống GMO này mới được trồng ở quy mô nhỏ hoặc chưa được thương mại hoá như đu đủ có khả năng kháng lại virus gây bệnh đốm vòng (ringspot virus); lúa chuyển gen nhờ

công nghệ sinh học hiện đại có thể kháng lại virus gây bệnh đốm vòng; chuối có thể

sản xuất vaccine, lúa vàng (GoldenRiceTM) sản sinh β-caroten, dẫn xuất của tiền vitamin A Nhìn chung, hiện nay thương mại hoá GMO tập trung chủ yếu vào các giống khác nhau của bốn loài cây trồng chính: đậu tương, ngô, cải dầu và bông (James, 2005, 2010)

Ngay từ năm 2002, cây trồng chuyển gen có khả năng sinh ra các độc tố kháng

sâu có nguồn gốc Bt đã được trồng trên hơn 62 triệu hecta trên toàn thế giới Ưu điểm nổi bật của các cây chuyển gen cry là khá bền vững trong điều kiện trồng tự

nhiên và giúp cây trồng kháng được tương đối nhiều loài sâu bệnh Do đó, nhiều

loại cây trồng chuyển gen chứa một hoặc nhiều gen cry đã được nghiên cứu,

thương mại hóa rộng rãi và đang là các loại cây trồng đóng vai trò rất quan trọng trên thị trường nông sản (Nei, Kumar, 2000) Tuy nhiên, qua nhiều năm được trồng

đại trà tại Mỹ và một số nước khác trên thế giới, các cây chuyển gen cry đã bộc lộ

nguy cơ bị giảm khả năng kháng sâu do nhiều quần thể sâu bệnh đã tiến hóa và có khả năng đề kháng với độc tố Cry được tiết ra trong cây (Ferré, Van Rie, 2002; Lee

et al., 2003) Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các protein diệt sâu thế hệ thứ hai

có phổ diệt sâu rộng hơn và khắc phục được hiện tượng sâu kháng cũng đã được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm

Các protein Vip, trong đó có Vip3A, nằm trong số các protein diệt sâu thế hệ thứ hai được đánh giá có khả năng tiêu diệt hiệu quả nhiều loài sâu hại Trên thế giới, protein Vip3A đã được nghiên cứu và ứng dụng biểu hiện trên bông

(Gossypium hirsutum L.) và ngô (Zea mays L.) - các cây công nghiệp và lương thực

chính của Australia, New Zealand, nhiều nước châu Âu và Bắc Mỹ Cây chuyển

gen vip3A không những có phổ kháng sâu rộng hơn mà còn khắc phục được tình trạng sâu kháng bắt gặp ở các cây chuyển gen thuộc họ cry (Singh et al., 2008)

Năm 2006, dòng bông chuyển gen COT102 đã được tạo ra bằng cách chuyển

gen vip3A thông qua Agrobacterium (Food Standards Australia New Zealand, 2006) Trong cấu trúc chuyển gen vào cây bông, gen vip3A được tổng hợp nhân

tạo, chứa tất cả các bộ ba phù hợp với sự phân hóa sử dụng mã di truyền trong cây bông và chịu sự điều khiển của actin-2 promoter (promoter đã được phân lập từ

Arabidopsis thaliana L.) nhằm biểu hiện cơ định gen vip3A trên toàn bộ cây Các

cây chuyển gen ổn định sau khi đã được chọc lọc trên môi trường chứa hygromycin qua 5 thế hệ tự thụ phấn và qua 3 lần lai trở lại được trồng thử nghiệm trên đồng ruộng Trong hầu hết các mô và các giai đoạn lấy mẫu, tính trung bình protein Vip3A đã được biểu hiện trên toàn bộ cây với hàm lượng 1 - 73 µg protein Vip3A/

g trọng lượng khô Kết quả diệt sâu thử nghiệm cho thấy sự biểu hiện của protein Vip3A trong dòng bông COT102 đã bảo vệ cây khỏi sự tấn công của ấu trùng của

nhiều loài sâu Cánh vảy hại bông như sâu xám (Agropis ipsilon), sâu khoang (Spodoptera frugiperda), sâu xanh (S exigua), sâu đục chồi thuốc lá (Heliothis virescens), sâu xanh hại ngô và bông (Helicoverpa zea), sâu xanh đục quả (H armigera) và sâu hại chồi (H punctigera) Ngoài ra, Vip3A còn hoạt động vô cùng

đặc hiệu Protein này chỉ thể hiện độc tính đối với ấu trùng của một số loài sâu Cánh vảy nhất định và hoàn toàn an toàn đối với cây trồng và người sử dụng (http://www.foodstandards.gov.au)

Năm 2008, dòng ngô chuyển gen MIR162 chứa gen kháng sâu vip3Aa20

không sửa mã đã được Cục Tiêu chuẩn Thực phẩm Australia - New Zealand phê chuẩn, cho phép trồng đại trà trên đồng ruộng

