Bài thí nghiệm giúp thấy rõ quá trình trích ly phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó phương pháp trích ly có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu nhận chất tan. Ngoài ra, thông qua việc tính hiệu suất trích ly protein giúp sinh viên biết cách xác định nồng độ protein trong dung dịch dựa trên sự thay đổi độ hấp thu ánh sáng bằng máy đo quang phổ.
Trang 1BÀI 3 TRÍCH LY PROTEIN
I- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Bài thí nghiệm giúp thấy rõ quá trình trích ly phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó phương pháp trích có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu nhận chất tan Ngoài ra, thông qua việc tính hiệu suất trích ly protein giúp sinh viên biết cách xác định nồng độ protein trong dung dịch dựa trên sự thay đổi độ hấp thu ánh sáng bằng máy đo quang phổ
II- NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT:
- Đậu nành
- NaOH 10%
- Nước cất
- CuSO4
- Natri kali tartrate NaKC4H4O6.4H2O
Cách pha thuốc thử: Chuẩn bị dung dịch Biuret: Hòa tan 1,5g đồng sulfate
(CuSO4) và 6g natri kali tartrate (NaKC4H4O6.4H2O) trong 500ml nước cất Thâm vào 300ml dung dịch NaOH 10% Bổ sung nước cất để được 1 lít thuốc thử và giữ trong chai nhựa PE Loại bỏ nếu thấy có màu đen hay màu đỏ xuất hiện (AOAC Offical Method 660.04)
- Dụng cụ:
+ Cột trích ly: cột
+ Cốc thủy tinh 500 mL: 8 cái
+ Giấy lọc φ 11cm: 1 hộp
+ Vải lọc: 1m
Trang 2+ Bình trích (tam giác 500 mL): 4 bình
+ Phểu lọc: 4 cái
+ Bình định mức để pha loãng mẫu (25 mL, 50 mL, 100mL) 1cái/mỗi loại + Cuvét nhựa ( Cuvette plastic) 1cm x 1cm ( để đo độ hấp thụ): 8 cái + Ống nghiệm đựng mẫu thử: 20 ống
+ Bơm cao su lấy hóa chất
+ Máy quang phổ hấp thu
III- TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:
- Đậu nành sau khi ngâm tách vỏ, nghiền mịn rồi chia làm 2 phần bằng nhau
để đảm bảo đồng nhất giữa 2 thí nghiệm Cho 2 mẫu vào 2 dụng cụ trích ly: cột trích ly và bình tam giác
- Cột trích ly: nhồi đậu nành vào cột trích ly, không nén mạnh nhưng không
để nhiều khoảng không trong cột trích
- Bình tam giác: cho mẫu đậu nành vào tiến hành đảo trộn khi trích ly
Thí nghiệm trích ly protein đậu nành được thực hiện với dung môi là nước với 3 lần trích ly theo tỷ lệ nước: đậu nành là 1:1 Thể tích dịch trích ly trong mỗi lần trích ly là bằng nhau
Trích ly:
Cho lượng nước bằng khối lượng đậu nành lần lượt vào 2 dụng cụ trích Khi dịch trích ở cột trích ly ngưng chảy, tiến hành đo thể tích V1 Đồng thời ngưng lắc thí nghiệm còn lại và lọc để có được dịch lọc với cùng thể tích V1
Tiến hành trích ly lần 1, lần 2 và lần 3 một cách tương tự trên bã lọc từ các lần trích trước đó
Khi kết thúc thí nghiệm, ở mỗi phương pháp sẽ có 3 dịch lọc với các thể tích lần lượt là V1, V2, và V3 Tiến hành tính hiệu suất thu hồi protein
Tính lượng protein trích trung tính ở các thời gian khác nhau, hiệu suất trích theo
Trang 3Sơ đồ quy trình thí nghiệm trích ly protein:
Đậu nành Ngâm Tách vỏ Nghiền Cân mẫu thí nghiệm
Trích ly khuấy trộn (50mL) Trích ly tự nhiên (50mL)
Dịch lọc A1 Lọc Lọc Dịch lọc B1
Trích lần 2 H2O Trích lần 2
Dịch lọc A2 Lọc Lọc Dịch lọc B2
Dịch lọc A3 Lọc Lọc Dịch lọc B3
Phương pháp xác định hàm lượng protein trong dịch lọc
Trang 4- Làm đường chuẩn: tính hệ số góc của đường chuẩn (s)
- Nồng độ protein trong dịch đo (mg/mL) = độ hấp thu/s
- Phân tích nồng độ protein
- Lấy mẫu và phân tích nồng độ protein bằng máy quang phổ ở bước sóng
546 nm với dung dịch Biuret Cần phải pha loãng dung dịch 50 lần trước khi đo độ hấp thụ (trong trường hợp dịch sữa đậm đặc cần pha loãng 50, 70 lần trước khi cho phản ứng với dung dịch thuốc thử Biuret
- Lấy 4 mL mẫu pha loãng và thêm vào 16 mL dung dịch Biuret trộn đều Sau 30 phút đem đo độ hấp thụ
- Khối lượng protein trong mẫu trích ly: mp = Xp.m =15% x 50g = 7,5g =
7500 mg
Trong đó:
m: khối lượng mẫu (mg)
Xp: hàm lượng protein (%w/w), trong mẫu là 15%
- Khối lượng protein trong mẫu trích ly: mi = Xi.n.Vi
Trong đó:
n: số lần trích ly (50 lần)
Vi: thể tích mỗi lần trích (mL)
Xi: nồng độ đo được (mg/mL)
- Hiệu suất trích ly ở mỗi lần trích ly: η i = mi/mp
- Hiệu suất của mỗi phương pháp trích ly: ηA = Σ ηi
- Dựa vào đường chuẩn Y = 0,2826X ta tính được X thông qua Y
Trong đó:
Y: Độ hấp thu ánh sáng
X: nồng độ protein (mg/mL)
Trang 5Bảng ghi nhận số liệu qua thí nghiệm Trích ly protein từ đậu nành:
Bảng ghi nhận độ hấp thu của dung dịch protein qua thí nghiệm:
các lần đo
0,134
0,680
0,636 0,664
0,642 0,685
0.616
0,242
0,250 0,239
0,251 0,132
0.225
0,389
0,393 0,396
0,392 0,394
0.392
0,183
0,187 0,185
0,189 0,192
0.187
0,250
0,272 0,246
0,266 0,262
0.218
0,165
0,156 0,157
Trang 6Tính toán kết quả:
mg/ml mi, mg η i η A và η B
Trích ly không
khuấy trộn
49.916 %
Trích ly khuấy
trộn
118.228%
IV Câu hỏi thảo luận:
Câu 1 Theo quan điểm truyền khối, điểm nào trong hai cách trích ly gây ảnh
hưởng đến hiệu suất và nồng độ trích?.
