Quy trình nhân giống cây Hà Thủ ô đỏ

29 Hình 4.2: Chồi tăng sinh trên môi trường MS bổ sung BA kết hợp NAA với các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy..... Sau khi vô trùng mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp c

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ

(POYGONUM MULTIFLORUM)

SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THU THỦY

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TH.S PHẠM VĂN LỘC

Tp.HCM ngày 30 tháng 6 năm 2014

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ

(POLYGONUM MULTIFLORUM)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Th.S PHẠM VĂN LỘC NGUYỄN THU THỦY

MSSV: 2008100266 LỚP: 01DHSH1

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học & Kĩ Thuật Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM đã truyền dạy cho em những kiến thức quý báu trong suốt 4 năm học để em có hành trang cho tương lai

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, thạc sĩ Phạm Văn Lộc, người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn em thực hiện môn khóa luận tốt nghiệp này

Em xin giử lời cảm ơn tới toàn bộ các bạn, anh chị em cùng làm việc và học tập trong phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực thực hiện khóa luận

Tuy em đã cố gắng rất nhiều, song bài báo cáo chắc chắn không thể tránh khỏi nhiều thiếu sót Em kính mong nhận được sự phê bình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô! Em xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng báo cáo thực tập này là do chính tôi thực hiện Các số liệu thu thập

và kết quả trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào

Ngày 30 Tháng 06 Năm 2014

Sinh viên thực hiện NGYỄN THU THỦY

(ký và ghi họ tên)

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 0

1.1 Tổng quan về Hà thủ ô đỏ 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 4

1.2 Giới thiệu về vi nhân giống 7

1.2.1 Khái niệm vi nhân giống (Micropropagation) 7

1.2.2 Một số phương pháp vi nhân giống 7

1.3 Các giai đoạn chính nhân giống in vitro 9

1.3.1 Quy trình tạo mẫu chồi in vitro 9

1.3.2 Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi 10

1.3.3 Tăng sinh cụm chồi in vitro 10

1.3.4 Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vườn ươm 10

1.4 Những vấn đề trong nuôi cấy mô 11

1.4.1 Lựa chọn vật liệu đê nuôi cấy 11

1.4.2 Điều kiện nuôi cấy .12

1.4.3 Sự tạp nhiễm 12

1.4.4 Tính bất định về mặt di truyền 13

1.4.5 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy 13

1.5 Pha chế dung dịch và chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy 14

1.5.1 Các chất khử trùng thông dụng 14

1.5.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) 14

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan 17

1.6.1 Nghiên cứu ngoài nước 17

1.6.2 Nghiên cứu trong nước 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Vật liệu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3 Điều kiện thí nghiệm 26

2.4 Môi trường nuôi cấy 26

2.5 Phân tích và xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ javen lên hiệu quả khử trùng mẫu.28 3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA lên sự tăng sinh chồi cây Hà thủ ô đỏ 30

3.3 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của nồng độ IBA lên sự tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ 34

3.4 Thí nghiệm 4: ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ 38

3.5 Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây con Hà thủ ô đỏ khi ex vitro 41

CHƯƠNG 4 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Javen lên hiệu quả khử trùng mẫu 21Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA lên sự tăng sinh chồi cây Hà thủ ô đỏ 22Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA lên quá trình tạo rễ 24Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA lên quá trình tạo rễ 24Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây 25Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ Javen lên hiệu quả khử trùng mẫu 28Bảng 4.3: Các nghiệm thức không có ảnh hưởng tốt lên sự tăng sinh chồi cây Hà thủ ô đỏ 30Bảng 4.5: ảnh hưởng của nồng độ IBA lên số lượng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ 31Bảng 4.7: ảnh hưởng của nồng độ IBA lên số lượng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ 35Bảng 4.9: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA lên số lượng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hà thủ ô đỏ 3

Hình 2.2 A, B, C, D lần lượt là hoa, lá, củ của Hà thủ ô đỏ 5

Hình 4.1: Hà thủ ô đỏ sau 10 ngày cấy 29

Hình 4.2: Chồi tăng sinh trên môi trường MS bổ sung BA kết hợp NAA với các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 34

Hình 4.4: Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ ở các nồng độ khác nhau 37

Hình 4.5: Hình thái sẹo ở gốc cây Hà thủ ô đỏ của các nghiệm thức 38

Hình 4.6: các nghiệm thức thăm dò ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ 41

Hình 4.7: Cây được trồng vào giá thể sau khi huấn luyện 2 tuần 41

Hình 4.10: Các gốc cây ở nồng độ 0.1 và 0.3 NAA đều tạo sẹo ở gốc trong lần cấy khảo sát lại 42

Hình 4.11: hình thái sẹo ở gốc cây Hà thủ ô đỏ sau khi xẻ đôi 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ Javen lên hiệu quả khử trùng 28Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA&BA lên số lượng và chiều cao chồi cây Hà thủ

ô đỏ 31Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ IBA lên số lượng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ 36Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên số lượng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vào thời kì tiền sử, con người phải tìm cây cỏ và động vật hoang dại để làm thức