Ngoài ra, trong những năm gần đây, để tăng hiệu quả diệt sâu hại trên cây trồng, hai hoặc nhiều gen kháng côn trùng đã được kết hợp biểu hiện cùng nhau trong cùng một cây chuyển gen Các mô hình lý thuyết dự đoán rằng các thực vật

cùng biểu hiện hai gen gây độc khác nhau của Bt sẽ có xu hướng hạn chế hiệu quả

hơn khả năng đề kháng của quần thể sâu bệnh đích so với các cây chỉ chứa một gen

gây độc Năm 2001, ba gen kháng sâu cry1Ac, cry2A và gna (mã hóa lectin ở cây bạch đầu ông) cùng được chuyển vào lúa (Oryza sativa giống M7 và Basmati 370)

(Maqbool, 2001) Các protein Cry1Ac, Cry2A và GNA đã được biểu hiện hoặc riêng lẻ hoặc cùng nhau trong các cây chuyển gen với các mức độ khác nhau, lần

lượt chiếm 0,03 - 1%, 0,01 - 0,5% và 0,01 - 2,5% tổng số protein hòa tan thu được Các gen chuyển đều thể hiện sự biểu hiện bền vững qua nhiều thế hệ cây và đã giúp các cây chuyển gen kháng lại hiệu quả sự tấn công của ba loại sâu hại lúa quan

trọng nhất là sâu cắn lá (Cnaphalocrocis medinalis), sâu đục thân (Scirpophaga incertulas) và bọ nhảy (Nilaparvata lugens) Gen vip3A cùng với gen cry1Ac đã

được nghiên cứu chuyển vào ngô (Dively, 2005) và bông (Adamczyk, Mahaffey, 2008) Cả hai nghiên cứu này đều chỉ ra rằng cây được chuyển đồng thời hai gen

vip3A và cry1Ab có khả năng ức chế sự phát triển và lây lan của nhiều loài sâu

thuộc bộ Cánh vảy hiệu quả hơn hẳn so với cây chuyển gen chỉ chứa một trong hai

gen Rõ ràng, các kết quả nghiên cứu này đã một lần nữa cho thấy gen vip3A đang

hứa hẹn rất nhiều triển vọng trong việc tạo ra một thế hệ cây trồng kháng sâu tự nhiên thân thiện với môi trường

Riêng đối với các cây trồng lâm nghiệp, việc lai tạo giống mới theo các kỹ thuật truyền thống thường gặp nhiều khó khăn do chu kỳ sống lâu của chúng Kỹ thuật gen với những ưu điểm về thời gian và sự chủ động, do vậy cũng được ưa chuộng sử dụng để tạo cây rừng biến đổi gen Hiện nay, rất nhiều công ty công nghệ sinh học đã và đang hợp tác với những đối tác chính thuộc khối trồng rừng công nghiệp để hỗ trợ các nghiên cứu tăng tốc độ sinh trưởng của cây trồng, thay đổi chu kỳ tái sinh, tăng tính kháng đối với một số thuốc diệt cỏ hay sâu bệnh nhất định, cũng như tăng khả năng sinh trưởng trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt… Đặc biệt, nghiên cứu thay đổi cấu trúc gỗ như thay đổi thành phần lignin được quan tâm đặc biệt Hàm lượng lignin trong gỗ được tăng lên tạo tính bền vững cho những loại gỗ sử dụng để chế tạo các vật dụng yêu cầu độ bền cao và giảm thấp cho những loại gỗ sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bột giấy và giấy (FAO, 2004) Cần nhấn mạnh rằng, mặc dù các nghiên cứu sinh học liên quan đến cây lâm nghiệp còn khá mới mẻ so với cây nông nghiệp, trên toàn cầu số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây lâm nghiệp biến đổi gen cũng tăng khá nhanh Các nghiên cứu gần đây cho thấy, từ năm 1988 đến 1999 trên toàn cầu có 194 thử nghiệm đồng ruộng các cây lâm nghiệp biến đổi gen Các thử nghiệm chủ yếu tập trung trên đối

tượng là cây dương - nguyên liệu sản xuất giấy Hoa Kỳ là quốc gia có số lượng các thử nghiệm đồng ruộng đối với cây lâm nghiệp biến đổi gen nhiều nhất, chiếm 74% tổng các thử nghiệm toàn cầu (Asante-Owusu, 1999)

Theo thống kê của FAO (2004), đã có 35 nước trên thế giới tiến hành nghiên cứu biến đổi di truyền trên cây lâm nghiệp, trong đó có 16 nước đã triển khai thử nghiệm đồng ruộng Các thử nghiệm này nhìn chung còn ở quy mô nhỏ với thời gian ngắn và đa phần các thử nghiệm đồng ruộng này bị hủy bỏ trước khi hạt của cây kịp phát tán Ở những nước còn lại, các nghiên cứu dừng ở mức trong phòng thí nghiệm hoặc ở nhà kính Trong số, các thử nghiệm đồng ruộng cây lâm nghiệp biến đổi gen đã được tiến hành ở một số nước thì Hoa Kỳ là nhiều nhất chiếm 74% tổng

các thử nghiệm toàn cầu Populus là chi đầu tiên có các cây biến đổi di truyền vào

năm 1986 Các cây thuộc chi này được nghiên cứu biến đổi di truyền nhiều nhất, các thử nghiệm đồng ruộng cũng chủ yếu tập trung trên đối tượng này sau đó là đến

