Bài giảng miễn dịch kháng thể

Mở đầuSự kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên là một trong những chức năng của kháng thể .Chức năng của kháng thể Ig có liên quan chặt chẽ với cấu trúc, do cấu trúc kháng thể quy định: Đoạ

CHỨC NĂNG KHÁNG THỂ.

Mở đầuSự kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên là một trong những chức năng của kháng thể

Chức năng của kháng thể (Ig) có liên quan chặt chẽ với cấu trúc,

do cấu trúc kháng thể quy định:

Đoạn Fab: ( Fragment antigen binding)

Có chức năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên (KN),

làm bất hoạt nó, mà các kết quả lý-hóa đã được nghiên cứu và

ứng dụng trong nhiều kỹ thuật miễn dịch

Đoạn Fc:( Fragment crystallizable)

Như vậy, kháng thể có chức năng hoạt hóa hệ miễn dịch không

đặc hiệu

I.CHỨC NĂNG NHẬN BIẾT VÀ KẾT HỢP KN ( của Fab).

1.1Đại cương: Những khái niệm

1.1.1.Ba đặc tính của phản ứng kết hợp

KN-KT

+Sự kết hợp là thuận nghịch

Không phải là phản ứng hóa học, do vậy sau khi kết hợp và phân ly cấu trúc hóa học của KN hoặc KT hầu như không thay đổi

+Sự kết hợp là đặc hiệu.

KT do KN nào tạo ra chỉ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên ấy.

Tính chất này được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng nhiều chất nếu người ta tạo được KT chống chất đó.

+Phản ứng tạo nhiệt:

Nhiệt giải phóng ra từ 2,0-4,0 Kcal/mol

Các KT gọi là "lạnh" có thể giải phóng ra 30-40 Kcal/mol, kết hợp rất yếu với KN ở 37oC

KT nóng (như KT chống Rh) thì tỏa nhiệt kém (2-10 Kcal/mol) nhưng lại phản ứng với KN ở nhiệt độ 37

1.1.2.Paratop và epitop.

một vịtrí nhất định trên bề mặt KN (gọi là epitop) Paratop

nằm ở đầu tự do của Fab (đầu kia của Fab nối với Fc), thuộc

vùng thay đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (VH và VL).

Cấu trúc Paratop:

Paratop không phải là một đoạn peptit liên tục, dài,mà chỉ là một (hoặc một số) axit amin nằm cách quảng

Đó là những" điểm" mà paratop tiếp xúc với epitop Thông thường có từ 3-6" điểm" như vậy

1.1.3.Các lực liên kết giữa KN-KT (epitop và

paratop)

Lực hút tĩnh điện:

Được thực hiện giữa một nhóm chứa chức mang điện của paratop với một nhóm mang điện khác dấu của epitop

Ví dụ: Giữa - COO- và - NH3+ lực này c n một khoảng cách ầ

thích hợp giữa 2 nhóm để đạt trị số tối đa

Nó tỷ lệ nghịch với bình phương khoảng cách (d), vì vậy nếu khoảng cách tăng lên thì lực giảm đi rất nhanh

Nó tỷ lệ nghịch với bình phương khoảng cách (d), vì vậy nếu khoảng

Lực của cầu nối hydro:

Tạo ra giữa nguyên tử H+ (trên phân tử KN hoặc KT ) thực chất

đây cũng là lực hút tĩnh điện, nên cũng phụ thuộc vào khoảng cách.

Lực liên kết kỵ nước:

Một khi 2 nhóm kỵ nước nằm đủ gần, thì chúng sẽ liên kết nhau sau khi lọai trừ các phân tử nước ở giữa chúng người ta cho rằng lực này chi phối 50% lực liên kết KN-KT nối chung

Lực Van der Walls:

Do sự chuyển động của các điện tử làm cho phân tử trở thành có

cực,và hút phân tử bên cạnh nếu tiếp cận với lực khác dấu của phân tử này

Khoảng cách có vai trò hết sức to lớn, vì lực này tỉ lệ nghịch với d

- Các lực nói trên nếu riêng rẽ thì hoàn toàn không đủ mạnh để chống lại va chạm do chuyển động nhiệt (Brown) Để liên kết

được KN-KT, các lực phải phối hợp nhau

- Cấu hình của paratop phải phù hợp cao độ với epitop sao cho các lực đó đồng thời xuất hiện

Koảng cách 2 bên phải thích hợp để các lực đó cùng đạt giá trị cao Đó là bản chất của khái niệm về tính đặc hiệu KN-KT và ái tính giữa chúng

1.1.4 Tính tạp loại của KT trong một kháng huyết

thanh

Mẫn cảm cho con vật bằng một protein tinh khiết (ví dụ:

ovalbumin có 10 epitop, hoặc thyroglobulin có 40 epitop) ta thu được kháng huyết thanh chứa các KT "cùng chống lại

một KN'' Do vậy gọi là kháng huyết thanh đơn đặc hiệu

Tuy nhiên hỗn hợp KT trong kháng huyết thanh này vẫn tạp về tính đặc hiệu.

