Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài mang (muntiacinae) ở việt nam nhằm phục vụ bảo tồn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ NGUYỄN VĂN THÀNH SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG MUNTIACINAE Ở VIỆT NAM NHẰM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN VĂN THÀNH

SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM

PHỤC VỤ BẢO TỒN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN VĂN THÀNH

SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TIẾN HÓA CÁC LOÀI MANG (MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM

PHỤC VỤ BẢO TỒN

Chuyên ngành : Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Đức Minh

PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS

Lê Đức Minh cùng PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, là những người đã trực tiếp hướng dẫn và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Thầy cô đã cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên môn cũng như bồi đắp niềm đam mê, tính sáng tạo trong quá trình nghiên cứu Bên cạnh đó, tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo của Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong quá trình học tập tại bộ môn, đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Đồng thời tôi cũng gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ thuộc Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội; cùng các bạn đồng nghiệp đã giúp tôi thu thập, phân loại các mẫu vật quý giá để sử dụng trong nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Học viên

2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử 82.1 Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài Mang sử dụng trong

2.2 Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh 10

2.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa 27

i

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ADN Deoxyribo nucleic acid Axit deoxyribonucleic

EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit ethylen diamin tetraaxetic

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối

UPGMA unweighted pair group with

arithmetic mean

unweighted pair group with arithmetic mean

ii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3 Mang Trường Sơn (M truongsonensis) 7 Hình 4 Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu 22 Hình 5 Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu xương trên gel

Hình 6 Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu da khô trên gel

Hình 7 Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1

Hình 8 Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-2

Hình 9 Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4

Hình 10 Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen G-fib

Hình 11 Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2 33 Hình 12 Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng

Hình 13 Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên dữ liệu gen

cytochrome b (1140bp) sử dụng phương pháp Bayesian 38 Hình 14 Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 3 gen

ty thể và 1 gen nhân (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị

thông tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML

41

Hình 15 Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của

Bảng 7 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang

Roosevelt dựa trên dữ liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4, 16S, G - fibrinogen

40

Bảng 8 Khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn 42

Bảng 10 Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến

hóa

43

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam được biết đến là một đất nước đa dạng cao về hệ sinh thái, sông ngòi, cũng như hệ thống các loài động thực vật Các vùng tự nhiên của Việt Nam có nhiều loài và nhiều trong số đó không tìm thấy ở nơi khác trên thế giới Các nghiên cứu nhằm tìm kiếm các loài mới, đánh giá chi tiết về mức độ đa dạng của hệ thống động thực vật ở Việt Nam đã và đang được tiếp tục thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều loài ở Việt Nam chưa được nghiên cứu chi tiết bởi nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình nghiên cứu

Cụ thể, trong 15 năm trở lại đây, năm loài Mang (Muntiacus) đã được tìm thấy

ở Việt Nam dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có ở trong nước [7 , 12 , 42] Mặc dù vậy, vẫn chưa có các nghiên cứu chi tiết, đánh giá phân bố, đa dạng di truyền cũng như quan hệ tiến hóa giữa các loài Mang trên lãnh thổ Việt Nam Điều này một phần do tính quý hiếm, khó bắt gặp cùng tập tính nhút nhát của các loài Mang Ngoài ra, chúng đã được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu, sắp nguy cấp và nguy cấp trong sách đỏ thế giới Do đó, việc điều tra sử dụng các phương pháp truyền thống có thể không đánh giá được chính xác mức độ đa dạng trong nhóm này, vì những mẫu thu được từ điều tra thực địa hầu như không cho phép thực hiện những nghiên cứu so sánh kỹ lưỡng về mặt hình thái Trong khi đó, với sự phát triển của sinh học phân tử trong những năm gần đây, những phương pháp sử dụng ADN đã dần trở thành những công cụ hữu hiệu để điều tra tổng thể những loài khó bắt gặp và có thể giúp làm sáng tỏ những mối quan hệ tiến hóa của những loài được nghiên cứu Trong hoàn cảnh này, việc nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu không trực tiếp dựa, và các chỉ thị phân tử ADN đối với các mẫu Mang hứa hẹn có hiệu quả cao

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài Mang (Muntiacinae) ở Việt Nam nhằm phục vụ bảo tồn” với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, cũng như phân bố, cùng

mối quan hệ tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nhóm Mang

1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới

Mang là một nhóm các loài thú móng guốc thuộc họ hươu nai Cervidae, phân

họ Muntiacinae, giống Muntiacus; nhóm này hiện nay trên thế giới cho đến nay,

dựa theo dữ liệu thu được của sách đỏ thế giới (The IUCN red list of threatended species) được xác định có 13 loài (Bảng 1) Mang có cơ thể nhỏ, sống đơn độc hoặc theo các nhóm nhỏ, môi trường sống của chúng thường là các khu rừng xanh nhiệt đới ở châu Á với độ cao tương đối lớn Rất nhiều loài Mang hiện đang bị đe dọa bởi tình trạng săn bắn bất hợp pháp, cũng như tình trạng mất dần môi trường sống của chúng [20 , 30]

Hiện nay, một vài loài Mang như Mang đen (Muntiacus crinifrons), Mang Reeve (Muntiacus reevesi) đang được tập trung nghiên cứu, đánh giá [11 , 31 , 35]

Tuy nhiên, phần lớn các loài Mang khác đều chưa có các nghiên cứu cụ thể Do đó, thông tin về các loài này còn rất ít, thậm chí một số loài Mang đã không được phát hiện cho đến cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21 (như Mang Roosevelt ở Việt Nam - Lào, Mang Ghongshan ở tây nam Trung Quốc, Mang lớn ở vùng biên giới Việt Nam -

Lào) [30] Loài Mang Roosevelt (M rooseveltorum) từ sau khhi được mô tả năm

1932 rất hiếm khi được bắt gặp, cho đến năm 1999 được tái phát trở lại tại hiện tại Lào, mặc dù vậy các mẫu tìm thấy chỉ là các mẩu xương nhỏ sọ [7]; và từ thời điểm

1999 cho đến nay chưa có công bố của nghiên cáo nào cho thấy sự xuất hiện của

loài này Loài Mang Putao (M putaoensis) được mô tả năm 1999 [6] có vùng phân

bố ở phía Bắc Myanmar có quan hệ rất gần với 2 loài Mang khác có khu phân bố ở

trong dãy Trường Sơn là Mang Trường Sơn (M truongsonensis) và Mang Roosevelt (M rooseveltorum) Ba loài này có hình thái nhỏ và nhiều đặc điểm khá giống nhau kể cả về quan hệ di truyền [6 , 23] Mang vàng Borneo (Muntiacus