Pinus, Eucalyptus (FAO, 2004)

Mặc dù, hầu hết các cây lâm nghiệp chủ đạo trên toàn thế giới đã được chuyển gen thành công và có sự biểu hiện ổn định của gen chuyển Nhưng chỉ duy nhất

Trung Quốc có cây Dương (Populus ) chuyển gen được trồng thương mại vào năm

2002 Đó là cây Populus nigra được chuyển gen cryIAc và cây Populus lai được chuyển gen cryIAc và gen API (FAO, 2004) Đến năm 2008 diện tích trồng các cây

chuyển gen này đạt khoảng 500 ha So với 125 triệu ha cây nông nghiệp chuyển gen được trồng cho mục đích thương mại trên toàn cầu thì diện tích trồng cây lâm nghiệp chuyển gen thương mại nhỏ hơn cây nông nghiệp rất nhiều (FAO, 2010) Đến năm 2009, diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn thế giới đã tăng lên 134 triệu ha nhưng diện tích trồng cây lâm nghiệp chuyển gen vẫn không tăng (James, 2009)

Nghiên cứu chuyển gen trên các loài Populus đã có khá nhiều và rất sớm bởi cây Populus rất có giá trị với thương mại, đồng thời Populus được coi như cây mô

hình trong các nghiên cứu về cây gỗ lớn do có đặc điểm hệ gen nhỏ, sự thích nghi

về sinh thái rộng, khá dễ dàng khi tiến hành các thao tác di truyền (Tuskan et al., 2004) Đến năm 1995, các nhà nghiên cứu đã chuyển gen gus dưới sự điều khiển của CAD promoter (cinnamyl alcohol dehydrogenase) được phân lập từ cây E gunnii để chuyển vào cây lai giữa P tremula và P alba nhằm đánh giá khả năng

điều khiển của CAD promoter Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy vai trò của CAD trong sự hình thành lignin, sự biểu hiện của CAD ở các tế bào nhu mô có thể cung cấp tiền chất cho các tế bào bên cạnh như tế bào sợi, tế bào bó mạch để tổng

hợp lignin (Feuillet et al., 1995) Cây lai giữa P tremula và P alba cũng được chuyển gen GS1 (glutamine synthetase) (Gallardo et al., 1999) So với cây không

chuyển gen, các cây chuyển gen được thử nghiệm đồng ruộng đã đạt độ cao lớn

hơn 21% trong năm thứ nhất, 36% trong năm thứ 2 và 41% năm thứ 3 (Jing et al., 2004) Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro còn cho thấy cây chuyển gen GS này còn

có khả năng chống chịu với phosphinothricin (PPT) tốt hơn (Pascual et al., 2008) Năm 2002, cây P nigra chuyển gen kháng sâu cryIA(c) và gen mã hóa API

(proteinase inhibitor) đã được trồng cho mục đích thương mại ở Trung Quốc (FAO

2004), hoạt tính kháng côn trùng và sự biểu hiện ổn định của Populus lai mang 2

gen kháng côn trùng đã được chứng minh trong nghiên cứu của Yang và cộng sự,

2003(Yang et al., 2003) Sự biểu hiện của các gen Bt ở các cây Populus chuyển gen không gây ảnh hưởng đến thành phần hóa học trong thân cây (Mark et al., 2006) Cây lai giữa P tremula với P.tremuloides được chuyển gen GA làm tăng tốc

độ phát triển và tăng sinh khối đã được đăng ký bảo hộ sáng chế năm 2007

(2007/0061924A1 2007)

Trên đối tượng cây keo, các nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium đã được công bố Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium, Xie và Hong (2002) đã chuyển được gen chỉ thị gus đặt dưới sự điều khiển của CaMV35S promoter trong Ti-plasmid vector hai nguồn pB1121 vào cây keo tai tượng (Acacia mangium) và đăng ký bảo hộ sáng chế này ở Hoa Kỳ (Patent US6846971) Những

công bố gần đây cho thấy, không chỉ thành công đối với các gen chỉ thị, các gen có

giá trị như gen cellulase tăng chất lượng gỗ đã được chuyển thành công vào A

mangium (Sudarmonowati et al., 2004), gen bar (phân lập từ Streptomyces hygroscopicus có khả năng kháng thuốc diệt cỏ (glufosinate ammonium hay

phosphinothricin - PPT) đặt dưới sự điều khiển của CaMV35S promoter trong

vector hai nguồn pME504 được chuyển vào Acacia sinuata (Vengadesan et al.,

2006)