ăn Qua chọn lọc và thử thách, con người đã dần xác định được các loài thực vật, động vật ăn được và không ăn được Trong suốt quá trình lịch sử dài đó, những kinh nghiệm

về dược liệu chữa bệnh được tích lũy dần

Những tài liệu cổ ghi chép lại vào 5000 năm trước công nguyên (TCN), người dân Babilon đã hiểu biết về tác dụng dược lý của nhiều cây thuốc Vào thời Hy Lạp cổ đại, Hippocrat (460 – 370 TCN) được coi là ông tổ của ngành y dược, ngoài các công trình

về giải phẫu và sinh lý học ông còn đưa vào sử dụng hơn 200 loại cây dược liệu khác nhau

Đối với nền y học phương Đông, phải kể đến Trung Quốc, vào thời kỳ Hoàng Đế (2637 TCN) đã có sách nói về các phương pháp chữa bệnh theo y lý đông phương cuốn “Nội kinh” Sau đó năm 1596, cuốn “Bản thảo cương mục” nói đến 1094 vị thuốc được công nhận thực sự có giá trị khoa học và bổ ích do Lý Thời Trần biên soạn, (1518 – 1593) Sau này, Bản thảo cương mục được dịch ra 6 thứ tiếng khác nhau trên thế giới: Nga, Anh, Đức, Pháp, Nhật,

Đối với dân tộc ta, lịch sử y học cũng có tù rất lâu đời 4000 năm TCN Sau này, Việt Nam có các danh y nổi tiếng như Tuệ Tĩnh (1330- ?) với bộ sách Nam dược thần hiệu 11 quyển, Hải Thượng Lãn Ông (1720 – 1791) với bộ sách Hải thượng y tôn tâm tĩnh gồm 28 tập (Nguyễn Huy Công và cs, 2005)

Hà thủ ô đỏ (HTOĐ) là một vị dược liệu quý được ghi nhận trong các tác phẩm của các tác giả, danh y lớn như Bản thảo cương mục, Hà thủ ô lục, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Cây HTOĐ được quan tâm, nghiên cứu ở cả phương tây lẫn phương đông Tác dụng dược lý của HTOĐ đã được khoa học nghiên cứu và chứng minh là cải thiện nhận thức và trí nhớ, hạ mỡ máu, bổ máu hoạt huyết, bổ gan, chống oxy hóa, chống ung thư, ngoài ra hoạt chất trong HTOĐ có khả năng kháng khuẩn lao và kháng

vi rút cúm, đặc biệt là một số hoạt chất trong HTOĐ có khả năng kháng vi rút HIV – 1 khá mạnh, cải thiện bệnh Alzheimer, Parkinson, chống ung thư vú, Cây HTOĐ có một số hợp chất quan trọng như: Anthraquinon (emodin và physcion), phenolic, rhein, lecithin, catechin, (Liu và cs, 2011)

Tuy nhiên, hiện nay HTOĐ đang bị khai thác quá mức, vượt qua khả năng tự tái sinh ngoài tự nhiên của loài HTOĐ đang bị đe dọa (bậc R), thuộc diện cần bảo tồn, nằm trong danh mục sách đỏ Việt Nam (2008) Cần thiết nhân giống và trồng trên diện tích lớn để bảo tồn và phục vụ nguồn dược liệu

Cây HTOĐ là cây dược liệu có một số hợp chất quan trọng như: anthraquinon (emodin và physcion), phenolic, rhein, lecithin, catechin…(Liu và cs, 2011), thời gian

gần đây do bị khai thác qua mức và do nạn phá rừng nên lượng HTOĐ bị giảm sút, mức độ đe dọa bậc R, đang thuộc diện cần bảo tồn Trong tự nhiên, HTOĐ đỏ được trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt (Đỗ Tất Lợi, 2004) Tuy nhiên, Lin

(2003) đã xác định các cây HTOĐ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin

và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên

Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật mang lại hiệu quả kinh tế hơn hẳn các phương pháp truyền thống Kỹ thuật này cho phép sản xuất cây giống với

hệ số nhân giống rất cao, có thể tạo ra hàng loạt cá thể đồng nhất về mặt di truyền với quy mô công nghiệp Kỹ thuật này được áp dụng cho nhiều loại cây khác nhau để nhân giống, tạo ra dòng cây sạch bệnh, bảo tồn nguồn gen, đặc biệt là các gen quý hiếm của các loài hoa, cây dược liệu