3

atherodes) là loài đặc hữu ở Borneo Trong suốt một thời gian dài, đã có sự nhầm

lẫn giữa loài Mang vàng Borneo và loài Mang thường [30]

Bảng 1 Danh sách các loài Mang trên thế giới

1 Muntiacus atherodes Đảo Borneo (Brunei, Indonesia và Malaysia)

2 Muntiacus crinifrons Trung Quốc

3 Muntiacus feaes Myanmar, Thái Lan

4 Muntiacus gongshanensis Trung Quốc, Myanmar

5 Muntiacus montanus Indonesia

6 Muntiacus muntjak Bruine, Indonesia, Malaysia, Thái Lan

7 Muntiacus vaginalis Campuchia, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Thái

Lan, Việt Nam, Trung Quốc

8 Muntiacus puhoatensis Việt Nam

9 Muntiacus putaoensis Ấn độ, Myanmar

10 Muntiacus reveesi Trung Quốc, Đài Loan

11 Muntiacus rooseveltorum Lào, Việt Nam

12 Muntiacus truongsonensis Lào, Việt Nam

13 Muntiacus vuquangensis Lào, Việt Nam

Nhóm Mang hiện được các nhà tiến hóa rất quan tâm bởi sự đa dạng trong số lượng nhiễm sắc thể giữa các loài Mang Cụ thể, ở Mang thường, đây là cũng là loài thú

có số lượng nhiễm sắc thể ít nhất với 2n = 6 ở giống cái và 2n = 7 ở giống đực;

Mang Trung Quốc (M reevesi) có 2n = 46 ở cả hai giới, M crinifrons 2n = 8 ở giống cái và 2n = 9 ở giống đực, M feae 2n = 13 ở giống cái và 2n = 14 ở giống

đực [44] Tuy nhiên, cho đến nay, nguyên nhân của hiện tượng này còn chưa được biết rõ

4

Hình 1 Mang Ấn Độ (M vaginalis)

1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam

Hiện nay, Việt Nam được thống kê có 5 loài Mang sinh sống [7 , 12 , 42] bao

gồm: Mang Ấn Độ (M vaginalis) [42], Mang Pù Hoạt (M puhoatensis) [10], Mang Roosevelt (M rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M truongsonensis) [36], Mang

Vũ Quang hay Mang lớn (Megamuntiacus vuquangensis hay Muntiacus

vuquangensis) [40 , 43] Sau đây là một số mô tả về 5 loài Mang được xác định là

có thể có mặt ở Việt Nam

1.1.2.1 Mang Ấn Độ (M vaginalis)

Mang Ấn Độ (M vaginalis) hay Mang thường (common muntjac) là tên gọi

thông thường của loài Mang này (Hình 1) Loài này, con đực có sừng nhỏ dài khoảng 15cm và chỉ có duy nhất 1 nhánh Mang Ấn Độ đôi lúc còn được gọi là

“Mang sủa” bởi tiếng kêu đặc trưng của nó khi có nguy hiểm Những bằng chứng

cổ sinh vật học cho thấy Mang Ấn Độ đã xuất hiện ít nhất là từ cuối kỷ Pleistocene cách đây 12.000 năm Loài này thường bị săn bắn để lấy da và thịt Mang Ấn Độ là loài có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet, Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy loài này có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân loài đã được mô tả dựa trên vùng phân

bố về địa lý [16]

5

1.1.2.2 Mang Pù Hoạt (M puhoatensis)

Loài Mang này được mô tả một cách ngẫu nhiên trong một bài báo phổ thông [10] dựa trên cơ sở các mẫu gạc và một phần trán được Lê Trọng Trải và Đỗ Tước thu được từ khu vực Pù Hoạt, Quế Phong, Nghệ An, Việt Nam vào năm 1997 [41] Tuy vậy, loài Mang này chưa từng được nghiên cứu chi tiết về mặt hình thái cũng như chưa từng được đưa vào những nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loại

để đánh giá tính xác thực về mặt di truyền Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi

sẽ tiến hành phân tích di truyền cho loài này dựa trên các mẫu được xác định về mặt hình thái là của loài Mang Pù Hoạt

1.2.3 Mang Roosevelt (M rooseveltorum)

Loài Mang Roosevelt được mô tả vào năm 1932 bởi Osgood [33] và trong suốt 60 năm tiếp theo không có bất kỳ mẫu vật nào được ghi nhận Loài này được ghi nhận tại 3 địa điểm ở Lào, và các mẫu thu được từ thợ săn đều là các mẫu vật không nguyên vẹn Cụ thể, vào tháng 2 năm 1995, hai mẫu xương sọ gần như nguyên vẹn và 6 phần xương sọ khác đã được tìm thấy tại Lào [7] Loài này hiện nay được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu trong danh sách đỏ thế giới (IUCN) Hiện nay phân loại cho loài này còn khá nhiều tranh cãi Về mặt hình thái, loài này rất khó phân biệt với các loài Mang có quan hệ gần khác như Mang Putao và Mang Trường Sơn Nguyên nhân của vấn đề này là bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật cho đến nay rất ít [42] Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào, chúng tôi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này Khi thực hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng tôi đã xác nhận sự có mặt của loài Mang này Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định loài này có khu vực phân bố ở Việt Nam [28] Ngoài ra, chúng tôi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di

6

truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn Xuân Liên, kết quả cho thấy, trong loài này có những nhánh tiến hóa riêng biệt Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu bảo tồn Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể trong hai khu bảo tồn [4]