Trên đối tượng cây bạch đàn, gen bar và gen cry3A (phân lập từ Bt có khả năng kháng bọ cánh cứng Chrysophtharta bimaculata) đã được chuyển vào Eucalyptus camaldulensis sử dụng Agrobacterium (Harcourt et al., 2000); gen bar được chuyển vào Eucalyptus grandis (Llewellyn 2000); gen mã hóa Cinnamate 4-

Hydroxylase (C4H) - enzyme tham gia quá trình tổng hợp lignin (phân lập từ

Populus tremuloides) được chuyển vào Eucalyptus camaldulensis nhằm điều chỉnh hàm lượng lignin trong gỗ (Chen et al., 2001) Goicoechea (2005) đã nghiên cứu

EgMYB2, là yếu tố tham gia quy định sự hình thành cấu trúc bậc hai của thành tế bào và quá trình tổng hợp lignin Gen mã hóa EgMYB2 được phân lập từ

Eucalyptus grandis và được biểu hiện thành công trên cây thuốc lá Kết quả cho

thấy cây thuốc lá mang EgMYB2 có thành tế bào dày hơn nhiều và có thành phần

lignin thay đổi so với cây thuốc lá dạng dại Từ năm 1998, cây E camadulensis (Bạch đàn trắng) đã được chuyển gen gus thông qua Agrobacterium tumefaciens (Ho et al., 1998) tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyển gen khác Cây E camadulensis còn được chuyển hai gen cry3A và bar để tạo cây có tính kháng côn trùng cánh cứng và kháng thuốc diệt cỏ ammonium glufosinate (Harcourt et al.,

2000) Năm 2003, Tournier và các cộng sự đã chuyển được antisense của gen CAD

vào cây Bạch đàn lai giữa E grandis với E urophyla Các dòng cây chuyển gen

này có sự giảm mạnh hoạt tính của CAD từ 22-26% nhờ đó mà sự sinh trưởng và

tích lũy cellulose tăng lên (Tournier et al., 2003) Năm 2010, Hoa Kỳ đã phê chuẩn

cho phép thử nghiệm đồng ruộng trên 200000 cây Bạch đàn chuyển gen tại 29 điểm khác nhau với tổng diện tích là 120 ha với các tính trạng mới ở cây chuyển gen là bất dục đực nhằm ngăn chặn sự phát tán phấn hoa (do chuyển gen barnase), có khả năng chống chịu lạnh và có hàm lượng lignin giảm (http:www.gmo-

safety.eu/news/1164.release-genetically-modified-eucalyptus-approved)

Đối với thông, các nghiên cứu chuyển gen được bắt đầu ngay từ năm 1991

(Stomp et al., 1991) Đến nay, một số giống thông biến đổi gen được tạo ra bao

gồm thông có khả năng sinh trưởng nhanh nhờ biểu hiện gen mã hóa glutamine synthetase (GS), thông được thay đổi hàm lượng lignin, thông có khả năng kháng

sâu bệnh nhờ chuyển gen cry1Ac (Baucher et al., 2003) Các nghiên cứu chuyển

gen nhằm tăng cường khả năng kháng các loại côn trùng và tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi đã được tiến hành khá nhiều Năm 2003, cây

Thông loblolly (Pinus taeda L.) có khả năng kháng sâu Dendrolimus punctatus Walker và Crypyothelea formosicola Staud được tạo ra nhờ chuyển gen cryIA(c) bằng phương pháp bắn gen (Tang, Tian 2003) Sau đó, cây Thông radiata (Pinus radiata) cũng được chuyển gen cryIA(c) bằng phương pháp bắn gen, các dòng Thông chuyển gen này đã có tính kháng rất cao và ổn định với loài Teia anartoides (Grace et al., 2005) Bên cạnh đó, cây Thông loblolly còn được tăng cường tính

chống chịu muối với nồng độ cao do chuyển đồng thời hai gen Mt1D phosphate dehydrogenase) và GutD (glucitol-6-phosphate dehydrogenase) thông

(manitol-1-qua vi khuẩn A tumefaciens (Tang et al., 2005) Cây Thông loblolly cũng được

chuyển antisense của gen 4CL1 nhằm tăng cường khả năng phát triển và sự tích lũy

cellulose (Tang et al., 2005)

1.3 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, công nghệ sinh học được xem là ngành mũi nhọn Nhờ các biện pháp và chính sách khuyến khích, đầu tư hiệu quả, công nghệ sinh học ở nước ta ngày càng phát triển mạnh mẽ Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen ở nước ta có thể chia làm 3 giai đoạn: i) trước năm 2000; ii) từ 2001-2005; từ 2005 – 2006 trở lại đây

