Tiểu luận ứng dụng enzyme lipase

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzyme đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc ứng dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các phản ứng sử dụng enzyme lipase mang lại nhiều lợi ích hơn các phản ứng hóa học thông thường. Lipase có thể sử dụng một cách hiệu quả và kinh tế trong điều kiện bình thường. Đây là đặc điểm quan trọng, bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và sản phẩm phụ bằng phương pháp tốn kém năng lượng.

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzyme đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc ứng dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp dầu béo Các phản ứng sử dụng enzyme lipase mang lại nhiều lợi ích hơn các phản ứng hóa học thông thường Lipase có thể sử dụng một cách hiệu quả và kinh tế trong điều kiện bình thường Đây là đặc điểm quan trọng, bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ

Do đó việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và sản phẩm phụ bằng phương pháp tốn kém năng lượng

I TỔNG QUAN VỀ ENZYME LYPASE

1 Tên enzyme

Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là Triacylglycerol lipase

Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester

Là enzyme tan trong nước xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol không tan trong nước tạo thành các glyceril và các acid béo tương ứng nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu-nước

Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-ester chứ không cắt cùng một lúc 3 liên kết Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme khác như protease, amylase…

Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo Tại bề mặt phân cách giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất

Phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol và các acid béo

2 Cấu trúc enzyme Lipase

Tâm hoạt động của lipase là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate

Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được hoạt hóa Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid Do đó, sự hiện diện của serine

ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide

Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly

Hình 1

3 Cơ chế sinh tổng hợp lipase

Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tế bào chất của VSV

Đầu tiên là sự phiên mã Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất ức chế đó Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xúc tác của lipase

Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường tế bào chất Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm đi đáng kể Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng thông tin mã hóa trong mRNA để tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase Quá trình này cần một loại protein “chuyển giao” để tái

sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein) mà không còn sử dụng được nữa

Khi những polypeptide enzyme đã được tổng hơp khá nhiều thì những polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không tan Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển qua màng mmebrane Đối với pro-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp trong tế bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được gấp khúc trogn suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane Do đó, một số protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành khối protein không tan và chống lại thủy phân nội bào

Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại Sự cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các ion

đó trong tế bào chất

Đối với pro-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme

Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất Trong giai đoạn này proenzyme, là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn thiện, vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phân ứng thủy phân

4 Phân loại enzyme

Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : lipase từ thực vật, lipase từ động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm, đã có một vài lipase thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn nảy mầm Lipase từ nguồn thu nhận này hạn chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng thời nồng độ enzyme là không cao Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và vị khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng Bên cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn

Đặc hiệu vị trí:

• Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride (C.rugosa)

• Xúc tác đặc hiệu vị trí 1,3 trên phân tử triacylglycerol (A.niger)

• Chỉ xúc tác đặc hiệu 1 số acid béo nhất định (Geotrichum candidum)

• Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme (C.rugosa,A.niger,M.miehei

…)

a) Nhiệt độ, pH tối ưu

Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 40 độ C, nhưng một số lipase ở vi sinh vật lại có tính bền nhiệt

b) Cofactor

Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một số các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase Hoạt tính của lipase bị bất hoạt bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi Zn2+ và EDTA: Đối với Bacillus sp

Mg2+ làm tăng hoạt tính enzyme

Ca2+ tăng tiết enzyme ngoại bào, tăng hoạt tính enzyme

Đối với Geotrichum sp:

Ca2+ 1mM có tác dụng làm tăng 6% hoạt tính enzyme

Hoạt tính lipase mất gần hết với Pb2+ 10mM

Tween 20 làm tăng 10% hoạt tính lipase

Chất tẩy rửa SDS kiềm hãm lipase hoàn toàn

c) Cơ chế xúc tác

Hoạt tính đạt cực đại khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu-nước => quá trình hoạt hóa phân pha

Bảng 1

Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân, phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester và phản ứng amin hóa (aminolysis)

Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng

d) Môi trường nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp Lipase

Môi trường nuôi cấy Cadida rugosa KH2PO4: 15 g; K2HPO4:5,5 g;(NH4)2SO4:4g; MgSO4:1g; FeCl3:10m g; inositon: 0,004mg; biotin: 0,008mg; Thiamine.HCl: 0,2mg; dầu oliu: 1%; axit palmitic: 1.2 g;H2O: 1000ml Số tế bào nấm men cấy ban đầu 2,6x10-6 cfu/ml môi trường nuôi cấy Thời gian nuối cấy 40 giờ Môi trường nuôi cấy Bacillus sp Môi trường BMGY với thanh phần: 1% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v) bacto-peptone, 100mM kali phosphat, pH 7.0, 4x10-5% (w/v) biotin và 1% (v/v) Methanol Nhiệt độ 30oC Lắc 220 rpm 13