Nuôi cấy in vitro giúp nhân nhanh số lượng cây HTOĐ nhằm mục đích bảo tồn

giống cây thuốc và phục vụ nguồn dược liệu là hết sức cần thiết Vì những lý do trên

tôi đã chọn đề tài là “Khảo sát quy trình nhân giống cây Hà thủ ô đỏ (polygonum

multiflorum)” với mục tiêu tìm hiểu quy trình nhân giống cây HTOĐ bằng phương

pháp tái sinh chồi trực tiếp từ đốt thân cây HTOĐ in vitro

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Hà thủ ô đỏ

Chi (Genus) Polygonum

Loài (Species) Polygonum multiflorum

Tên Việt Nam: Hà thủ ô đỏ, Giao Đằng, Dạ Hợp, Địa Tỉnh…

Hình 1.1 Hà thủ ô đỏ

Từ năm 1784, HTOĐ có tên khoa học là Polygonum multiflorum Theo Haraldson (1978) HTOĐ có tên khoa học là Fallopia multiflora, nhưng tên này không được sử

dụng phổ biến, (Bộ công cụ xác định rừng có giá trị bảo tồn cao Việt Nam ,2008)

Hà thủ ô bắt đầu được quan tâm nghiên cứu bởi 2 nhà nghiên cứu nhật bản từ năm

1923, nhật bản dược học tạp chí, 42: 144, 1923, theo nghiên cứu này, HTOĐ có chứa 1,7% các chất anthraglucozid (emodin, rhein, chyrsophanola, ), ngoài ra còn có lexitin, đạm, đường, tinh bột, Sự có mặt của các chất anthraglucozid, lexitin và các chất khác đã chứng minh cho khả năng tác động lên hệ thần kinh suy nhược, cơ thể thiếu dinh dưỡng, tác dụng bổ máu củ HTOĐ (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Theo Đỗ Tất Lợi thì có 1 vị thuốc khác mang tên Hà thủ ô trắng, thuộc họ thiên lý

Asclepiadaceae Hà thủ ô trắng cũng có dạng thân leo, dây màu nâu đỏ, chứa nhựa sữa

trắng, được dùng thay thế cho HTOĐ trong các bài thuốc Nhưng hà thủ ô trắng không

có chứa các dẫn chất anthranoid là dẫn chất chức năng chủ yếu có trong HTOĐ Tại Trung Quốc có 1 vị thuốc khác được gọi là Bạch hà thủ ô thuộc họ thiên lý

Asclepiadaceae, chi Cynamchum, vị thuốc này cũng không có chứa các dẫn chất

anthranoid như Hà thủ ô đỏ HTOĐ là vị đúng, được các quốc qia Trung Quốc, Nhật Bản coi là vị chính thức (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Ở Việt Nam, Trung Quốc, HTOĐ được sử dụng như một vị thuốc bổ máu, thận, can, tỳ, phế, là một vị thuốc quan trọng trong nhiều bài thuốc cổ Công năng và các bài thuốc cổ của HTOĐ được ghi chép nhiều trong các sách y cổ như: Hà thủ ô lục, Bản thảo cương mục (do Lý Thời Trần biên soạn, 1518 – 1593), Thần nông bản thảo kinh độc, Bản thảo cầu chân, Dược phẩm hóa nghĩa, Bản kinh phùng nguyên, Nhật hoa từ bản thảo, Bản thảo thuật, Bản thảo tái tân,

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hà thủ ô đỏ còn có tên là Giao đằng vì dây leo xoắn vào nhau hoặc Dạ hợp vì ban đêm, dây sẽ quấn lấy nhau (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.1.2.1 Mô tả

Dây leo sống nhiều năm Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau Rễ củ to màu nâu

đỏ Lá hình tim, cả hai mặt phiến lá đều nhẵn, đầu thuôn nhọn, dài 5 - 7cm, rộng 3 - 5cm, mép nguyên hoặc lượn sóng Lá kèm mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân Cụm hoa chùy mọc ở đầu cành hoặc nách lá, mang nhiều hoa Hoa nhỏ màu trắng có đường kính 2mm, cuống hoa dài 1mm – 3mm, nhị 8 với 3 nhị dài hơn Quả 3 cạnh, khi khô

thì không tự mở đƣợc Mùa hoa vào tháng 10, mùa quả vào tháng 11 – 12, (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.1.2.2 Dược liệu

Rễ củ hình tròn, dài, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to Mặt ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ, vị chát

1.1.2.3 Vi phẫu củ

Lớp bần gồm 3 – 4 hàng tế bào, mô mềm vỏ phát triển nhiều, rải rác có tinh thể calci oxalat hình cầu gai, trong mô mềm có nhiều bó liber gỗ đƣợc thành lập, ở trung tâm có 1 vòng liber gỗ cấp 2

1.1.2.5 Thành phần hóa học

Thân rễ Hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion, protid, tinh bột, lipid, chất vô cơ, các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin) 2,3,5,4 tetrahydroxytibene-2-O-b-D-glucoside, tanin, axit galic, (Liu và cs 2011)

1.1.2.6 Phân bố

Trên thế giới HTOĐ có nhiều tại Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam

Tại việt nam HTOĐ mọc hoang ở vùng rừng núi, cao nguyên, phân bố nhiều nhất ở vùng núi Tây bắc và các tỉnh phía bắc, sau đó là Tây nguyên, Lâm đồng, (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.1.2.7 Trồng trọt