Trong giai đoạn trước năm 2000, Chương trình Công nghệ Sinh học quốc gia

đã được cấp kinh phí cho các đề tài/ dự án nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt trong cải tiến giống cây trồng và kể từ năm 1995 cấp cho các đề tài/

dự án nghiên cứu về việc phát triển kỹ thuật gen

Trong các lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt Một số công trình nghiên cứu chuyển gen chọn lọc và sàng lọc

như gen kháng kanamycin, hygromycin, gen mã hoá β-glucuronidase (gus) vào

thuốc lá, lúa đã được tiến hành nhằm mục đích hoàn thiện các kỹ thuật, quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng làm cơ sở cho các bước chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng này (Trần Thị Phương Liên & Nông Văn Hải, 1997; Nguyễn Hữu Tâm & đtg, 1998)

Từ năm 2001, Chính phủ đã đầu tư 3 đề tài/ dự án nghiên cứu sinh vật biến đổi gen Những đề tài/ dự án này liên quan đến nhiều cây trồng quan trọng của Việt Nam Bên cạnh đó, một số phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đã và đang được nhà nước đầu tư trang thiết bị hiện đại và triển khai các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen như phân lập và xác định trình tự gen, thiết kế và biến nạp gen vào tế bào

vi sinh vật, động vật, thực vật, nghiên cứu biểu hiện gen…

Trong hai giai đoạn đầu này, nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau như

phương pháp bắn gen, phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium đã được áp

dụng thành công trên hàng loạt đối tượng cây trồng quan trọng như lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà phê, thuốc lá, khoai lang (Lã Tuấn Nghĩa & đtg, 1995; Đinh Thị Phòng & đtg, 1995; Hoàng Kim Oanh & đtg, 1998; Lê Tấn Đức & đtg, 1998; Phan

Tố Phượng & đtg, 1998; Mai Trường & đtg, 1998; Nguyễn Hữu Hổ & đtg, 1999; Phạm Bích Ngọc & đtg, 2002) Việc chuyển gen vào cây thân gỗ như cây hông sử

dụng vi khuẩn Agrobacterium cũng được thực hiện (Lê Tấn Đức & đtg, 2003;

Nguyễn Văn Uyển & đtg, 2003) Cần nhấn mạnh rằng, phương pháp đưa gen vào

cây trồng nhờ vi khuẩn Agrobacterium chứa vector đặc biệt Ti-plasmid có hiệu quả

cao nên được triển khai ở nhiều phòng thí nghiệm trong cả nước và thu được kết quả khả quan trên nhiều đối tượng cây trồng quan trọng như lúa, cải xanh, cải bắp, bông, đu đủ, khoai lang… (Đặng Trọng Lương & đtg, 1999; Phạm Bích Ngọc &

đtg, 2002) Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu thường mới mang tính chất xây dựng

mô hình thí nghiệm và sử dụng các Ti-plasmid vector do nước ngoài thiết kế (Phan

Tố Phượng & đtg, 1998; Nguyễn Hữu Hổ, 1999) Để có được những vector này, bên nhận thường gặp phải những khó khăn rất lớn trong chuyển giao do liên quan đến quyền sở hữu trí tuệ Chỉ một vài nhóm nghiên cứu đã tiến hành thiết kế vector phục vụ chuyển gen vào một số đối tượng cây trồng cụ thể như thiết kế

vector mang gen cry để đưa vào cây cải bắp (Đặng Trọng Lương & đtg, 2001a;

2001b), thiết kế vector mang gen mã hóa kháng nguyên vỏ glycoprotein của virus dại để chuyển vào cây trồng tạo vaccine ăn được (Bùi Văn Thắng & đtg, 2005) Là một trong các nhóm nghiên cứu đầu tiên theo hướng này, chúng tôi đã và đang tiến hành rất nhiều đề tài nghiên cứu theo hướng công nghệ gen và protein tái

tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen vào cây trồng Các đề tài chủ yếu tập trung

hoàn thiện phương pháp chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium (Trần Thị Phương Liên & Nông Văn Hải, 1997), thu thập và phân

lập một số gen quý có giá trị kinh tế và promoter phục vụ cho nông nghiệp như gen

cry, gen mã hoá protein bất hoạt hoá ribosome (RIP) ở cây mướp đắng và gen mã

hoá α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen mã hoá protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ, promoter của gen tổng hợp đường, (Lê Thị Thu Hiền & đtg, 2001; Nguyễn Đình Cường & đtg, 2004) Các vật liệu này

đã, đang và sẽ được sử dụng để thiết kế các vector chuyển gen thực vật có giá trị (Lê Thị Thu Hiền & đtg, 2002a, b; 2004a, b, c; 2005)

Từ sau năm 2005, Chương trình công nghệ sinh học trong Nông nghiệp 2010) và Chương trình KC04/06-10 đã tài trợ cho một số đề tài nghiên cứu phân lập gen, promoter thiết kế vector và chuyển gen vào các cây trồng như Thông, Xoan ta, Bèo tấm, Lúa, Ngô, Đu đủ, Đậu tương, Cam quýt…Ví dụ nhóm nghiên cứu của Chu Hoàng Hà và cộng sự đã nghiên cứu tạo giống cây ăn quả như Đu đủ, cây có múi kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gen đa đoạn Nhóm nghiên cứu của Đỗ Năng Vịnh và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa (Nguyễn Văn Khiêm & CS, 2009) và các cây ăn quả khác nhau Các đề tài đã và