-Ngay một tập hợp các KT cùng chống một epitop vẫn có sự tạp

loại Khi gây mẫn cảm liên tục bằng một KN duy nhất chỉ mang một epitop duy nhất (hapten) thì càng về sau, ta càng thu được KT có

tính đặc hiệu (ái tính) cao hơn trước

Tuy vậy hỗn hợp KT này vẫn còn tạp loại về mức độ đặc hiệu, vì

vẫn do các clon limpho bào khác nhau sản xuất ra

-Nếu tách ra một tế bào tạo KT riêng rẽ (thuộc một clon) rồi cho nhân lên, sau khi lai ghép với tế bào u, thì clon này sẽ sản xuất các phân tử

KT giống nhau hoàn toàn về cấu trúc phân tử, paratop, và có cùng

mức độ đặc hiệu.

Đó là KT đơn đặc hiệu đơn clon, không có trong điều kiện tự nhiên

1.1.5.Ái tính của KT với KN (affinity).

Ái tính được biểu thị đặc trưng bằng tổng hợp tất cả các lực liên kết giữa một paratop với một epitop Muốn nghiên cứu về mặt định lượng ái tính của KT, người ta phải dùng những KN chỉ mang một epitop (tức hapten) Vì phản ứng kết hợp KN-

KT là thuận nghịch nên khi trộn KN với KT dù ở tỉ lệ rất thích hợp, ta vẫn thấy KN và KT ở dạng tự do, do bị phân ly.

KN + KT ⇔ KN - KT

[KN-KT]

K[KN][KT]

K: Hằng số kết hợp, biểu thị bằng lít/mol.

K Cũng là ái tính của KT đối với một epitop nhất định của KN

Ta dễ thấy rằng, nếu ái tính cao thì đa số KT nằm trong phức hợp (khiến tử số tăng lên và mẫu số giảm đi, làm cho K tăng theo)

1.1.6.Háo tính của kháng thể.

Trên thực tế một KN có nhiều epitop cùng một lúc bị nhiều KT kết hợp

Trường hợp đó, người ta không thể đo được ái tính, mà chỉ đo được háo tính (có ý nghĩa thực tiễn hơn) Háo tính cho biết tốc độ kết hợp

KT và KN

1.2 Kết quả sinh học của kết hợp KN-KT.

Khi bị KT kết hợp, KN không bị biến đổi về mặt cấu trúc hóa học, nhưng bị thay đổi về tính chất sinh

Các phân tử KN có hoạt tính khi bị KT đặc hiệu kết hợp sẽ mất

hoạt tính

Từ lâu, người ta đã biết sản xuất KT chống độc tố (uốn ván,

bạch hầu) dùng trong phòng bệnh và điều trị

Trong bệnh lý, kháng thể chống insulin, thyroglobulin gây suy

giảm chức năng tuyến tụy, tuyến giáp

Kháng thể chống enzym có tác dụng khử hoạt enzym

Cơ chế khử hoạt có thể là:

a Vị trí hoạt động của phân tử KN (có hoạt tính):

Bị KT che phủ bằng sự kết hợp khiến nó không tiếp xúc được đối

tượng tác động nữa (ví dụ: thụ thể tế bào đích)

b Cấu hình của vị trí có hoạt tính:

Bị biến dạng, không còn đặc hiệu với đích nữa

c.Phân tử có hoạt tính:

Thay đổi về hình thể không gian

2- Bất hoạt vi rút.