HTOĐ thường mọc hoang ở vùng núi có khí hậu mát mẻ quanh năm, nhiệt độ thích hợp từ 20oC - 25oC, lượng mưa trung bình năm 1500 – 1800mm, PH từ 5 – 6.5, đất cao ráo, ẩm, thoát nước

Thời điểm gieo hạt tốt nhất là vào mùa xuân hoặc mùa thu, có thể dùng củ để trồng hoặc dùng các đoạn hom dây bánh tẻ chứa nhiều đốt để dâm giống như khoai lang, thu hoạch khi củ được 2 – 3 năm tuổi

1.1.2.8 Thu hoạch

Thu hoạch củ vào mùa thu, tốt nhất là khi lá khô úa, sau khi đào về chặt thành từng miếng lớn rồi phơi khô hoặc đồ chín rồi mới phơi khô Còn có cách khác là đồ chín với đậu đen rồi phơi khô, làm như vậy 9 lần thì được gọi là hà thủ ô chế (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.1.2.9 Công dụng

Hà thủ ô được dùng làm vị thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, bồi bổ khí huyết, bổ gan thận, bổ máu, làm đen râu tóc,… Dùng chữa các bệnh đau lưng mỏi gối, thần kinh suy nhược, hoa mắt, chóng mặt, nam giới yếu sinh lý, tóc bạc sớm

HTOĐ làm chậm nhịp tim Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và bảo vệ được cơ tim thiếu máu

HTOĐ có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ ô chín

Tác dụng kháng khuẩn và virus: HTOĐ có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner HTOĐ có tác dụng ức chế virus cúm Ngoài

ra, sử dụng HTOĐ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng (Đỗ Tất Lợi, 2004)

HTOĐ có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của ruột thỏ, theo Đỗ Tất Lợi, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol HTOĐ có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch Có thể tác dụng giảm xơ cứng động mạch và do thuốc có thành phần lecithin (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

1.1.2.10 Tình trạng

Sẽ nguy cấp Do bị khai thác rễ củ quá mạnh mẽ, vượt quá khả năng tái sinh tự nhiên của loài Mức độ đe dọa: bậc R, (Bộ công cụ xác định rừng có giá trị bảo tồn cao Việt Nam, 2008)

Đề nghị biện pháp bảo vệ: Cần trồng trên diện tích lớn để bảo tồn nguồn dược liệu dồi dào và ổn định

1.2 Giới thiệu về vi nhân giống

1.2.1 Khái niệm vi nhân giống (Micropropagation)

Vi nhân giống là khái niệm dùng để miêu tả phương pháp nhân giống từ việc nuôi cấy mô thực vật, nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền nhân giống

Nhân giống in vitro giúp nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm như các loại cây rừng,

cây cảnh, cây dược liệu, làm sạch bệnh do vi rút bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đồng thời, giúp bảo quản ngân hàng gen giống (Dương Công Kiên, 2002)

1.2.2 Một số phương pháp vi nhân giống

a Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên Sau khi vô trùng mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ dinh dưỡng khoáng

vô cơ và hữu cơ hoặc có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp,

Từ đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường (Dương Công Kiên, 2002)

b Nuôi cấy tế bào đơn

Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra

và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi môi trường thạch có tỉ lệ cytokinin-auxin thích hợp, tế bào đơn sẽ có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

c Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một mô phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào

đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường thích hợp

d Nuôi cấy protoplast – chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài (Dương Công Kiên, 2002)

e Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp sẽ tạo thành mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các phương pháp cổ điển khác

- Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, không chiếm nhiều diện tích trong quá trình tiến hành, có thể tiến hành ở bất kì địa điểm nào

- Phục tráng được các giống cây đã bị nhiễm, thoái hóa

- Hệ số nhân cao, nhân nhanh Có thể đáp ứng nhu cầu số lượng lớn trong thời gian ngắn

- Bảo quản giống dễ dàng

- Tiết kiệm chi phí vận chuyển giống từ nơi này tới nơi khác

- Vật liệu để nhân giống dồi dào, phong phú mà tiết kiệm chi phí, hiệu quả kinh tế

- Bảo quản nguồn gen

Hiện nay nuôi cấy mô thực vật đang được đưa vào chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại Mặc dù còn nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đã có những đóng góp tích cực đưa lý luận sinh học cây trồng vào thực tiễn nông nghiệp

1.3 Các giai đoạn chính nhân giống in vitro

1.3.1 Quy trình tạo mẫu chồi in vitro

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Cụ thể l à quá trình khử trùng mẫu chồi bằng các thuốc khử trùng có sẵn: javel, cồn Quá trình này được xây dựng từ quá trình khử trùng mẫu với các thí nghiệm thay

đổi thời gian quá trình khử trùng đối với từng chất khử trùng dựa vào tỷ lệ nhiễm (Dương Công Kiên, 2002)

Chọn mẫu từ tự nhiên: Mẫu chồi được chọn cần phải khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh sẽ được cắt đem vào phòng thí nghiệm và rửa sơ bộ với xà phòng