(2005-đang trong giai đoạn kết thúc và nghiệm thu, một số được đề nghị tiếp tục các giai đoạn tiếp theo Một số đề tài chuyển gen mới trong giai đoạn 2011-2015 đã và đang được xem xét đưa vào kế hoạch thực hiện như Ca cao, Ngô chịu hạn, Bạch đàn …

1.4 Một số promoter và gen có giá trị thường được sử dụng

CaMV35S promoter và các promoter lai

CaMV35S promoter được sử dụng rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở

nhiều loại mô của nhiều loài cây Chúng có khả năng điều khiển biểu hiện các RNAs khác nhau ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm bao gồm thuốc lá, đậu tương,

cà rốt, ngô và lúa (Fromm et al., 1986; Ou-Lee et al., 1986) Promoter này là

promoter dạng cơ định, hoạt động mạnh ở cả các hệ thống biểu hiện tạm thời và các

tế bào chuyển gen thực vật ổn định với mức độ biểu hiện tăng hơn 30 lần so với

promoter của gen mã hóa nopaline synthase (NOS) (Sanders et al., 1987) Laporte

et al., 2001) cũng đã nghiên cứu và chứng tỏ ảnh hưởng quan trọng của CaMV35S

promoter khi biểu hiện gen mã hóa sucrose phosphate synthase ở cà chua Sản lượng cà chua thường không thay đổi khi sử dụng ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase small subunit (rbcS) promoter, trong khi sản lượng tăng tới 80% khi sử dụng CaMV35S promoter để điều khiển biểu hiện gen này Phân tích

huỳnh quang và hóa học lúa chuyển gen gusA dưới sự điều khiển của CaMV35S

promoter cho thấy, promoter này điều khiển biểu hiện gen chủ yếu ở quanh các bó

mạch chồi lá, rễ và hạt Tuy nhiên, không thấy sự biểu hiện của gusA ở các cơ quan

tử của hoa Hoạt tính của gusA ở rễ và lá lúa khá cao, tương đương hoặc cao hơn ở

lá thuốc lá có chứa cấu trúc gen (Smith, Hood, 1995)

NOS promoter

NOS promoter có nguồn gốc từ Ti-plasmid của vi khuẩn A tumefaciens và

thường được sử dụng để biểu hiện vùng mang mã của neomycin phosphotransferase

II của vi khuẩn kháng lại kanamycin trong chọn lọc các tế bào biến nạp (An et al.,

1986)

Ubiquitin promoter

Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng lớn

các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật Ubiquitin promoter được phân

lập và xác định đặc tính từ cây ngô (Christensen et al., 1992), Arabidopsis (Callis

et al., 1990), cây hướng dương (Binet et al., 1990), khoai tây (Garbarino et al.,

1995), Đa số các promoter này điều khiển ở mức độ cao hơn so với CAMV35S promoter trong quá trình biểu hiện ở các loài thực vật chuyển gen Do gen Ubiquitin được biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật trong điều kiện tự nhiên, nên promoter ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gen trong các loại thực vật chuyển gen đặc biệt là giữa các loài gần gũi Sự biểu hiện mạnh của promoter ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron, những đoạn chủ yếu định vị trong vùng 5’ không dịch mã của gen ubiquitin Các đoạn intron gần với bộ 3 khởi

đầu dịch mã là những nhân tố cis quan trọng, là nguyên nhân gây ra sự tăng cường

gián tiếp có liên quan đến intron (intron-mediate enhancement – IME) của quá trình

biểu hiện gen ở thực vật (Christensen et al., 1992) (Hình 1.1) Ngày nay, ubiquitin

promoter ngô và promoter của lúa thường được sử dụng để biểu hiện gen ở cây một

lá mầm (McElrroy et al.,1995) Trong đó, ubiquitin promoter được thử nghiệm

trong quá trình điều khiển biểu hiện gen ở cây ngô, lúa, đậu tương…

(Hernandez-Garcia et al, 2009, Lu et al., 2008) Ubiquitin promoter đã được phân lập từ bèo tấm và cho khả năng biểu hiện gen mạnh (Dickey et al., 2007)

Hình 1.1: Cấu trúc hệ thống điều khiển gen Ubiquitin ở thực vật (Ubiquitin của ngô)

Actin promoter

Do nhu cầu nâng cao khả năng biểu hiện gen ngoại lai trên cây ngũ cốc chuyển gen, một vài vùng promoter có nguồn gốc thực vật một lá mầm đã được kiểm tra Vào năm 1990, McElroy và công sự đã công bố vùng 5’ của gen actin 1 (Act-1) đã được sử dụng thành công trong việc biểu hiện gen chỉ thị trong tế bào trần của lúa Từ đó, vùng promoter của gen Act-1 lúa được sử dụng như một constitutive promoter (biểu hiện trong toàn bộ các loại mô) mạnh để biểu hiện các gen quan tâm trong cây một lá mầm Actin là một thành phần chủ yếu của khung tế bào, tồn tại trong tất cả các mô Sự xác định hình dạng tế bào, phân bảo, sự di chuyển của các bào quan và sự sinh trưởng được biết đến là có sự liên quan đến actin protein Trong hệ gen lúa, có ít nhất 8 vùng trình tự có mang đặc điểm mã hóa cho actin