1.2.4 Mang Vũ Quang (M vuquangensis)

Mang Vũ Quang (M vuquangensis) hay còn được gọi là Mang lớn (Giant muntjac hay Megamuntiacus vuquangensis) (Hình 2) Vào năm 1994 nhóm nghiên

cứu của Tổ chức Bảo tồn Động vật Hoang dã (Wildlife Conservation Society) đã tìm thấy một số mẫu sừng có kích thước lớn bất thường của nhóm Mang tại các ngôi làng thuộc dãy Trường Sơn ở phía Đông trung tâm Lào, gần với biên giới VN

và họ cũng tìm thấy một con đực có sừng Mang các đặc điểm tương tự bị nhốt ở một gánh xiếc vào tháng 3 năm 1994 Với kích thước lớn và có nhiều đặc điểm hình thái khác biệt với các loài đã mô tả, các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết về khả năng đây là một loài mới [17 , 40] Trong giai đoạn này, các mẫu sừng và hộp sọ có các đặc điểm tương tự cũng được tìm thấy xung quanh khu bảo tồn Vũ Quang ở Việt Nam [38], và ở một số khu vực khác cùng địa bàn trên [12] Vì vậy, loài Mang

lớn (Megamunticus vuquangensis) đã được mô tả vào năm 1994 Chúng đã được

chứng minh là một loài mới dựa trên cơ sở về kích thước và sự sai khác của trình tự

Hình 2 Mang Vũ Quang (M vuquangensis)

7

ADN của các gen ty thể giữa Mang lớn, Mang Ấn Độ, Mang Trung Quốc

(Muntiacus reevesi) [19]

1.2.5 Mang Trường Sơn (M truongsonensis)

Về mặt hình thái, Mang Trường Sơn (Hình 3) được mô tả có kích thước cơ thể nhỏ hơn Mang Ấn Độ Chúng có màu đen, trọng lượng xấp xỉ 15kg; đuôi rộng

và ngắn, đen ở đỉnh đồng thời có dải trắng bên dưới Hộp sọ của Mang Trường Sơn nhỏ hơn so với Mang thường, gạc chính ngắn [36] Trình tự ADN của 6 mẫu có đặc điểm nhận dạng của Mang Trường Sơn cho thấy đây là loài Mang khác với các loài

đã biết Với phát hiện mới này, đây là loài móng guốc thứ 3 được xác nhận là loài mới ở Việt Nam trong vòng 5 năm Mang Trường Sơn là loài Mang thứ hai được

tìm thấy và mô tả ở dãy Trường Sơn là loài mới sau Mang Vũ Quang (M

vuquangensis) Các mô tả này dựa trên hình thái xương sọ, trình tự ADN và thông

qua phỏng vấn người dân [36]

Trong các loài trên, ngoại trừ loài Mang Ấn Độ, bốn loài Mang còn lại đều được tìm thấy trong vòng 15 năm trở lại đây hoặc dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có mặt trong nước Những loài Mang cho đến nay vẫn được coi là không có

ở Việt Nam nhưng phân bố ở gần biên giới , như loài M reevesi có thể có mặt ở

nước ta nếu có những điều tra chi tiết hơn ở khu vực phía Bắc Đồng thời loài Mang

Hình 3 Mang Trường Sơn (M truongsonensis)

Vncreatures

W Robichaud

8

Pù Hoạt được mô tả vào năm 1997 cho đến nay vẫn chưa có bất cứ nghiên cứu nào

ở cấp độ phân tử để đánh giá tính xác thực của loài này Hơn nữa, Việt Nam có thể còn có những loài ẩn sinh chưa được biết đến Để hiểu rõ hơn mức độ đa dạng của nhóm này ở nước ta, xác định những thông tin cơ bản như vùng phân bố và số lượng chính xác của các loài thuộc nhóm Mang cần có những nghiên cứu chi tiết hơn đặc biệt cần có những nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa dạng di truyền [2]

2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử

2.1 Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử dụng trong nghiên cứu

Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu hiệu hình thái bên ngoài, tập tính, cấu trúc tế bào Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu hình thái cho thấy một số hạn chế, cụ thể như ở các loài rất xa nhau nhưng do hiện tượng đồng hình nên có hình thái giống nhau, hay ở một số trường hợp, đặc điểm kiểu hình rất khó quan sát như ở các vi sinh vật [1] Từ giữa những năm 1990, với

sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một số phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử [1] Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) để giúp xây dựng cây phát sinh chủng loại Trong đó, việc sử dụng chỉ thị là trình tự ADN cho hiệu quả và

độ tin cậy cao trong các nghiên cứu [25] Trong trường hợp này, các dấu hiệu phân

tử (chủ yếu là nucleotide) có thể khắc phục những khó khăn của phương pháp phân loại dựa trên hình thái [1]

Hiện nay có một số phương pháp cơ bản sử dụng chỉ thị ADN để xác định các mối quan hệ di truyền như: Microsatellites, RFLP (restriction fragment length polymorphisms), giải trình tự ADN (DNA sequence) Với phương pháp giải trình tự (DNA sequence) các vùng gen cần thiết được nhân lên bằng phản ứng PCR để tiến hành xác định chính xác trình tự các nucleotide trên đoạn gen mong muốn Dựa vào

9

tốc độ biến đổi của các nucleotide trên các vùng gen, chúng ta có thể xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Cụ thể, mức độ thay thế các nucleotide tại mỗi vùng ADN của hệ gen là khác nhau và phụ thuộc áp lực chọn lọc tự nhiên trên mỗi locut

và chức năng của sản phẩm gen Tuy vậy, ở các locut có áp lực chọn lọc tương đương thì tốc độ thay đổi trong các trình tự ADN là ổn định, khi xét trong quãng thời gian tiến hóa lâu dài Quan hệ di truyền giữa tất cả các dạng sống đều có thể được xác định dựa trên việc so sánh các chỉ thị phân tử giữa chúng với nhau Có nhiều phương pháp được thiết lập nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Một trong nhưng phương pháp cơ bản nhất là xây dựng sơ đồ hình cây dựa trên các chỉ thị di truyền để mô tả mối quan hệ giữa các loài, gọi là cây phát sinh chủng loại hay cây tiến hóa (Phylogenetic tree) Ngoài việc khắc phục được một số hạn chế của phân loại học truyền thống, nó cũng có nhiều ưu điểm khác như: kết quả thí nghiệm thường khách quan, chính xác, không phụ thuộc vào chủ quan của người quan sát như trong phân loại học dựa trên hình thái [25]