1.3.2 Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi

Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin và cytokynin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy, mô non chưa phân hóa nhiều có khả năng tái sinh cao hơn các mô già đã chuyên hóa sâu Các môi trường khoáng cơ bản thường được sử dụng là môi trường MS và B5 (Dương Công Kiên, 2002)

1.3.3 Tăng sinh cụm chồi in vitro

Chồi sau khi được tái sinh sẽ được cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, mục đích tạo ra thêm nhiều chồi con để phục vụ cho quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Đây là giai đoạn then chốt của quá trình, để tăng hệ số nhân chồi Môi trường nuôi cấy thường được bổ sung các các chất điều hòa như auxin, cytokynin, gibberellin, và một số hợp chất

có nguồn gốc hữu cơ như nước dừa, chuối,…Tùy thuộc vào từng đối tượng đối tượng nuôi cấy, người ta nhân nhanh chồi bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua phôi vô tính (Dương Công Kiên, 2002)

1.3.4 Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vườn ươm

Từ cụm chồi tiến hành tách thành các chồi đơn và được cấy vào các môi trường tạo rễ (chứa auxin riêng lẻ hoặc auxin kết hợp cytokinin) Sau khi hình

hành rễ, môi trường sẽ được khảo sát với nồng độ auxin và cytokinin phù hợp nhất cho ra các cây hoàn chỉnh

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống

hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, giá thể, Phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất (Dương Công Kiên, 2002)

1.4 Những vấn đề trong nuôi cấy mô

1.4.1 Lựa chọn vật liệu đê nuôi cấy

Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô Điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh

lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu

 Kiểu gen

Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Với loài thuốc lá được sử dụng nhưu cây kiểu mẫu, Cheng và Smith ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi Hơn nữa, Jaramillo và Summers ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cây hạt phấn cà chua (Bùi Trang Việt, 2000)

Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng

nuôi cấy in vitro ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở

petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller cho rằng chồi mầm

thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt

 Tuổi và sinh lý

Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy

có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già

 Mẫu in vitro

Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả

năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở

cây Azalea theo nghiên cứu của Economou và Read Tuy nhiên, một vài nghiên cứu

khác ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng (Bùi Trang Việt, 2000)

 Những yếu tố khác

Có nhiều yếu tố khác như là mùa lấy mẫu, kích thước mẫu, điều kiện ánh sáng và thời gian chiếu sáng, Mùa lấy mẫu tốt nhất ở vùng nhiệt đới ẩm là xuân hạ, lúc sức sống mô mạnh mẽ, nhiệt độ và thời gian chiếu sáng cao làm giảm khả năng phát triển của nấm bệnh và vi khuẩn

1.4.2 Điều kiện nuôi cấy

 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20-27oC Theo Murashige (1974), nhiệt độ

ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh

lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan

 Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng là một yếu tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả

năng nuôi cấy in vitro dể cho cây có lá xanh Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có liên

hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002)

 Quang kỳ và chất lượng ánh sáng

Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện

tượng khác như tăng sinh chồi in vitro

1.4.3 Sự tạp nhiễm

Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,

gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy

Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá hay rễ non Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy, của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được Đặc biệt, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa hoặc nâu vàng xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy

Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác Môi trường không khí, phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy

1.4.4 Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua nuôi cấy mô sẹo Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo Nuôi cấy

mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài

Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị (Dương Công Kiên, 2002)

1.4.5 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

Hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất tannin và

hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non Phương pháp làm giảm

sự hóa nâu mẫu như than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình

hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis,

Cattleya và Aerides với nồng độ thường dùng 0,1 – 0,3 % Tuy nhiên than hoạt tính

cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thụ các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác (Bùi Trang Việt, 2000)

Để hạn chế ảnh hưởng phenolcác nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:

- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng

1.5 Pha chế dung dịch và chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy

1.5.1 Các chất khử trùng thông dụng

a Nước Javen (NaOCL)

Trong thương mại chất này được cung cấp trong các bình nhựa và chuẩn độ là 480

clore, người ta thường sử dụng nồng độ từ 5 – 20% đối với sự pha loãng 5%, thời gian ngâm từ 5 – 30 phút NaOCL nếu ngấm vào trong mô thực vật sẽ làm trở ngại sự tăng trưởng của mô về sau

b Thủy ngân (HgCL2)

Đây là một loại chất độc cực mạnh, vì vậy khi sử dụng phải hết sức lưu ý đảm bảo

an toàn HgCL2 là một chất khử trùng rất hiệu quả; người ta thường dùng với nồng độ rất yếu, từ 0.01% đến 0.05%, HgCL2 rất khó đào thải ra, cũng như các lúc rửa mẫu cần thực hiện cẩn thận Người ta rửa mẫu 4 – 5 lần thay vì 3 lần như các chất khử trùng bình thường khác

c Cồn Ethanol 70o

Có thể được sử dụng để lau sạch vật liệu thực vật trước khi khử trùng; nó có thể được dùng để ngâm nguyên liệu thực vật trước khi khử trùng; nó có thể được dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 – 5 phút

1.5.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)