Kháng thể làm cho vi rút mất khả năng kết hợp với thụ thể của tế bào đích, do vậy vi rút không thâm nhập

được vào nội bào sẽ nhanh chóng chết ở ngoại bào

Trường hợp vi rút đã lọt vào nội bào, KT vẫn có khả năng gây bất hoạt theo một cơ chế khác

Vi rút tồn tại và phát triển trong tế bào sẽ hình thành một số KN

(epitop) đưa lên bề mặt tế bào, và bị KT kết hợp

KT không trực tiếp diệt vi rút mà có tác dụng hấp dẫn đại thực bào và NK (tế bào diệt tự nhiên) đến tiêu diệt cả tế bào nhiễm laên vi rút bên trong

3 Bất hoạt vi khuẩn, ký sinh vật và ấu trùng của chúng:

-Tốc độ nhân lên của vi khuẩn giảm đi rõ rệt hoặc mất hẳn (không tạo được khuẩn lạc trong nuôi cấy ở gen thạch)

Các quá trình trao đổi chất qua màng và chuyển hóa nội bào bị rối loạn, gián đoạn hoặc ngừng Vi khuẩn chết.

-Xoắn khuẩn mất khả năng hoát động khi bị KT kết hợp

-Các ký sinh vật đơn bào và một số đa bào (sốt rét, trypanosom,

amip, giun chỉ ) bị KT diệt trực tiếp như cơ chế diệt vi khuẩn Nhiều loại ấu trùng (giun, sán) bị IgG ,IgA ở ruột làm chậm hay ngừng phát triển, tỉ lệ nở và trưởng thành giảm rõ rệt, hoặc không thâm nhập

được qua niêm mạc ruột để vào máu IgE trong các mô có vai trò rất

4 Chức năng tập trung kháng nguyên:

Bằng cách gây tủa, gây ngưng kết

kháng thể có vai trò làm cho KN từ dạng phân tán trở thành tập trung lại, do vậy hạn chế khả năng lan rộng của KN, đồng thời tạo điều kiện quy tụ các biện pháp bảo vệ không đặc hiệu vào nơi KN bị tập trung (viêm, thực bào, độc tế bào, bổ thể )

5.Kết quả hóa lý của kết hợp KN-KT:

1 Phản ứng tủa:

Nếu phân tử KN chỉ có một epitop thì kết hợp với KT

(hóa trị 2) sẽ tạo ra các tập hợp KN-KT-KN riêng rẽ

không thể thấy bằng mắt thường

Trên thực tế, phổ biến là trường hợp KN có nhiều epitop sẽ bị 1 Fab của KT kết hợp, còn Fab thứ 2 sẽ kết hợp với 1 epitop cùng loại ở 1 phân tử KN khác Ta có tập hợp: - KN - KT - KN - KT - Do vậy, tập hợp này có điều kiện để mở rộng theo 3 chiều không gian, hình thành một cấu trúc mạng, đủ lớn để có thể thấy được bằng mắt thường (mờ,

Khi trộn dung dịch KN với dung dịch KT, nếu xuất hiện tủa, ta có

thể nói KN bị KT kết hợp, hoặc KT là đặc hiệu với KN

Nếu không có tủa, ta chưa thể nói chúng không kết hợp với

Ví dụ: Khi quá thừa KN thì tập hợp sẽ là KN -KT-KN, nhưng lại thiếu kháng thể để liên kết chúng lại thành cấu trúc mạng

Ngược lại khi quá thừa KT ta có các tập hợp: KT-KN-KT, nhưng

a.Phản ứng tủa trong môi trường lỏng:

Khi trộn dung dịch KN với dung dịch KT sẽ xẩy ra sự xuất hiện tủa làm cho dung dịch từ trong suốt trở thành mờ,đục, vẩn

Từ rất lâu nó đã được sử dụng để phát hiện KN

( hoặc KT) nếu có sẵn thứ kia, ví dụ:trong chẩn

đoán, trong đánh giá kết quả gây mẫn cảm

b Phản ứng tủa trong gien.

Trong một cấu trúc gel, chẳng hạn gel tinh bột hoặc

gel thạch, thì phần đặc chỉ chiếm 1-2% khối lượng,

nhưng nhờ các phân tử chất rắn có cấu trúc dạng sợi

nên đã tạo được một cấu trúc lưới trong không gian,

ch a được rất nhiều chất lỏng (chiếm 98-99% khối ứ

lượng)

Trong kỹ thuật miễn dịch, gien thạch hay được sử dụng hơn cả: Đun sôi (cách thủy càng tốt) 1-2 gram thạch agar với 98-99 ml NaCl 9%0 (hoặc đệm đẳng trương,

.Phản ứng ngưng kết.

