Các phương pháp phân tích và định tính Listeria Monocytogenes

Phương pháp phân tích vi khuẩn Listeria monocytogenes BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH Khoa CNSH & KTMT MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨ

Phương pháp phân tích vi khuẩn

Listeria monocytogenes

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

Khoa CNSH & KTMT MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

GVHD: THS TRẦN QUỐC HUY NHÓM 7

Danh sách nhóm

• Phạm thị mộng tuyền

• Lê hồng nguyên

• Hồ thị diễm sương

• Nguyễn thị ngọc cẩm

• Phạm thị quỳnh như

• Nguyễn thị tường vi

• Nguyễn thanh tuyền

• Hoàng thị hồng hạnh

Nội dung

Listeria monocytogenes

Đặt vấn đề

Giới thiệu Phương pháp phân tích Kết luận

Tài liệu tham khảo

ĐẶT VẤN ĐỀ

• Tầm quan trọng của vi khuẩn Listeria monocytogenes – Tiêu thụ thực phẩm ăn ngay tăng

– Gây bệnh cơ hội

– Tỉ lệ tử vong cao (30 – 40)%

– Sinh trưởng trong thực phẩm lạnh.

– Cơ chế kháng lại bệnh listeriosis  thực phẩm nhiễm

ko đến được tay người tiêu dùng.

monocytogenes Hình 1: Cấu trúc tế bào L monocytogenes

Kích thước bộ gen của loài L monocytogenes khoảng 3,0 Mb

(Ganbank/EMBL_accession number AL591824)

Kích thước bộ gen của loài L monocytogenes khoảng 3,0 Mb

(Ganbank/EMBL_accession number AL591824)

• Đặc tính

TỔNG QUAN

- Trực khuẩn nhỏ, Gram dương, kị khí không bắt buộc,

không sinh bào tử, di động.

- Sinh trưởng 1 – 44 oC (opt 25 – 37) oC.

- Được phân lập từ đất, nước cống, xác thực vật, ruột động vật, ruột người,

- Yếu tố gây độc: từ listeriolysin O, tạo ra trong pha sinh

trưởng số mũ của tế bào, tác nhân xâm nhập vào tế bào cơ thể , giải phóng độc tố, gây nên sự chết của tế bào.

• 1-7 ngày nhiễm listeriosis :

– Người thường: sốt nhẹ, sôi bụng, tiêu chảy

– Người mẫn cảm: nôn, đau đầu, sôi bụng, tiêu chảy, sốt

– Phụ nữ có thai: nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm não, viêm màng trong tim

 Biện pháp phòng tránh:

 kiểm soát nguồn lây nhiễm từ nhà máy

 Đảm bảo vệ sinh thực phẩm trong ăn uống

 Không sử dụng các sản phẩm như sữa cô đặc, phomai

TỔNG QUAN

• Bệnh và biện pháp phòng chữa

Phương pháp phân tích

Truyền thống Hiện đại

ELISA Lai phân tử PCR

• Phương pháp truyền thống

o C , 24h

Trãi ria

Ủ ở 37oC trong 24 - 48h

Khuẩn lạc Listeria có

màu sám hay nâu được

bao quanh bởi vòng đen,

khuẩn lạc lõm, nhỏ,

đường kính khoảng

1mm

Ủ ở 37oC trong 24 - 48h

Khuẩn lạc Listeria có

màu sám hay nâu được

bao quanh bởi vòng đen,

khuẩn lạc lõm, nhỏ,

đường kính khoảng

Phương pháp ELISA

• Phương pháp hi n đại ện đại

• Sử dụng kháng thể sơ cấp phủ bên ngoài những giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ được phép thu giữ bằng cách sử dụng kháng thể thứ 2 có gắn enzyme phát tín hiệu

Nguyên tắc

Chuẩn bị mẫu (tăng sinh lần 1 ở 30 – 35 0 C trong 24h, tăng sinh lần 2 ở 30 0 C trong 22 –

Hình 3: Sơ đồ trên là quy trình phát hiện Listeria

monocytogenes

Cơ chế của ELISA

Phương pháp ELISA

• Phương pháp hiện đại

• Phương pháp hi n đại ện đại

- Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes.

- DNA polymerase

- Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP) và nồng độ Mg2+.

- Dung dịch đệm (buffer)

- cặp mồi LM-F và LM-R 2 đoạn mồi (mỗi đoạn mồi dài 18-30 bazơ)

→ Tất cả bỏ vào Eppendorf rồi đưa vào giếng để khuếch đại bằng máy chạy PCR

Hình 6: Cơ chế khuếch đại

DNA khuôn

- tách và làm sạch DNA với

chloroform / xử lý nhiệt tế bào ở

100 0 C trong 10 phút

- Tối ưu hóa điều kiện PCR về nồng

độ MG 2+ (1 5-4.0 mM), nồng độ

mồi (0.1-0.5pmol/mồi) và nồng độ

dNTPs (100- 250Mm/mỗi loại)

- Phản ứng PCR được thực hiện với

thể tích hỗn hợp 25ml vói chu

trình nhiệt gồm 94 0 C/3 phút,

( 94 0 C/ 1 phút, 60 0 C/1 phút , 72 0 C/

1 phút)×30 trình tự, 72 0 C/ 5 phút

và 4 0 C/5 phút.