Chất ĐHSTTV là những hợp chất hữu cơ gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất nhân tạo, có tác dụng điều tiết quá trình sinh trưởng và phát triển

của thực vật Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé đối với sự trao đổi chất của tế bào, tuy nhiên khi ở nồng độ cao, chúng có thể hoạt động như một chất kìm hãm

Trong thành phần môi trương nuôi cấy, các chất ĐHSTTV có chức năng như chiếc chìa khóa đóng mở sự hoạt động của gen, điểu khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất Mỗi một chất ĐHSTTV đều mang chức năng riêng, nhưng trong cơ thể thực vật, chũng tham gia có sự kết hợp hoặc đơn lẻ một chất Tùy vào mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau (Dương Công Kiên, 2002)

tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:

- Indol acetic acid (IAA)

- Naphthyl acetic acid (NAA)

- 2,4-Dichlorophenol acetic acid (2,4-D)

- Indol butyric acid (IBA)

 Nhóm các cytokinin

Cytokinin liên quan đến sự phân chia tế bào, phân hóa chồi, Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc

từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl loãng

Chức năng chủ yếu của các loại cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích sự phân chia tế bào

- Tạo và nhân mô sẹo

- Kích thích sự phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định

- Úc chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già lá và kích thích tạo diệp lục

- Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn

cả trong thực tiễn GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mần của phôi vô tính So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng GA3 có tính hòa tan trong nước

- Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin

- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống

- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi Năm đầu thân mầm nằm im, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hóa hoa

- Ức chế sự hình thành rễ bất định

- Kích thích sinh tổng hợp ezyme - amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hóa các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây

- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả không hạt

- Có thể làm chậm sự hóa già ở lá và quả ở cây có múi

 Nước dừa

Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol insitol) và một số acid amin Lượng nước dừa thường dùng trong môi trương cấy thường khá lớn từ 10 – 20% (w/v) thể tích môi trường Lấy nước dừa từ các trái dừa già, lọc trong, đựng vào các túi vải nhựa và bảo quản trong tủ lọc sâu cho đến khi dùng Thời gian bảo quản khong quá vài tháng Tốt nhất nên sử dụng tươi, (Trần Văn Minh, 2004)

(m-F Mariat là người đầu tiên công bố sử dụng thành công nước dừa trong gieo hạt hoa

Lan in vitro Nước dừa là một dưỡng chất có chứa đầy đủ các ion hữu cơ, các thành

phần nitrogen, các amino acid, enzyme, các aicd vô cơ, các vitamin, các đường đơn alcohol, các chất điều hoà sinh trưởng và các chất khác Như vậy, nước dừa là một chất dinh dưỡng cung cấp tất cả các thành phần cần thiết cho nhu cầu sinh trưởng của

tế bào nuôi cấy Trong nuôi cấy mô việc bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy sẽ

hạn chế bớt sử dụng chất điều hoà sinh trưởng, hạn chế xảy ra các biến dị bất lợi do quá trình nuôi cấy in vitro trong thời gian dài, (Trần Văn Minh, 2004)

Cũng có một số tác giả cho rằng bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 – 20% nước dừa tương đương với tác dụng của việc bổ sung lượng BA 1 -2 mg/l

Ngoài ra nước dừa còn chứa các hợp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập như: Myo inositol, các chất có hoạt tính auxin, các cytokinin dạnh glucoside (Trần Văn Minh, 2004)

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối vơi sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy

mô thực vật Đối với sự phát sinh phôi, để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sản sinh chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này Ví dụ

như 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis

nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chứng sẽ kích thích sự tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (tranfer RNA) Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định, (Hoàng Thị Kim Hồng, 2011)

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan

1.6.1 Nghiên cứu ngoài nước

 Năm 2003, Lin LC & cs đã công bố trên tạp chí Biol Pharm Bull công trình nghiên cứu vi nhân giống cây HTOĐ và so sánh hàm hượng anthraquinones emodin, physcion trong rễ cây HTOĐ in vitro và rễ cây ngoài tự nhiên Trong nghiên cứu này, tác giả nhận thấy HTOĐ không có khả năng tái sinh từ lá, nhưng khả năng tái sinh từ đốt thân là rất tốt 28-97%, trong đó môi trường tái sinh tốt nhất là MS bổ sung 2,0 mg/l NAA kết hợp với 0,2 mg/l BA, hệ số nhân chồi là 4,7 với 97 % số mẫu ra chồi sau 6 tuần nuôi cấy Các mẫu cấy ra rễ tốt trong môi trường 0,01 mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy với trung bình 13,7 rễ trên 1 mẫu, dài trung bình 2,8 cm trên 1 rễ Cây con khi ra vườn đạt tỷ lệ sống là 63% Đồng thời tác giả cũng chứng

minh hàm lượng anthraquinones emodin, physcion trong rễ cây HTOĐ in vitro sau

nuôi cấy 6 tuần cao gấp 3 lần so với rễ cây HTOĐ ngoài tự nhiên, hơn nữa hàm

lượng anthraquinones emodin, physcion trong rễ cây HTOĐ in vitro sau 3 tháng

trồng ngoài nhà kính cao gấp 5 lần so với rễ cây HTOĐ ngoài tự nhiên

 Um MY và cs vào năm 2006 nghiên cứu trên chuột đã chứng minh dịch chiết HTOĐ có tác dụng phòng ngừa, chống lại sự suy giảm nhận thức do sự tích tụ Protein beta amyloid (Abeta25 -35) trong bệnh Alzheimer, điều này thể hiện tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết HTOĐ