Là phản ứng liên kết các tiểu thể thành một cấu trúc lớn, quan sát được bằng mắt thường

Như( hồng cầu, bạch cầu), hạt trơ nhân tạo, có mang

KN một cách tự nhiên hoặc KN được gắn vào do bệnh lý hoặc do nhân tạo

Vì kích thước tiểu thể gấp bội kích thước phân tử, nên phản ứng ngưng kết trong miễn dịch nhạy gấp nhiều lần phản ứng tủa

a.Ngưng kết chủ động ( hay trực tiếp).

Khi KN là một cấu phần của tiểu thể ( thường là tế bào)

- Phản ứng định nhóm hồng cầu ( AB): Kháng thể chống A ( hoặc chống B) được lấy từ những người có hồng cầu

thuộc nhóm B ( hoặc A).

Giọt máu trên kính có màu đỏ mịn, khi thêm kháng thể vào, trộn đều, nếu có phản ứng ( +) thì các hồng cầu sẽ

ngưng kết thành cụm, mắt thường thấy được dưới dạng các hạt đỏ sẫm, lổn nhổn

- Trong phản ứng cổ điển ( widal) đeơ chẩn đoán thương hàn thì KN là caùc tiểu thể Salmonella ( nuôi cấy), được trộn với huyết thanh người bệnh ( Có thể hòa loãng huyết thanh theo hệ số 2) để xác định hiệu giá KT, tức là xem ở độ hòa loãng nào của KT vẫn gây được ngưng kết

b.Ngưng kết thụ động ( hay gián tiếp)

Khi KN được gắn nhân tạo lên tiểu thể, tức là lên "giá đỡ " ( có

thể dùng hồng cầu nhóm O, hồng cầu cừu, hạt latex ).

Cũng có thể gắn KT lên giá đỡ, khi đó gọi là phản ứng " ngưng kết thụ động ngược "

Hiện nay đã tìm ra nhiều cách gắn KN ( hoặc KT) lên giá đỡ, gồm cả việc chế tạo các hạt trơ có khả năng tự gắn một số KN.

Ví dụ:

- Phản ứng chẩn đoán giang mai:KN lấy từ tim bê, giá đỡ là tinh thể cholesterol, hoặc KN là xoắn khuẩn, giá đỡ là hồng cầu xử lý bằng formol.

- Để phát hiện cái gọi là " yếu tố dạng thấp"-một tự KT

thường xuất hiện trong bệnh thấp người ta làm như sau: Thoạt tiên sản xuất IgG chống hồng cầu cừu , IgG sẽ tự động gắn vào hồng

Nhưng nếu ta thêm kháng thể ( từ thỏ) chống IgG người, thì các tập hợp nói trên sẽ bị liên kết lại, tạo

d.Phản ứng cố định ( tiêu thụ) bổ thể.

Khi trộn KN với KT, nhiều trường hợp ta không quan sát thấy tủa (hoặc ngưng kết), có thể do nồng độ của chúng quá thấp, hoặc KT thuộc loại không gây tủa

Tuy vậy, nếu có mặt bổ thể, bổ thể sẽ bị hoạt hóa, gắn vào phức hệ KN-KT, do vậy lượng bổ thể tự do sẽ hao hụt đi

Qua đó, ta phán ñđoán được đã xẩy ra sự kết hợp

KN-KT

e.Miễn dịch đánh dấu:

Nếu KN hay KT được gắn các chất để "đánh dấïu "cho dễ phát hiện, thì phản ứng kết hợp KN-KTsẽ tăng độ nhạy lên rất nhiều lần

Cố nhiên, chất đánh dấu không được làm biến tính

KN, KT, không dễ bong ra

Hiện nay, người ta đánh dấu KT bằng chất phát

huỳnh quang (phát hiện bằng kính hiển vi dùng tia tử ngoại), hoặc dùng enzym (phát hiện bằng cơ chất thích hợp), hoặc dùng đồng vị phóng xạ (phát hiện

Miễn dịch gắn enzym (ELISA) Enzyme linked

immunosorbent assay

Cũng theo nguyên lý trên, chất phát huỳnh quang được thay bằng enzym có hoạt tính cao (ví dụ peroxydaza), phát hiện bằng cơ chất đặc hiệu, thường cho màu, hoặc dễ phát hiện sản phẩm bằng một phản ứng lên màu.

Ưu điểm là nhạy hơn nhiều lần so với kỹ thuật huỳnh

quang và có thể phát hiện KN dạng phân tử, không cần

gắn với tế bào.