Gen Act-1 từ lúa có một exon ngắn, không mã hóa, nằm trên vùng 5’, được ngăn cách với exon mang mã bởi một intron (intron 1) có gồm 447 bp Sự tồn tại của intron đầu của gen đã được chứng minh đây là thành phần thiết yếu cho sự biểu hiện gen có hiệu quả từ Act-1 promoter Vùng này hoạt động trong hầu hết các mô thực vật ngoại trừ các mô phấn hoa sporophytic và gametophytic Tất cả các nhân

tố điều khiển cis cho sự hoạt động của Act-1 promoter nằm trong vùng upstream từ

vị trí 834 bp đến vị trí khởi đầu phiên mã Nằm khác phía với TATA box, có hai vùng có vai trò điểu hiên sự biểu hiện cơ định của promoter Một nhân tố poly (dA-dT) gồm 38 bp giữa vị trí -245 và -152 là trình tự bám cho protein trans, làm việc như điều khiển dương cho hoạt động của Act-1 promoter Một vùng nằm giữa vị trí -300 và -260 gồm các đoạn lặp CCCAA liên quan đển điều khiển ngược hoạt tính của promoter, hoạt động của nó mang tính đặc hiệu mô, cụ thể là trong rễ

Hình 1.2: Cấu trúc gen Act 1 ở lúa

Các phần của gen Act-1 được sử dụng trong vector cho cây một lá mầm thường bao gồm: Trình tự điều khiển có kích thước khoảng 1 kb nằm ở vùng 5’ phiên mã; Exon

1 không mã hóa; Intron 1; Exon 2 mang mã của gen Atc-1 Vùng điều khiển của gen Act-1 lúa đã được sử dụng thành công trong việc biểu hiện nhiều loại gen quan tâm trên thực vật

Actin-1 promoter của lúa được thử nghiệm biểu hiện ở một vài giống lúa

(indica và japonica) (Datta et al., 1998) Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện

của protein CryIA(b) ở lá và thân dưới sự điều khiển của CaMV35S promoter và actin promoter khác nhau không đáng kể

Adh 1 promoter

Adh1 promoter điều khiển gusA biểu hiện khá mạnh ở rễ và các mô của lúa

Ngoài ra, ở phôi và nội nhũ của hạt cũng có sự biểu hiện đáng kể của gusA Trong

khi ở thuốc lá, Adh1 promoter chỉ hoạt động khi vùng tăng cường của gen tổng hợp octopin hoặc CaMV35S promoter được đưa vào trước promoter này Adh1 promoter có nguồn gốc từ ngô, khả năng điều khiển biểu hiện của promoter này gấp

10 đến 20 lần so với CaMV 35S trên tế bào trần lúa, nhưng đây là một promoter được cảm ứng bởi điều kiện ức chế và không được biểu hiện cơ định trong các loại

mô khác nhau (Zhang, Wu, 1988)

OsNAC6 promoter

Từ nghiên cứu về khả năng điều khiển tính chịu hạn của nhóm gen NAC trên

Arabidopsis, nhóm nghiên cứu của Lizhong Xiong - Trung tâm Quốc gia về nghiên cứu gen thực vật Trung Quốc - đã phân lập gen OsNAC1 và chuyển vào lúa Cây

lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và qua phân tích Microarray thì sự

biểu hiện của gen ngoại sinh OsNAC1 đã hoạt hóa hàng loạt gen chức năng liên

quan đến tính chịu hạn Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy các cây lúa

chuyển gen OsNAC1 cho năng suất cao hơn 22-34% so với cây đối chứng ở điều kiện hạn (Hu et al., 2006) Tương tự nhóm nghiên cứu của Shinozaki đã phân lập

và nghiên cứu đặc tính gen OsNAC6 và cho kết quả là các cây lúa chuyển gen tăng

cường tính chịu hạn, mặn, lạnh Đặc biệt, ngoài việc tăng cường tính chống chịu với bất lợi thời tiết, cây lúa chuyển gen OsNAC6 còn tăng cường tính kháng bệnh

đạo ôn so với cây đối chứng (Nakashima et al., 2007)