 Liu Z và cs vào năm 2011 sử dụng RRLC / DAD / ESI –MS (n) đã phân tích và so sánh thành phần hóa học của rễ củ HTOĐ và các sản phẩm thuốc đã qua chế biến của nó Kết quả cho thấy có tổng cộng 23 hợp chất được xác định, trong đó có 8 hợp chất nổi bật là 3 hợp chất gốc glucoside, axit galic, 3,5,4' - tetrahydroxylstilbene-2,3-di-O-glucoside, Cis;Trans-2,3,5,4'- tetrahydroxylstilbene-2-O- β -D- glucoside, emodin , và physcion Tuy nhiên, hàm lượng của các axit galic , emodin , và physcion trong mẫu hà thủ ô đã chế biến cao hơn rất nhiều so với rễ củ HTOĐ

 Liu X và Cs vào năm 2010 đã cho thấy hợp chất 2,3,5,4'–tetrahydroxystilbene 2 O-beta-D-glucoside là một chất chống oxy hóa quan trọng có trong HTOĐ có tác dụng điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như Parkinson

- Chen HS và cs vào năm 2011 đã mô tả cơ chế tác dộng của dịch chiết HTOĐ lên các tế bào ung thư vú (MCF-7) Kết quả cho thấy, dịch chiết đã thúc đẩy các tế bào MCF-7 chết theo chu trình và ức chế sự tăng sinh của các tế bào này bằng cách kìm hãm giai đoạn G2/M (kỳ trung gian và phân bào) trong chu kỳ tế bào Nghiên cứu này hứa hẹn một cơ hội mới trong điều trị bệnh ung thư vú

 Lin HW và cs vào năm 2010 đã mô tả một số hoạt chất trong Hà thủ ô có hoạt tính kháng virus HIV-1, ức chế sự hình thành hợp bào của virus HIV-1 và ức chế hiệu ứng gây hại tế bào lympho C8166

1.6.2 Nghiên cứu trong nước

 Hoàng Thị Kim Hồng vào năm 2011 đã công bố trên tạp chí khoa học về khả năng tái sinh chồi và cụm chồi trong nuôi cấy invitro cây HTOĐ Kết quả cho thấy môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và NAA 0,1 mg/l kích thích đoạn thân của chồi

in vitro cây HTOĐ tái sinh cụm chồi tốt nhất, với trung bình 8,54 chồi trên 1 mẫu

sau 5 tuần nuôi cấy Bên cạnh đó các đoạn thân này cũng có khả năng tạo cụm chồi tốt trên các môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và NAA 0,2 mg/l hoặc BA 5 mg/l và NAA 0,3 mg/l tuy nhiên một số mẫu có khả năng phân hóa thành callus sau 5 tuần nuôi cấy Các chồi đơn tách từ cụm chồi phát triển tốt và ra rễ trong môi trường MS có bổ sung 0,5 NAA mg.l

 Trương Công Phi và cs vào năm 2012 đã xây dựng thành công quy trình nhân

giống in vitro cây HTOĐ Theo các tác giả thì khử trùng mẫu bằng dung dịch javen

20% trong 10 phút cho hiệu quả tốt nhất với tỷ lệ sống không nhiễm đạt 77,77%

sau 3 tuần nuôi cấy Môi trường MS bổ sung BA 4 mg/l và NAA 0,5 mg/l kích thích đoạn thân in vitro tăng sinh cụm chồi tốt nhất với trung bình 8,11 chồi trên 1 mẫu sau 4 tuần nuôi cấy Các chồi đơn tách từ cụm chồi ra rễ và phát triển tốt trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA với trung bình 4,67 rễ trên một mẫu và dài

trung bình 4,23 cm trên 1 rễ sau 4 tuần nuôi cấy Các cây con in vitro sau khi ra

vườn phát triển tốt trong môi trường nhà kính trên giá thể xơ dừa ẩm

 Dương Tấn Nhựt và cs vào năm 2006 đã công bố trên tạp chí công nghệ sinh học

về khả năng tái sinh chồi và nhân giống cây HTOĐ từ mắt thân cây HTOĐ Trong nghiên cứu này, việc tái sinh chồi có thể thực hiện bằng cách nuôi cấy các mắt thân trên môi trường ½ MS có chứa 0,2 mg/l TDZ với tỷ lệ và hệ số tái sinh khá cao tương ứng là 72,22 % và 10 chồi trên 1 mắt Chồi ra rễ tốt trên môi trường MS bổ sung IBA 0.1 mg/l hoặc IAA 0,2 mg/l, cây con khi ra vườn phát triển tốt ở giai đoạn vườn ươm