Cách tiến hành:

Phủ KN lên đáy ống nghiệm (bằng chất cao phân tử để

gắn chặt) sau đó phủ tiếp huyết thanh nghi ngờ có KT đặc hiệu lên rồi rửa bỏ KT thừa; phủ tiếp KT đánh dấu

(enzym) rồi rửa tiếp, cuối cùng phủ cơ chất lên

f Miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio - Immunoassay):

Là cho kết quả nhạy nhất, dựa theo nguyên lý cạnh tranh

Còn rất nhiều kỹ thuật khác cũng có sử dụng

nguyên lý kết hợp đặc hiệu giữa KN và KT (cụ thể là giữa Fab có paratop kết hợp được với epitop của KN)

2.CHỨC NĂNG HOẠT HÓA HỆ MIỄN DỊCH

KHÔNG ĐẶC HIỆU

 Đây là chức năng của đoạn Fc

 Thông thường, hệ miễn dịch không đặc hiệu có thể hoạt hóa mà không cần kháng thể

 Sinh vật chưa tiến hóa đến mức tạo ra KT đặc hiệu vẫn có thể tự bảo vệ trước các yếu tố gây bệnh

 Nhưng khi kháng thể đặc hiệu xuất hiện,thì nó là tác nhân quan trọng bậc nhất hướng các biện pháp không đặc hiệu vào nơi KN tập trung mà việc tập

2.1.Chức năng hoạt hóa bạch cầu.

Trước đây các bạch cầu được xếp vào hệ huyết học, nay rõ ràng để cho hợp lý và phù hợp với chức năng chủ yếu của chúng, người ta phải xếp bạch cầu vào hệ miễn dịch.

Nhiều loại bạch cầu có thụ thể với Fc của kháng thể.

Bạch cầu ưa eosin : các IgG

Bạch cầu K : các IgG

Lympho bào (T,B) : các IgG (IgM,A: ở một số tế bào)

Hoạt hóa bạch cầu thực bào (hiện tượng opsonin hóa)

- Đại thực bào có thể ăn và tiêu hủy nhiều đối tượng thực bào khác nhau, nhưng khi KT gắn

Fab vào các đối tượng đó (còn Fc gắn với thụ thể của đại thực bào) thì tế bào này được hoạt hóa

rất mạnh, tăng cường khả năng bắt giữ, nuốt và tiêu hủy đối tượng (mang KN)

Những ký sinh vật bị phủ bới IgE cũng là đối

tượng hấp dẫn và hoạt hóa đại thực bào.

Có thể hình dung kháng thể là cầu nối phân tử giữa các tế bào thực bào với đối tượng thực bào -Bạch cầu đa nhân trung tính vẫn có khả năng

bám và thực bào Nhưng Fc của kháng thể (và

C3b của bổ thể) là những chất opsonin mạnh, tức là có khả năng kích hoạt sự bám dính, ăn, tiêu

- Bạch cầu ưa eosin có thể trở thành tế bào gây độc nếu thụ thể của nó ( với Fc) được Fc gắn vào

Bằng cách này người ta thấy bạch cầu ưa eosin diệt các ký sinh trùng và ấu trùng của nó, sau khi các đối tượng này bị phủ bởi KT đặc hiệu

- T ươ ng tự như vậy, tính gây độc của tế bào NK tăng lên và chúng trở thành có định hướng khi có mặt KT làm cầu nối giữa chúng với tế bào đích

Bằng cách này, NK đã diệt tế bào mang vi rút, tế

bào ung thư

Hoạt hóa tế bào gây độc:

Là các tế bào có khả năng tiết ra các cytokin-toxin gây độc, gây

chết cho các tế bào mang KN

Đối tượng chủ yếu của chúng là những tế bào (mang KN) đã bị đoạn Fab của KT kết hợp, còn đoạn Fc tự do có vai trò hấp dẫn

các tế bào gây độc (vốn có thụ thể với Fc)

Đây là cách "gây độc phụ thuộc KT" (ADCC: Antibody

dependant cellular cytotoxicity)

Hoạt hóa tế bào ái kiềm (bazơ)

Tế bào ưa kiềm có thụ thể gắn được với Fc của phân tử IgE Phần Fab của IgE khi bị KN kết hợp sẽ thông qua thụ thể nói trên, khởi động một cơ chế giải phóng các hạt chứa các chất gây viêm (tăng thấm mạch) ra