Các công trình nghiên cứu nêu trên đã chứng minh việc chuyển các gen điều khiển quá trình phiên mã vào cây trồng giúp tăng cường tính chống chịu với điều kiện thời tiết bất lợi ở các cây chuyển gen Vấn đề tồn tại là khi nghiên cứu biểu hiện của các gen điều khiển quá trình phiên mã trong cây chuyển gen các tác giả đã

dùng đoạn điều khiển gen dạng cơ định như 35S promoter với Arabidopsis;

ubiquitin promoter với lúa và ngô Việc sử dụng đoạn điều khiển gen dạng cơ định

đã dẫn đến hàm lượng các protein của gen điều khiển không điều hòa trong cây chuyển gen, thường là quá cao dẫn đến sinh trưởng của cây chuyển gen bị còi cọc,

lá thường có màu xanh đậm, hàm lượng đường hòa tan và proline cao Việc sử dụng promoter cảm ứng khi có ngoại cảnh bất lợi RD29 (stresses inducible promoter) thay thế promoter cơ định đã khắc phục được tình trạng sinh trưởng yếu

này của cây chuyển gen (Kasuga et al., 1999; Kasuga et al., 2004) Vì vậy, việc

phân lập OsNAC6 promoter ở lúa cảm ứng mạnh chỉ khi có điều kiện thời tiết bất lợi và điều khiển biểu hiện các gen quan tâm nhằm tăng cường tính kháng với điều kiện thời tiết bất lợi mà không làm ảnh hưởng sinh trưởng trong các cây chuyển

Các gen liên quan trong con đường tổng hợp lignin ở cây lâm nghiệp được quan tâm nhiều (ví dụ gen CAD mã hóa cho cinnamyl alcohol dehydrogenase, C4H

mã hóa cho cinnamate 4 Hydrogenase, 4CL1 mã hóa cho Coenzyme A ligase) nên promoter của những gen này cũng được tập trung nghiên cứu và kiểm tra tính đặc hiệu Các promoter này sẽ có ích cho các nghiên cứu nhằm biến đổi thành phần lignin một cách có chủ đích hơn có tính đặc hiệu hơn Một promoter của gen khác liên quan đến con đường tổng hợp lignin là C4H promoter đã được phân lập từ cây

Thông Pinus tomentosa có kích thước 1.1 kb Phân tích các cây được chuyển gen từ cấu trúc chứa C4H promoter và gen gus cho thấy, sự biểu hiện của gen gus rất

mạnh ở các tế bào mô mạch trong những vùng xylem được lignin hóa, và biểu hiện mạnh ở các mô đã trưởng thành hơn là các mô còn non Điều này chứng tỏ promoter C4H còn đặc hiệu theo thời gian ở những nơi có sự tích lũy nhiều lignin

(Zhao et al., 2005) Lignin là một phân tử hữu cơ lớn, phức tạp nhưng lại là thành

phần chính của thành tế bào thực vật hơn nữa lại là một thành phần quan trọng trong cơ chế tự bảo vệ của thực vật chống lại các tác nhân bên ngoài, nó chiếm từ 15-35 % trọng lượng khô của các cây thân gỗ Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc chuyển gen làm ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp lignin, nhờ vậy sẽ làm tăng hoặc thay đổi hàm lượng lignin trong cây Một số gen thường được nghiên

cứu để chuyển vào cây như C4H, CAD, 4CL1 (Chen et al., 2001, Chen et al.,

2006, Tournier et al., 2003)

Trong số các enzyme đó, enzyme phenylpropanoid 4-Coumarate:CoA ligase (4CL) là một nhóm các enzyme chìa khóa xúc tác cho quá trình chuyển hóa các dẫn xuất acid cinnamic (các coumaric acid, ferrulic acid, cafeic acid, sinapic acid …) thành các hợp chất phenylpropanoid như flavonoid, coumarin và lignin (Lee, Douglas 1996) Đây là những hợp chất thứ cấp có vai trò quan trọng cho quá trình sinh trưởng, phát triển và sống sót của thực vật Các enzyme 4-Coumarate:CoA ligase (4CL) đóng vai trò chìa khóa trong việc liên kết nhánh trung tâm của quá trình sinh tổng hợp phenylpropanoid với các nhánh riêng tổng hợp các phenolic cụ

1.5 Các vector thường sử dụng trong chuyển gen thực vật

Với những hiểu biết về Ti plasmid tự nhiên, các nhà khoa học đã có nhiều cải biến Ti-plasmid để sử dụng cho mục đích chuyển các gen quan tâm vào thực vật

thông qua A.tumefaciens Với các kỹ thuật di truyền, các Ti plasmid tự nhiên được

biến đổi vùng T-DNA bằng cách thay thế các gen tạo khối u bằng các gen quan tâm

mà vẫn giữ lại vùng T-DNA border và vùng vir

Một hệ thống chuyển gen vào thực vật thông qua A.tumefaciens cần có chủng Agrobacterium đã có Ti plasmid chứa gen quan tâm trong vùng T-DNA với các yếu

tố điều hòa cis bao gồm T-DNA border, promoter, terminator và các gen thuộc vùng vir có thể trên cùng Ti plasmid hoặc trên một Ti plasmid khác Hệ thống

chuyển gen còn phải có chứa các gen làm chỉ thị chọn lọc: cho thực vật thì gen chỉ