- Đánh giá kết quả trên gel agarose

1% với 3ml sản phẩm

- Hóa chất dễ tìm, không đòi hỏi chuyên môn cao

Thực hiện qua nhiều bước nên thời gian thực hiện kéo dài

Tỉ lệ phân lập chính xác không cao,

dễ bị nhiễm trong quá trình phân lập

Đòi hỏi tính tỉ mỉ cao, người thực hiện cần có chuyên môn, cần có mẫu đối chứng mới thực hiện được.

Phương pháp

PCR

Thời gian cho kết quả nhanh, có thể phát hiện những vi sinh vật khó nuôi cấy

Việc nuôi tăng sinh đơn giản, hóa chất

dễ tìm và dễ tồn trữ Không cần dụng cụ nuôi cấy và môi trường phân tích phức tạp, có thể thực hiện ngay

Ít tốn kém về nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phân tích phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm.

Không phân biệt được tế bào sống với tế bào đã chết

Sự ức chế hoạt tính của DNA polymerase do mẫu thương phẩm Không phân tích được với mẫu có mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp

The end!

• Cơ chế lây nhiễm_ thông qua con đường thực bào

TỔNG QUAN

internalin A (inlA) internalin B (inlB)

E-Carherin Clq-R (hoặc Met)

Lm phân giải không bào  các lỗ trên màng tế bào , hoạt giải độc tính lưu huỳnh

PI-PLC kết hợp với PC-PLC, giúp LLO phân giải không bào.

Lm phân giải không bào  các lỗ trên màng tế bào , hoạt giải độc tính lưu huỳnh

PI-PLC kết hợp với PC-PLC, giúp LLO phân giải không bào.

Vào tế bào v t chủ ậnVào tế bào v t chủ ận

Tiếp đến Lm được nhân lên nhờ protein bề mặt ActA để nó di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và tổng hợp actin.

Đuôi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt động của PC-PLC và Mpl.

Tiếp đến Lm được nhân lên nhờ protein bề mặt ActA để nó di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và tổng hợp actin.

Đuôi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt động của PC-PLC và Mpl.

Con đường lây nhiễm

• Qua đường tiêu hóa  qua dạ dày  các mô ở ruột non của vật chủ (tế bào biểu mô và các đại thực bào

• Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ không gây ra những

thương tổn mô học nếu liều lượng không đủ lớn

TỔNG QUAN

Trong dịch lympho/ máu Lm di chuyển rất nhanh đến hạch bạch

huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng đi sâu vào không bào Hầu

hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy không bào nhờ kết hợp với pH

thấp, các enzyme thủy phân và oxy hóa trong không bào

Từ không bào  tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40 – 60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào

Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thành sau 5 -7 ngày

Giải pháp phòng ngừa

• - Giữ thức ăn ngoài giới hạn của vùng nhiệt độ nguy hiểm từ

4oC đến 60oC

• - Thức ăn nào cần giữ lạnh thì phải giữ ở nhiệt độ 40C hoặc thấp hơn, còn những thức ăn nóng thì phải giữ ở nhiệt độ trên

600C trở lên

• - Nấu chín toàn bộ thức ăn tươi có nguồn gốc từ động vật

• - Giữ vệ sinh tối đa lúc nấu nướng hay chuẩn bị bữa ăn Chà rửa dụng cụ, dao, thớt bằng dung dịch Javel pha loãng trong nước

• - Cẩn thận với các loại cá và đồ biển hun khói

• - Rửa tay bằng savon

- Thường xuyên chùi rửa, tẩy trùng tủ lạnh

- Không nên dùng thực phẩm có mùi lạ

- Không dùng thực phẩm quá thời hạn sử dụng

- Không để thực phẩm tươi sống chung với thức ăn đã nấu chín

- Thức ăn nấu chín dùng ngay không để lâu ngày trong tủ lạnh

- Rữa kỹ thức ăn trước khi sử dụng

- Giữ thức ăn đã được nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm chưa chế biến

Giải pháp phòng ngừa

Dấu hi u ện đại

• Tiêu chảy, sốt 38oC

(100,4oF) hoặc cao hơn,

đau các cơ, có các cơn ớn

lạnh hoặc rung mình,

buồng nôn

• Có những thay đổi về

tâm thần Có xáo trộn về

mặt nhận thức và tinh

thần, có cơn co giật, mất

kiểm sóat vận động các

chi.

TỔNG QUAN