Cơ sở phân loại của phương pháp này chủ yếu dựa trên trình tự ADN được xây dựng từ bốn nucleotide là giống nhau ở mọi sinh vật do đó tiện so sánh, nghiên cứu ngay cả ở những sinh vật khác xa nhau [25] Sự sai khác trong các trình tự ADN được xem là kết quả của quá trình tiến hóa phân tử theo thời gian Do vậy, các nhà khoa học xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng việc so sánh các trình tự ADN và phân tích sử dụng các thuật toán xác suất Cây phát sinh chủng loại thể hiện đa dạng

di truyền, mối quan hệ và tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Dựa trên loại thuật toán xác suất được sử dụng để phân tích dữ liệu, người ta chia thành nhiều phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại khác nhau Phân tích phát sinh chủng loại sử dụng trình tự ADN là một phần quan trọng trong các nghiên cứu như: sinh học phân

tử, sinh học phát triển, di truyền học quần thể, tiến hóa và đa dạng sinh học [25] Mỗi cây phát sinh chủng loại thường chỉ là một phần của cây tiến hóa xuất phát

từ một tổ tiên chung Tận cùng của mỗi cây phát sinh chủng loại thường là một hoặc một số taxon Điểm nằm giữa phân nhánh (node) đại diện cho tổ tiên chung của các nhóm loài riêng biệt trước khi phân li tiến hóa Chiều dài mỗi nhánh thể hiện mức

10

độ khác biệt giữa các taxon Các cây tiến hóa có điểm xác định tổ tiên chung gọi là các cây tiến hóa có gốc (root trees), ngược lại, các cây tiến hóa không gốc (unroot trees) chỉ phản ánh mối quan hệ và sự sai khác giữa các taxon Số lượng cây tiến hóa tăng lên cùng với số lượng taxon nghiên cứu (Bảng 2) [1] Cụ thể, số cây phát sinh chủng loại có gốc (NR) và không gốc (NU) tương ứng là:

Số lượng cây không gốc

Số lượng cây có gốc

2.2 Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh

Để xác định được cây loài phát sinh, các dữ liệu ADN thường được phân tích bằng các thuật toán xác suất Hiện nay nhiều dạng thuật toán khác nhau được dùng trong các phần mềm máy tính là cơ sở của nhiều phương pháp xây dựng cây loài phát sinh khác nhau như: ma trận khoảng cách (Distance Matrix), neighbour joining, tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) và Bayesian Trong nghiên này, chúng tôi sử dụng đồng thời 3 phương

2.2.1 Ma trận khoảng cách (Distance matrix)

Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu tiến hóa Trong số đó, thuật toán UPGMA (unweighted pair group with arithmetic mean) phân tích tất cả các dấu hiệu, qua đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp nhóm từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền ngắn nhất Thuật toán này coi tốc độ tiến hóa của các nucleotide là như nhau ở mọi nhánh tiến hóa Tuy nhiên, điều này không phải lúc nào cũng đúng, bởi vì tốc độ tiến hóa tại các vùng gen khác nhau có tốc độ khác nhau phụ thuộc sản phẩm chúng mã hóa và áp lực chọn lọc đối với vùng gen đó [1]

Do vậy, ưu điểm của thuật toán này là có tốc độ phân tích nhanh và đơn giản, UPGMA sẽ phù hợp nhất khi sử dụng với cây tiến hóa có tốc độ tiến hóa ở các nhánh là như nhau Thuật toán này cũng sẽ dùng phù hợp để xử lý một lượng lớn dữ liệu, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài, nhưng không phản ánh được tiến hóa ở mỗi gen [1]

2.2.2 Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony)

Phương pháp này được đề xuất vào năm 1963 bởi Edwards và Cavalli-Sforza [15] Tích phân tiến hóa là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên

hệ dữ liệu là các trình tự ADN, so sánh các vị trí giữa các nucleotide tương ứng trong hệ dữ liệu ADN này Cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi phương pháp này dựa trên nguyên tắc sinh học “đột biến hiếm khi xảy ra” Thuật toán này cho rằng cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có số đột biến thấp nhất trong tất cả các cây có thể tìm được giữa các taxon được phân tích [1 , 34] Thuật toán của tích phân tiến hóa đầu tiên sẽ xác định tất cả các vị trí có giá trị thông tin bằng cách so sánh tất cả các trình tự nucleotide tại mỗi vị trí, rồi từ xác định ra cây cần ít đột biến nhất tại mỗi vị

12

trí Cây phát sinh nào cần ít đột biến nhất khi xét tại tất cả các vị trí được gọi là cây tiến hóa phỏng đoán Đây là cây được cho là gần với cây tiến hóa đúng nhất Với phương pháp này, chúng ta có thể dự đoán tổ tiên của mỗi nhánh tiến hóa Tuy nhiên, tốc độ biến đổi giữa các nucleotide là không như nhau, ví dụ như các đột biến đồng hoán có tỷ lệ xảy ra cao gấp 3 lần các đột biến dị hoán Bởi vậy đôi khi phương pháp tiêt kiệm tối đa có thể không phản ánh đúng về thời điểm xảy ra sự tách ly tiến hóa giữa các loài vì tốc độ tiến hóa của các nucleotide giữa các nhánh là khác nhau [1]

2.2.3 Hợp lý tối đa (Maximum Likelihood)

Phương pháp hợp lý tối đa là một phương pháp xác suất thuần túy Phương pháp này đánh giá một giả thuyết tiến hóa bằng việc xây dựng tất cả cây tiến hóa có thể có dựa trên mô hình tiến hóa và cơ sở dữ liệu đưa vào, rồi từ đó xác định cây có xác suất xảy ra cao nhất Phương pháp này thường được xem là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn các phương pháp khác [1] Tuy nhiên, khi dữ liệu đưa vào lớn thì số cây phát sinh chủng loại thu được sẽ trở nên rất lớn (với số taxa > 30 thì số cây phát sinh chủng loại thu có thể có > 5x1038 [1]) từ đó khiến khả năng tính toán rất chậm Do vậy, phương pháp này bước đầu sẽ chỉ được áp dụng với một số lượng dự liệu nhỏ và với các mẫu có đủ số liệu

từ đấy tính toán ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây

Xác suất hậu nghiệm là xác suất có điều kiện mà cây nhận được khi đưa các mô hình vào, cơ sở dữ liệu Phương pháp Bayesian với MCMC đã được được chấp nhận và sử dụng rộng rãi như là một phương pháp tin cậy trong xây dựng cây phát sinh chủng loại [22]