 Năm 2012, Sở khoa học và công nghệ - Liên hiệp các hội khoa học và kĩ Thuật Đồng Nai cũng công bố trên bản tin khoa học và ứng dụng về việc xây dựng thành công môi trường tăng sinh chồi cây HTOĐ Theo công bố này thì môi trường MS

bổ sung NAA 0,2 mg/l và BA 2 mg/l kích thích tăng sinh chồi cây HTOĐ tốt nhất

 Hai tác giả Huỳnh Thị Đan San và Võ Thị Bạch Mai vào năm 2009 đã công bố trên tạp chí phát triển KH và CN về sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây HTOĐ

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Nguyên liệu của nghiên cứu là những đoạn thân có chứa mắt ngủ ở gần đỉnh ngọn Bao mắt ngủ còn màu xanh, đoạn thân cũng có màu xanh, mềm, có thời gian sinh

trưởng khoảng 10 ngày tuổi trở lại

Hình 2.1: Vật liệu nuôi cấy là những đốt thân non

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.2: Sơ đồ các bước cơ bản trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ javen lên hiệu quả khử trùng mẫu

Đầu tiên, đoạn ngọn non của dây hà thủ ô chứa khoảng 7 – 8 đốt thân được rửa

sơ qua dưới dòng nước chảy để loại bỏ bụi, sau đó cắt thành từng đoạn chứa mắt ngủ dài khoảng 3 cm, đem lắc với xà bông từ 8 – 10 phút Đem rửa mẫu sạch bọt với nước cất vô trùng trước khi khử trùng bằng cồn 70o trong khoảng 30 – 45 giây Sau khi đổ

bỏ cồn, mẫu sẽ được ngâm trong Javel với từng nồng độ theo bảng 1 trong 7 phút

Trong tủ cấy, mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần Đoạn thân được đặt ra giấy cấy, dùng dao và kẹp cắt bỏ đầu và cuối của đoạn thân, cấy vào môi trường MS

- Thời gian theo dõi: sau 1 tuần nuôi cấy

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống, không nhiễm (%)

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA lên sự tăng sinh chồi cây Hà thủ ô đỏ

Chồi in vitro được cắt thành những đoạn ngắn (0.8 - 1 cm) có chứa mắt ngủ và được

cấy chuyền sang môi trường MS bổ sung agar 6,5 g/l, đường 30 g/l, nước dừa 20% và hoocmon tăng trưởng theo bảng 2 để tăng sinh chồi

Nước dừa được lấy từ những quả dừa non, vỏ quả màu xanh, bổ dừa ra lấy nước dừa đem lọc cặn bằng bông hoặc chắt lấy nước trong dùng để pha môi trường ngay, không để lâu qua ngày

Thí nghiệm gồm 36 NT được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Mỗi bình cấy 2 mẫu

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA lên sự tăng

sinh chồi cây Hà thủ ô đỏ

Thời gian theo dõi: sau 6 tuần nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi:

- Hệ số nhân chồi (%)

- Chiều cao chồi

- Hình thái chồi

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ IBA lên sự tạo rễ cây hà thủ ô

Chồi đơn được tách từ cụm chồi 6 tuần tuổi có chiều dài khoảng từ 4 - 5,5 cm sẽ được cấy chuyền sang môi trường môi trường MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l đường

và IBA với các nồng độ như bảng 3 để tạo rễ

Thí nghiệm gồm 4 NT được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại mỗi bình cấy 3 mẫu

Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA lên quá trình tạo rễ

Thời gian theo dõi: sau 4 tuần nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

- Số rễ trung bình/mẫu

- Chiều dài rễ

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ

Chồi đơn được tách từ cụm chồi in vitro 6 tuần tuổi có chiều dài khoảng từ 4 - 5,5

cm sẽ được cấy huyền sang môi trường môi trường MS bổ sung 6.5 g/l agar, 30 g/l đường và NAA với các nồng độ như bảng 4 để tạo rễ

Thí nghiệm gồm 4 NT được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Mỗi bình cấy 3 mẫu

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA lên quá trình tạo rễ

Thời gian theo dõi: sau 4 tuần nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi:

- vườn cao ráo, sạch sẽ, có lưới che ánh sáng

- có mái che để ngăn mưa lớn

- tưới nước cho cây con ngày 2 lần sáng sớm và chiều tối

Các bước tiến hành:

- cây con in vitro hoàn chỉnh trong chai mô được đưa ra để trên kệ trong vườn ươm 1

tuần để thích nghi với điều kiện bên ngoài

- dùng kẹp gắp cây con ra khỏi chai mô

- rửa sạch môi trường bám trên cây bằng cách rửa với nước nhẹ nhàng trong thau nhựa, tránh làm tổn thương cây con

- Trồng cây con vào các giá thể khác nhau chứa trong ly nhựa

Thí nghiệm gồm 6 NT được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại

Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây