Các phương pháp phân tích và định tính Coliforms va Ecoli

Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ Sinh học và Kĩ thuật môi trường Môn: KĨ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH COLIFORMS VÀ E.COLI Nhóm 5 GVHD: Trần Quốc Huy... SƠ LƯỢC V

MỞ ĐẦU

Hình 1: Mẫu nước bị

nhiễm bẩn

Tuần 12 -Thứ 4 – Tiết 7-8

Bộ công thương Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh

Khoa: Công nghệ Sinh học và Kĩ thuật môi trường

Môn: KĨ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

COLIFORMS VÀ E.COLI

Nhóm 5 GVHD: Trần Quốc Huy

Đỗ Thị Thùy Trang 2008130113

01 02

03 04

1) Phân loại: Coliforms có khả

năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi được ủ ở 440C trong môi trường EC.

Coliforms chịu nhiệt

có khả năng sinh indole

khi được ủ khoảng 24h

ở 44,50C trong môi

trường Trypton

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter aerogenes

SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI

1) Phân loại:

• Hiện diện trong hệ tiêu hóa và

cũng được tìm thấy trong đất và thực

vật.

• Có khả năng lên men lactose sinh

acid là sinh hơi ở 37oC, 24 - 48h.

SƠ LƯỢC VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI

2) Escherichia coli:

Hình 4: Vi khuẩn Escherichia coli.

 Escherichia coli (Bacteriam coli

Commue) được ông Escherich phát hiện năm

1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.

• Hai đầu tròn, có khả năng di

động, không hình thành nha bào

• Hiếu khí hoặc kị khí tùy ý.

• Nhiệt độ phát triển: 37oC,

pH=7.4.

Hình 4: Cấu trúc Escherichia coli.

 Khả năng lên men sinh hơi.

 Tạo độc tố:

Khuẩn lạc

 Kết quả:

Hình 2.1 Kết quả

tăng trưởng của Coliforms trong các môi trường Trypton (bên trái), EC (bên

phải).

Escherichia coli + (-) + -

-Enterobacter or Klebsiella - (+) - (+) + + Citrobacter - (+) + - +

Bảng 1 Kết quả thể hiện đặc tính sinh học của Coliforms

bằng phương pháp MPN.

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

1) Phương pháp PCR: (kỹ thuật Mutiflex – PCR):

 Nguyên tắc:

•Nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách

sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng

 Quy trình:

Mẫu

Cấy vào môi trường,

Chọn khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa

Trích ly DNA

  Cơ chế: Kết quả:

Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2H44: Đối chứng

dương (lt-I, vt2e, stb) Lad: Thang chuẩn 1, 2, 3, 4 là các mẫu xét nghiệm.

Gen độc lực Primer Trình tự đoạn primer (5’ 3’)

Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp)

stx1 Stx1-RStx1-F ATAAATCGCCATTCGTTGACTACAGAACGCCCACTGAGATCATC 180

stx2 Stx2-RStx2-F GGCACTGTCTGAAACTGCTCCTCGCCAGTTATCTGACATTCTG 255

hlyA HlyA-RHlyA-F GCATCATCAAGCGTACGTTCCAATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 534

Bảng 4 : Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong multiplex – PCR

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

2)Phương pháp phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang:

 Nguyên lý:

•Dựa trên kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể Là kháng thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

• Kỹ thuật dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức

xạ có bước sóng đặc hiệu

sẽ phát sáng.

Hình 5 Màu và bước sóng của chất

huỳnh quang

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

2)Phương pháp phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang:

 Quy trình:

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

2)Phương pháp phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang:

 Quy trình:

• Quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang:

• Xây dựng đường chuẩn

 Pha loãng dịch chuẩn chứa chính xác số lượng vi khuẩn đích gắn phức hợp ở mật độ thấp.

 Xây dựng đường chuẩn cường độ huỳnh quang phụ thuộc số lượng vi khuẩn đích.

 Đo phổ huỳnh quang.

Tỉ lệ % tế bào gắn kết

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP HIỆN ĐẠI

2)Phương pháp phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang:

 Cơ chế:

Hình 6 Gắn kết vi khuẩn

đích với kháng thể và hạt

nano silica

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP HIỆN ĐẠI

2)Phương pháp phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang:

 Kết quả:

Hình 13 : (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) VK gắn với phức hợp

kháng thể - Silica; (c) VK gắn với phức hợp kháng thể - QDs

•Mẫu có mật độ thấp.

•Các mẫu nước có độ đục cao có thể được phân tích

•Hiệu quả cho việc phân tích mẫu như bùn, bùn, phù sa

•Thời gian cho kết quả nhanh, phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy

•Việc tăng sinh là đơn giản

•Hóa chất dễ tìm, không cần dụng cụ và môi trường phức tạp

•Ít tốn kém về mặt nhân sự, giảm chi phí

•Thời gian kéo dài

•Kết quả có độ tin cậy không cao

•Tốn chi phí

•Xảy ra dương tính giả

•Không hoạt động được với những đoạn DNA > 3kb

•Mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp

•Cấy làm giàu để có được mật

•Sử dụng máy móc chuyên dụng

•Giá thành kháng thể đơn dòng

và hạt silica tại thời điểm hiện tại cao

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] GS TS Lê Huy Chính, 2007 Vi sinh vật y học, NXB Y học,

[4] Youngsheng He, James, E.Keen, Ralph B.Westama, E.Travis

Littledike, Jimmy Kwang, 1996 Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of Escherichia Coli, Applied and

enviromental microbiology, Vol-62 No 9p 3325-3332.

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE !!!