Trả lời:
Quan điểm truyền khối thì sự sai biệt nồng độ protein trong pha lỏng và pha rắn ảnh hưởng đến nồng độ và hiệu suất trong hai quá trình tích ly
Sự không khuấy và khuấy trộn trong 2 cách trích ly sẻ gây ảnh hưởng tới hiệu suất
Do trong trích ly khuấy trộn ta đảm bảo được cường độ truyền khối rất cao nên hiệu suất trích ly sẽ lớn.
Ngoài ra còn có phương pháp trích ly, dung môi, kích thước hạt.
Câu 2 Các thao tác thí nghiệm nào cần quan tâm để có kết quả như mong muốn?
Các thao tác trong thí nghiệm cần quan tâm là:
Trả lời:
Cách nghiền đậu nành và cho vào ống li trích.
Cân khối lượng đậu ở 2 đĩa bằng nhau.
Đậu cần được đâm nhuyễn vừa phải, không nên nghiền quá mịn.
Nhồi đậu vào cột trích không để hở, nhưng không quá kín để nước thấm đều hạt nhỏ nhất
Cho nước cất vào 2 bình cùng một thời điểm.
Đối với trích ly khuấy trộn phải thường xuyên lắc bình tam giác
Trang 7 Khi dịch trích ở cột trích ly ngưng chảy phải tiến hành đo thể tích, đồng thời ngưng lắc thí nghiệm còn lại để thu được dịch lọc cùng thể tích.
Câu3 Các yếu tố gây cản trở trong quá trình thực hiện quá trình trích ly:
Trả lời:
+ Các yếu tố gây cản trở là:
Thời gian trích ly: Nếu thời gian dài sẽ tăng hiệu của quá trình trích ly.còn nếu thời gian ngắn thì hiệu suất của quá trình trích ly không cao do sự tiếp xúc giữa hai pha còn ngắn, vì vậy sẽ xảy ra sự tác dụng của protein với các chất khác hoặc sẽ xảy ra các quá trình không mong muốn như hòa tan các chất khác vào nước làm cho protein không tinh khiết.
pH: Khi pH của môi trường trích ly phải phù hợp Thì pH môi trường ở giá trị điểm đẳng diện của protein thì protein sẽ bị kết tủa, tạo thành cặn bám làm ngăn cản và giảm hiệu suất của quá trình trích ly.
Nhiệt độ: Khi nhiệt độ cao làm tăng hiệu suất trích ly, vậy nếu nhiệt độ tăng quá cao
sẽ làm biến tính protein hoặc xảy ra những phản ứng biến đổi không mong muốn hoặc làm hòa tan các tạp chất.
Khi nghiền đậu nành không nên nghiền quá mịn, Nếu nghiền quá mịn thì sẽ trích ly được nhiều protein nhưng protein thu được sẽ không tinh khiết do còn lẫn bã đậu nành.
Câu 4 Nồng độ protein biến đổi như thế nào theo dọc chiều dài cột trích ly? Nếu chiều
dài cột trích ly tăng lên mãi thì nồng độ protein trong dịch trích thay đổi như thế nào? Trả lời:
Theo chiều dài cột trích ly đi từ trên xuống dưới thì nồng độ protein tăng theo chiều dài cột trích do trong quá trình hòa tan, khi protein được tích lũy dần theo dòng chảy từ trên xuống dưới Khi càng xuống gần đáy cột trích ly thì nồng độ protein càng cao Nếu chiều dài cột trích tăng mãi thì nồng độ protein tăng đến một giá trị nhất định nào đó.
Câu 5 Thời gian nước đi qua cột trích ly có ảnh hưởng đến kết quả trích ly không?
Trả lời:
Trang 8Thời gian nước qua cột trích có ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình trích ly protein, khi nước đi qua nhanh thì nồng độ protein thu được và hiệu suất trích ly không cao, nếu chậm quá thì hiệu suất trích ly sẽ cao nhưng thời gian lâu có thể làm hòa tan các chất khác làm cho lượng protein thu được không tinh khiết hoặc xảy ra các phản ứng phụ
mà ta không mong muốn chúng ta để tăng hiệu suất quá trình trích ly protein ta nên điều chỉnh thời gian cho phù hợp, các thao tác chính xác và hạn chế đến mức thấp nhất các yếu tố gây cản trở quá trình trích ly.