II ỨNG DỤNG

1 Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp

Hình 4

Bảng 2: Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp

2 Ứng dụng của lipase trong công nghiệp thực phẩm

Bơ cocoa, chứa palmitic và stearic acid, khi tan chảy trong miệng sinh ra cảm giác mát lạnh thích thú như chocolate Công nghệ dựa vào lipase liên quan đến phản ứng thủy phân

và tổng hợp được thương mại hóa để nâng cao một vài loại mỡ kém chấ lượng thành chất thay thế bơ cocoa Quá trình sử dụng lipase từ Rhizomucor miehei c định cho phản ứng chuyển ester thay thế palmitic trong dầu cọ với stearic acid Alcoholysis của dầu gan cá tuyết được sản xuất omega-3 để chống lại sự hình thành cholesterol Điều này được khám phá khi dùng lipase của Pseudomonas (Zuyi và Ward 1993) Một vài loài vi khuẩn sản sinh ra ester tạo mùi ứng dụng trong công nghiệp phomai như sản phẩm mùi do lipase của

C.viscosum giúp cho việc tích trữ hương vị tốt hơn khi tích trữ trong vòng một tháng Nhiều hợp chất hương (Yadav và cs, 2008), chất hoạt động bề mặt phi ion (Yu và cs, 2008), chất nhũ hóa đã được tổng hợp nhờ xúc tác của lipase Ricinoleic acid estolide (Bódalo và cs, 2008), monoacylglycerol (Esmelindro và cs, 2008; Kittikun và cs, 2008)

đã được tổng hợp để điều chỉnh độ nhớt của chocolate và nhũ hóa cho magarin Xin và cs (2009) đã dùng lipase xúc tác tổng hợp olein ferulyl có tác dụng như là chất chống oxi hóa trong thực phẩm đồng thời có tác dụng ngăn chặn bệnh tim, chống viêm và chống ung thư Các polymer sinh học đã được tổng hợp nhờ xúc tác lipase Các polymer này được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm làm các màng bao kỵ nước Nhiều dạng enzyme đã được thương mại hóa dùng trong công nghệ thực phẩm như Freshzyme®, Lipopan®, Noopazyme®, Palatase®, Novozyme® 871 Một số sản phẩm lipase đã được thương mại dùng trong công nghiệp dầu và chất béo: Lecitase® Novo, Lecitase® Ultra, Lipozyme®

3 Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa

Ứng dụng thương mại quan trọng của lipase là làm phụ gia trong công nghiệp chất tẩy rửa và bột giặt gia đình Để tăng khả năng tẩy rửa, các chất tẩy hiện đại đều chứa một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulose và lipase Việc loại bỏ dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn trong công nghiệp chất tẩy rửa

Trong điều kiên bình thường của quá trình giặt tẩy, lipase hoạt động khá tốt Lipase bổ sung vào chất tẩy rửa phải có đặc tính: chịu nhiệt, chịu kiềm (pH khoảng 7.5 đến 11) và chịu các tác động của các chất cấu tạo nên chất tẩy rửa (Jäeger và cs, 1994) Lipase kiềm chịu nhiêt đã được dùng trong công nghiệp tẩy rửa để loại bỏ các vết triglyceride từ người

và các loại thức ăn, trước kia, việc loại bỏ các chất này trong điều kiện giặt ủi bình thường rất khó khăn

Năm 1988, Lipase được cho vào chất tẩy rửa dưới tên thương mại là lipolase® 100T thu từ Humicola lanuginose được sản xuất bởi Novo Nordisk Bioindustry (Jäeger và cs, 1994) Lipase từ các chủng vi khuẩn P.medocina và Pseudomonas alcaligenes đã đươc sản xuất và bổ sung vào chất tầy rửa ở công ty Genecor international USA (Jäeger và cs, 1994; Reetz và Jäeger, 1998)

Novo đã thông báo về loại lipase chịu kiềm cao, đặc hiệu với nhiều cơ chất từ dòng xạ

4 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy

Quá trình thuộc da là quá trình khá phức tạp gồm loại bỏ chất béo, rủ lông và làm mềm Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm nên sử dụng các vi khuẩn kiềm sẽ đem lại hiệu quả cao Dòng bacillus sp có thể phát triển trong môi trường kiềm sinh tổng hợp lipase kiềm, vì thế chúng rất thích hợp cho quá trình thuộc da (Haalck và

cs, 1992; Wang và cs, 1995) Lợi thế của việc dùng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch Lipase cũng cải thiện tính không thấm nước của da và da không bị vết hoan ố như

sử dụng dung môi và chất hoạt động bề mặt Trong công nghiệp giấy, sáp và triglyceride gây trở ngại cho sản xuất nên loại bỏ các chất này là điều cần thiết (Bajpai 1999) Công ty giấy công nghiệp Nippon (Nhật Bản) đã dùng lipase từ nấm Canada rugosa để loại 90% các chất này có trong gỗ Một số sản phẩm lipase được thương mại hóa dùng cho công nghệ thuộc da: Greasex®, NovoCor® ADL, dệt: Novozyme® 375, giấy: Resinase®

5 Ứng dụng lipase trong quản lý môi trường

Lipase đã được sử dụng để loại bỏ các chất chứa trong các loại phế thải như dầu oliu

và các chất phế thải từ nhà máy dầu (Vitolo và cs, 1998) Quá trình này sử dụng các chủng vi khuẩn sản sinh lipase B.thermoleovorans IHI-91 (Reimann và cs, 2002) Wakelin và Forster (1997) khám phá ra các vi sinh vật được phân lập từ chất thải của nhà hàng thức ăn nhanh để loại bỏ chất béo, dầu, mỡ Họ nuôi cấy vi khuẩn thuần khiết và trộn với chất thải, vi sinh vật sẽ sản sinh lipase và các enzyme khác Ngoài ra, lipase còn

có tác dụng phân hủy sinh học dầu diesel trong đất

6 Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất

Chất trung gian trong tổng hợp chất trị liệu, hóa nông và hương liệu thường dùng là các chiral Các chất này khó tổng hợp bằng phương pháp hóa học chỉ 1 trong 2 đồng phân của thuốc có dược tính, việc tổng hợp đồng phân thuần khiết là bước quan trọng trong công nghiệp dược Có 2 loại biến đổi sinh học có chọn lọc đồng phân chất hữu cơ được xúc tác bởi lipase: phản ứng các cơ chất tiền chiral và động học tan của các racemate (Kazlauskas và cs, 1998) Theo truyền thống, các chất tiền chiral hoặc chiral alcohol và ester của acid carboxylic được coi là 2 loại chất cơ bản nhưng nhiều năm qua phạm vi của các chất nhanh chóng được mở rộng sang cả các diol, các acid α và β, hydroxyl, cyanohydrin, chlorohydrin, diester, lactone, amine, diamine, amino-alcohol và dẫn xuất của α và β acid amine (Kazlauskas và cs, 1998) Loại lipase xúc tác cho các phản ứng này thu nhận từ vi khuẩn P.aeruginosa, P.flourescens và các loài Pseudomonas khác, B.cepacia, C.viscosum, B.subtillis (Chunyuan và cs, 2008), Achromobacter sp., Alcaligenes sp.và serratia marcescens

7 Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế

Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất mang dược chất và làm vật liệu trong điều trị gãy xương (Rajan và cs, 2008) Lipase là một chất hoạt hóa yếu tố phá hủy tế bào ung thư, vì vậy có thể sử dụng trong điều trị ung thư Lipase Candida rugosa đang được dùng để tổng hợp thuốc hạ cholesteron huyết thanh (Hasan và cs, 2006) Lipase còn được sử dụng là chất kích hoạt nhân tố hoại tử khối u và được dùng trong một số liệu pháp chữa trị các khối u ác tính

Lipase có thể được cố định trên điện cực pH/oxygen kết hơp với glucose oxidase và có chức năng như là một lipid biosensor được dùng trong xác định cholesteron máu (Hasan

và cs, 2006)

Lipase được sử dụng khá sớm trong các liệu pháp chữa trị chứng khó tiêu, đầy hơi, dị ứng bởi thức ăn, lipase từ thực vật được dùng để bào chết các loại thuốc hỗ trợ tiêu hóa như Similase, Vitaline Herbal Formulas được sản xuất bởi Health Care Professionals, Oregon, Hoa Kỳ Một số sản phẩm enzyme được thương mại hóa dùng xúc tác phản ứng sinh học: Novozyme® 388, Novozyme® 435, Novozyme® 525 F

8 Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa

Monoacylglycerol và diacylglycerol là chất được tổng hợp bởi quá trình ester hóa glycerol bằng lipase, chúng là chất hoạt động bề mặt hiệu quả được ứng dụng trong mỹ phẩm (Pandey và cs, 1999; Kirk và cs, 2002)

Việc tổng hợp monoacylglycerol bằng enzyme monoacylglycerol lipase lấy từ vi khuẩn Pseudomonas sp Izumi và cs (1997) đã chỉ ra rằng sự chuyển vị trong quá trình ester hóa 3,7- dimethyl-4,7-octadien-1-ol bằng lipase từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau là nguồn hương hoa hồng nhân tạo rẻ tiền và hiệu quả cho công nghiệp nước hoa Ester của acid béo và các đường (lauryl manose) là những chất hoạt đông bề mặt được sử dụng để nhũ hóa trong thực phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp dược (Wenbin và cs, 2009) Lipase hỗ trợ quá trình tổng hợp hương liệu đã được nghiên cứu đặc biệt là (-) menthol