13

2.3 Phân tích thời gian tiến hóa

Phân tích xác định thời gian phân tách của các nhóm Mang được thực hiện dựa trên phần mềm BEAST Trên thực tế, đây là một gói phần mềm, bao gồm các chương trình BEAST, BEAUti do đó gọi tắt là BEAUti & BEAST Gói phần mềm này sử dụng thuật toán thống kê Bayesian và do đó sẽ cần cung cấp các giá trị tiền nghiệm kết hợp với các thông tin có được từ hệ dữ liệu phân tử Để chạy phân tích, chúng tôi đưa vào hai hệ dữ liệu Hệ dữ liệu thứ nhất là dữ liệu ADN chúng tôi thu được, hệ dữ liệu thứ hai là mốc thời gian phân tách (calibration point ) của loài Mang và các tham số tiền nghiệm (prior) [5] Cả hai hệ dữ liệu này được đưa vào chương trình BEAUti, để từ đó, với phần mềm này chúng tôi lựa chọn các tùy chỉnh phù hợp cho hai hệ dữ liệu trên, cuối cùng sẽ tạo ra file định dạng mà chương trình BEAST có thể hiểu và sử dụng để chạy phân tích [14] Kết quả thu được qua phần mềm BEAST là cây phát sinh chủng loại đi kèm với mốc thời gian phân tách của các nhánh nhờ việc mô phỏng mô hình tốc độ tiến hóa phân tử của các nhánh này trên cây Ở mức độ đơn giản nhất, điều này có thể thống nhất một tỷ lệ về thời gian trên toàn bộ cây phát sinh chủng loại dựa trên các thông tin hiệu chỉnh (calibration)

đã có [14] Do vậy, BEAST là phần mềm đầu tiên cho phép suy luận để xây dựng cây phát sinh chủng loại thể hiện được mô hình đồng hồ phân tử giữa các loài [13]

2.4 Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích

Hiện nay, rất nhiều các chỉ thị phân tử được xác định với các vai trò khác nhau, phụ thuộc các mục đích và đối tượng trong các nghiên cứu Trong đó, hệ gen ty thể,

so với hệ gen nhân, có phương thức sao chép và di truyền khá khác biệt Bởi vậy, tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những sai khác nhất định so với

hệ gen nhân Đồng thời, mỗi loại chỉ thị đều có các ưu điểm và nhược điểm riêng Các gen được lựa chọn vào việc xây dựng cây phát sinh chủng loại tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và thời gian tiến hóa của nhóm loài cần quan tâm Thông thường, những nghiên cứu tập trung vào nhóm loài có thời gian tiến hóa ngắn đòi

14

hỏi cần có những gen có tốc độ tiến hóa nhanh và ngược lại những nhóm loài có thời gian tiến hóa dài cần có những gen có tốc độ tiến hóa chậm hơn [1 , 8]

Hệ gen ty thể ở nhóm thú và người chứa một phân tử ADN (ký hiệu là mtADN)

có dạng sợi kép, mạch vòng, dài khoảng 15000 bp Tỷ lệ đột biến đồng nghĩa của hệ gen ty thể ở người vào khoảng 5,7x10-8 mỗi năm, gấp 10 lần so với đột biến đồng nghĩa trung bình trong vùng mã hóa của gen nhân [1 , 45] Tỉ lệ đột biến khác nghĩa

ở các gen mã hóa protein ở hệ gen ty thể rất khác nhau, nhưng trong mọi trường hợp, tỷ lệ này vẫn cao hơn rất nhiều so với đột biến ở hệ gen nhân Cơ chế dẫn đến mtADN có tốc độ đột biến cao như thế có thể do sai sót trong quá trình sửa chữa mtADN Một lý do khác là áp lực của chọn lọc tự nhiên đối với hệ gen ty thể cao hơn sao với gen nhân, bởi vì mỗi tế bào chứa hàng chục tỷ ty thể và trung bình mỗi

ty thể chứa 2 bản sao mtADN Một khác biệt cơ bản nữa của hệ gen ty thể là gen ty thể nằm ở tế bào chất, di truyền theo dòng mẹ (không xảy ra trao đổi chéo do không giảm phân) Do đó, các đột biến xảy ra trên hệ gen ty hầu hết là đột biến thay thế chứ không phải do tái tổ hợp Với kích thước nhỏ, cùng với tốc độ đột biến thay thế cao, hệ gen ty thể là một công cụ hiệu quả cho nghiên cứu tiến hóa, đa dạng di truyền giữa các loài, và các quần thể [1]

Các vùng gen trong hệ gen ty thể, tùy thuộc vào tốc độ biến đổi khác nhau được sử dụng với các mục đích nghiên cứu khác nhau Ví dụ, với gen cytochrome b

(Cyt-b) đã đươc sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại ở động vật Tốc độ biến đổi của gen Cyt-b phù hợp với mục đích so sánh các loài ở

mức độ giống và họ Kết quả của rất nhiều nghiên cứu phát sinh chủng loại cho

thấy, gen Cyt-b cho các kết quả cây phát sinh chủng loại khá chính xác Xa hơn nữa,

sử dụng gen Cyt-b có thể hỗ trợ việc xác định giống đối với các loài mới [36] Dựa

trên các lý do tương tự, các vùng gen khác như Cytochrome c Oxidase subunit I

(COI), NADH dehydrogenase 4 (ND4) được dùng cho di truyền quần thể, quan hệ

phát sinh chủng loại ở mức độ loài và phân loài của lớp thú [24]

Hệ gen nhân có tốc độ, thời gian biến đổi chậm hơn rất nhiều so với hệ gen ty thể Do đó, hệ gen nhân phù hợp với việc phân tích, làm rõ các nhánh có thời gian

15

tiến hóa lâu hơn Tuy nhiên, hệ gen nhân cũng có các hạn chế nhất định Với các mẫu có tuổi mẫu lớn (các mẫu của chúng tôi có tuổi mẫu xấp xỉ 10 năm kể từ khi mẫu được thu bởi người dân) hay điều kiện bảo quản mẫu không tốt, việc nhân dòng hệ gen nhân gặp khá nhiều khó khăn bởi số lượng bản sao ít hơn rất nhiều so với hệ gen ty thể Ngoài ra, kích thước lớn khiến hệ gen nhân dễ bị biến đổi, phá hủy [1 , 8]

Từ các ưu và nhược điểm riêng của từng loại chỉ thị, chúng tôi lựa chọn sử dung

cả hệ gen ty thể và hệ gen nhân để có thể có được các kết quả tốt nhất Cụ thể, trong

nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn 3 gen ty thể là gen Cytochrome b, ND4 (NADH dehydrogenase subunit 4), gen 16S và 1 gen nhân là gen G-fibrinogen (G-fib)

Ngoài các lý do như đã nêu, chúng tôi lựa chọn các gen trên còn bởi vì các gen này

đã được sử dụng thành công ở các nghiên cứu trên nhóm Mang trước đây Thậm chí, cho đến nay, một số loài Mang chỉ có trình tự duy nhất của 1 gen (Mang

Ghongsang hiện nay chỉ có duy nhất 1 trình tự gen ND4 (AF190678)) Do vậy, khi

lựa chọn các gen kể trên, chúng tôi hi vọng sẽ cho kết quả tốt và có thể kết hợp với các nghiên cứu trước đây nhằm đưa ra các kết luận phù hợp nhất [7 , 36] [23] Với

gen Cyt-b chúng tôi quyết định nhân lên toàn bộ chiều dài đoạn gen này là 1140bp đối với tất cả các mẫu Gen 16S và G-fib có kích thước khoảng 600bp, gen ND4 có

kích thước khoảng 700bp Số lượng chi tiết của các gen được chúng tôi tiến hành giải trình tự và các gen từ GenBank sử dụng cho nghiên cứu được thể hiện ở Bảng

4

16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu nghiên cứu

1.1 Mẫu vật nghiên cứu

Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu bởi các chuyên gia thuộc Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Quy hoạch Lâm Nghiệp Tổng cộng 78 mẫu gồm 43 mẫu xương và 35 mẫu da khô được thu thập tại 12 khu bảo tồn trên cả nước (Hình 4), nơi được ghi nhận là có sự xuất hiện của các loài Mang Thông tin chi tiết về các địa điểm thu mẫu được thể hiện trong Bảng 4

1.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

 Kít tách chiết DNeasy blood and tissue của Qiagen

 Ethanol của Merk

 PCR Mastermix của Fermentas

 Hotstart Taq Mastermix của Qiagen – Đức

 Kit GeneJET PCR Purification – Thermo

 Agarose của Invitrogen

 Tris-Base của Sigma

 Boric axit của Merk

 EDTA của Merk

 Ethidium bromide của Invitrogen

17

 Marker 100bp, 1kb của Fermentas

 Dye 6X của Fermentas

1.3 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR

Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đã được sử dụng và cho kết quả tốt trong các nghiên cứu về nhóm Mang cũng như các nhóm thú khác trong các nghiên

cứu trước Ngoài ra, trình tự mồi cho phản ứng nhân phân đoạn gen ND4 được

chúng tôi tự thiết kế trong nghiên cứu này Các mồi được đặt tại hãng IDT – Mỹ Trình tự các cặp mồi này được thể hiện ở dưới đây (Bảng 3)

Bảng 3 Danh sách và thông tin mồi sử dùng trong nghiên cứu

18

Bảng 4 Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự, cùng tên mẫu, địa điểm thu mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên

cứu Tất các trình tự được nhân lên trong nghiên cứu này đánh dấu “xxxxxx”, các đoạn gen không có trình tự được đánh dấu “-”

Panolia eldi HM138200 HM138200 HM138200 - - - Kong and Li (unpublished)

Elaphodus cephalophus NC008749 NC008749 NC008749 - - - Pang và cộng sự, 2008

Muntiacus crinifrons NC004577 NC004577 NC004577 - - - Li và cộng sự, 2003

Muntiacus crinifrons AY239042 AY239042 AY239042 - - - Li và cộng sự, 2003

Muntiacus putaoensis KJ425280 KJ425299 - KJ425290 M4.1 Myanmar Le và cộng sự, 2014

Muntiacus reevesi EF035447 EF035447 - - - - Wang và cộng sự(unpublished)

Muntiacus reevesi AF527537 AF527537 AF527537 - - - Zhang và cộng sự, 2002

Muntiacus rooseveltorum KJ425278 - KJ425271 - M2.18 KBTTN Xuân Liên Le và cộng sự, 2014

Muntiacus rooseveltorum KJ425279 KJ425298 KJ425272 KJ425289 M2.20 KBTTN Pù Hoạt Le và cộng sự, 2014

Muntiacus rooseveltorum KJ425281 KJ425300 KJ425273 KJ425291 M6.3 KBTTN Pù Hoạt Le và cộng sự, 2014

Muntiacus rooseveltorum KJ425282 KJ425301 KJ425274 KJ425292 M6.4 KBTTN Pù Hoạt Le và cộng sự, 2014

Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - X22 KBTTN Xuân Liên -

Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - X44 KBTTN Xuân Liên -

19

Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - X8 KBTTN Xuân Liên -

Muntiacus rooseveltorum xxxxxx - - - X33 KBTTN Xuân Liên -

Muntiacus truongsonensis AF042718 - - - - - Giao và cộng sự, 1998

Muntiacus truongsonensis xxxxxx - - - M1.2 KBTTN Sông Thanh -

Muntiacus truongsonensis KJ425276 KJ425296 - KJ425287 M1.9 KBTTN Sao La Le và cộng sự, 2014

Muntiacus truongsonensis xxxxxx xxxxxx - - M6.20 KBTTN PNKB -

Muntiacus truongsonensis KJ425277 KJ425297 - KJ425288 M2.4 KBTTN Sao La Le và cộng sự, 2014

Muntiacus truongsonensis xxxxxx - - - M2.7 KBTTN Sao La -

Muntiacus vaginalis NC004563 NC004563 NC004563 - - - Shi và cộng sự (unpublished)

Muntiacus vaginalis JN861030 - - - - - Suresh và cộng sự (unpublished)

Muntiacus vaginalis JN861033 - - - - - Suresh và cộng sự (unpublished)

Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - Mu1.6 KBTTN Sông Thanh -

Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - Mu1.7 KBTTN Sông Thanh -

Muntiacus vaginalis xxxxxx xxxxxx - xxxxxx Mu6.5 KBTTN Pù Hoạt -

20

Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M6.17 KBTTN Ngọc Linh -

Muntiacus vaginalis xxxxxx xxxxxx - xxxxxx M2.10 KBTTN Ngọc Linh -

Muntiacus vaginalis xxxxxx - - - M6.11 KBTTN Kon Chư Răng -

Muntiacus vaginalis xxxxxx xxxxxx - xxxxxx M2.21 KBTTN Pù Hoạt -

Muntiacus vuquangensis NC016920 NC016920 NC016920 - - - Hassanin và cộng sự, 2012

21

Muntiacus vuquangensis KJ425275 KJ425295 - KJ425286 M1.1 KBTTN Dakrong Le và cộng sự, 2014

Muntiacus vuquangensis KJ425293 - - - M6.21 KBTTN Sao La Le và cộng sự, 2014

Muntiacus vuquangensis KJ425283 KJ425302 - KJ425293 M6.9 KBTTN Kon Chư Răng Le và cộng sự, 2014

Muntiacus vuquangensis KJ425284 KJ425303 - KJ425294 M6.13 KBTTN Kon Chư Răng Le và cộng sự, 2014

22

Hình 4 Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu

23

1.4 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:

Các thiết bị chúng tôi sử dụng thuộc phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2 Phương pháp nghiên cứu

Với mục đích thu nhận trình tự các đoạn gen chỉ thị, từ đó sử dụng để phân tích, đánh giá đa dạng di truyền, cũng như tiến hóa của các loài Mang ở Việt Nam, quá trình nghiên cứu của chúng tôi được chia ra gồm 4 bước chính: (1) tách chiết ADN tổng số, (2) khuyếch đại các phân đoạn gen quan tâm bằng phản ứng PCR, (3) tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quan tâm, (4) phân tích đa dạng di truyền dựa trên trình tự thu được bằng phần mềm tin sinh học

2.1 Tách chiết ADN tổng số

Các mẫu của chúng tôi bao gồm các mẫu xương và da khô thu được qua người dân bản địa, do vậy điều kiện bảo quản các mẫu này không tốt, dẫn đến chất lượng ADN tổng số lưu dữ được rất ít, và đứt gãy rất nhiều Ngoài ra, chúng tôi cũng lấy các mẫu bảo tàng được bảo quản trong điều kiện tốt, nhưng tuổi mẫu đã khá cao, (khoảng xấp xỉ vài chục năm) Do vậy, chúng tôi tách chiết ADN tổng số sử dụng

bộ kit Dneasy Blood and tissue, với các quy trình đã mô tả trong nghiên cứu của Lê Đức Minh và cộng sự năm 2013 [3] Quy trình này của chúng tôi đã được tối ưu để nhằm phục vụ tách chiết các mẫu có chất lượng ADN thấp

Đầu tiên, mẫu được tiền xử lý rửa bề mặt bằng phương pháp ngâm trong dung dịch Clorox 10% Bước này giúp loại bỏ các thành phần bề mặt không cần thiết, các loại nấm mốc, vi sinh vật Tiếp đó, mẫu đựơc lấy ra, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, cuối cùng để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, chúng tôi sử dụng bộ kít DNeasy blood and tissues với protocol được chỉnh lý [3] để tách chiết ADN tổng số từ các mẫu xương và da khô đã được làm sạch

24

Mẫu đã khô được chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung 180µl dung dịch đệm ATL và 20µl proteinase K Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong 72 giờ Proteinase K được bổ sung tiếp tục sau mỗi 24 tiếp theo (tổng cộng lượng proteinase K sử dụng là 60µl)

Sau 72 giờ, dung dịch và mẫu được lấy ra khỏi bể ổn nhiệt, vortex nhẹ trước khi

bổ sung 200µl dung dịch đệm AL Hỗn hợp mới này lại tiếp tục được ủ ở 70°C trong 7 phút, sau đó đựơc lấy ra bổ sung thêm 200µl dung dịch Ethanol 100 Dung dịch trong hỗn hợp thu được sẽ chuyển qua cột lọc 2ml, ly tâm với tốc độ 6000 rcf trong 1 phút Cột lọc sau ly tâm được chuyển sang ống 2ml mới Dung dịch sau ly tâm được loại bỏ

Bổ sung 500 µl dung dịch đệm AW1 vào cột lọc mới và ly tâm ở 6000 rcf trong

1 phút

Tương tự bước trên, lần này, cột lọc cũng được chuyển vào ống 2ml mới và loại

bỏ dung dịch sau ly tâm Đồng thời, dung dịch AW2 được bổ sung 500µl vào cột lọc và ly tâm ở 20000 rcf trong 3 phút

Cuối cùng, cột lọc được chuyển sang ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung vào cột lọc 90 µl dung dịch đệm AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Sau đó, ống eppendorf và cột lọc được ly tâm ở 6000 rcf trong 1 phút Lần này, dung dịch thu được chứa ADN tổng số nên được giữ lại trong ống eppendorf và bảo quản ở âm 4°C

2.2 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR sử dụng máy PCR Systerm 9700, với tổng thể tích một phản ứng

là 20µl bao gồm 10µl HotstarTaq mastermix (Qiagen, Đức), 5µl nước, 2µl mồi mỗi chiều xuôi và chiều ngược, 1µl ADN khuôn (Bảng 5)

25

Điều kiện phản ứng PCR cụ thể : 95C trong 15 phút để hoạt hoá loại Taq polymerase này, 40 chu kỳ gồm; 95C trong 30 giây, 45C trong 45 giây, 72C trong 60 giây, và bước kéo dài cuối cùng trong 6 phút

Chúng tôi sử dụng HotStar Taq là loại Taq polymerase hiệu quả trong việc nhân

gen với nồng độ ADN khuôn thấp, và có tính đặc hiệu cao Đối với các mẫu có nồng độ ADN quá thấp, chúng tôi tiến hành thêm phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng ADN khuôn là sản phẩm PCR lần thứ nhất Lần PCR thứ hai, chúng tôi sử

dụng Taq polymerase (Fermentas) Với loại Taq polymerase chúng tôi thực hiện

phản ứng với các điều kiện tương tự như với HotStar Taq, ngoại trừ thời gian hoạt

hoá cho Taq Polymerase là 95C trong 5 phút (Bảng 6)

Bảng 5 Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích

5 Taq Master mix 10 µl

Bảng 6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bước Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút) Chu kỳ (vòng)

Taq polymerase: 5

1 Hot Start Taq: 15

26

2.3 Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen

Sản phẩm sau khi tách chiết ADN tổng số và sau phản ứng PCR đều được tiến hành điện di trên gel Agarose 1% để xác định sự có mặt của phân tử ADN Với ADN tổng số, điện di sử dụng gel Agarose 1%, chạy trong môi trường đệm TBE 1X (Tris base, axit Boric, EDTA, H2O), marker 1kb Điện di sản phẩm PCR sử dụng gel Agarose, chạy trong môi trường đệm TBE 1X, marker 100bp

Các sản phẩm PCR thành công (xác định nhờ điện di) được tiến hành tinh sạch bằng bộ kit sạch sản phẩm PCR của Thermo trước khi gửi giải trình tự hai chiều tại FirstBase - Malaysia Các bước tinh sạch cụ thể như sau:

Bước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:1 của Buffer Binding vào hỗn hợp PCR

để được một dung dịch hoàn chỉnh (ví dụ cho mỗi 100µl của hỗn hợp phản ứng, thêm 100µl Buffer Binding) Trộn kỹ và đều hỗn hợp dung dịch Kiểm tra màu sắc của dung dịch: màu vàng thể hiện pH tối ưu cho việc cố định ADN Nếu màu sắc của dung dịch có màu cam hoặc tím, thêm 10µl dung dịch acetate 3M, pH 5.2 và trộn đều, màu sắc của hỗn hợp sẽ trở thành màu vàng

Bước 2: Chuyển tối đa 800µl dung dịch từ bước 1 vào cột GeneJET ™ Ly tâm 30-60s Loại bỏ các dung dịch thông qua cột Lưu ý: nếu tổng khối lượng vượt quá 800µl, dung dịch có thể được thêm vào các cột thành từng giai đoạn Sau khi bổ sung 800µl dung dịch, ly tâm cột 30-60s và loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc Lặp lại cho đến khi toàn bộ dung dịch đã được thêm vào màng cột

Bước 3: Thêm 700µl Wash Buffer (đã được thêm Ethanol) vào cột lọc GeneJET ™ Ly tâm 30-60s Loại bỏ dung dịch chảy qua cột lọc và đặt các cột lọc trở lại vào ống thu

27

Bước 4: Ly tâm cột GeneJET ™ thêm 1 phút để hoàn toàn loại bỏ phần đệm rửa còn sót lại Lưu ý: bước này là điều cần thiết vì đệm rửa còn sót lại trong mẫu DNA có thể ức chế các phản ứng sau đó

Bước 5: Chuyển cột GeneJET ™ tới một ống 1,5 ml sạch (không kèm theo trong bộ kit) Thêm 50µl Elution buffer đến trung tâm màng của cột GeneJET ™ và ly tâm trong 1 phút

Kết quả giải trình tư hai chiều nhận được sẽ được đối chiếu với nhau để nhận được 1 trình tự duy nhất dựa trên phần mềm Geneious ver 8.0 Trình tự thu được sẽ được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) nhằm đảm bảo tính xác thực qua công cụ Blast

2.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa

Với các trình tự gen thu được, chúng tôi tiến hành sắp xếp thẳng hàng cùng với các đoạn gen chuẩn lấy từ ngân hàng gen bằng phần mềm BioEdit v5 để xây dựng dữ liệu để tiến hành phân tích cây phát sinh chủng loại Cơ sở dữ liệu của chúng tôi bao gồm:

- Nhóm ngoài (out group): Trình tự gen của hai loài Panolia eldii và

Elaphodus cephalophus được chúng tôi sử dụng làm nhóm ngoài Hai loài trên có

quan hệ khá gần gũi với nhóm Mang Trong đó Elaphodus cephalophus thuộc cùng

tông Muntiacini cùng với nhóm Mang Đồng thời, 2 loài trên cũng được sử dụng rất nhiều làm nhóm ngoài trong các nghiên cứu trước về nhóm Mang [6 , 7 , 36]

- Nhóm trong (in group): 45 trình tự có được từ ngân hàng gen của 9 loài

Mang (loài Mang M antherodes, M montanus và M muntjak hiện nay chưa có dữ

liệu gen); và 86 trình tự của 5 loài Mang thu được qua nghiên cứu này

Sau đó, các dữ liệu về gen được sắp xếp thẳng hàng và đưa vào tập tin định dạng nexus (.nex) để từ đó có thể đưa vào các phần mềm tin sinh và tiến hành phân tích Thông tin về các cơ sở dữ liệu các gen chi tiết ở Bảng 4 Tập tin chứa cơ sở dữ liệu về gen này được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên 3

28

phương pháp: phương pháp Tiết kiệm tối đa (MP) và phương pháp Hợp lý tối đa (ML) có trong phần mềm PAUP ver 4 beta 10 [39], phương pháp Bayesian có trong phần mềm Mr.Bayes (ver 3.4) [22] Việc sử dụng cả ba phương pháp cho phép chúng tôi so sánh và đối chiếu các kết quả thu được nhằm đưa ra các kết luận đáng tin cậy cho nghiên cứu

2.4.1 Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony – MP)

Sử dụng phần mềm PAUP ver 4b10, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tiết kiệm tối đa với các tùy chỉnh bước đầu với 100 taxa ngẫu nhiên lặp lại nhờ thuật toán phân cắt và nối chéo các nhánh của cây phân tích (Tree-bisection and reconnection - TBR), không chọn giới hạn trên cho số cây được ghi nhớ Đánh giá khả năng xảy ra của các nhánh, phân tích với chỉ số tin cậy bootstrap (BP) được áp dụng là 1000 vòng lặp [18 , 27 , 29] Chúng tôi chạy phần mềm PAUP với phương pháp tiết kiệm tối đa sử dụng dữ liệu kết hợp của cả 4 gen chỉ thị Giá trị độ tin cậy của nhánh tiến hóa sau phân tích được coi là có độ tin cậy cao khi đạt giá trị lớn hơn 70% và được coi là thấp khi nhỏ hơn 70% [21]

2.4.2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp hợp lý tối đa (Maximum Likelihood - ML)

Với phương pháp ML, để xác định mô hình tiến hóa phù hợp, chúng tôi sử dụng phần mềm Modeltest v3.7 [37] Dữ liệu đầu vào cho phần mềm này là file định dạng nex, chúng tôi đã sử dụng để tiến hành phân tích MP Sau khi có được mô hình tiến hóa, chúng tôi tiến hành xây dựng file định dạng nex cho phân tích ML dựa trên cơ sở là dữ liệu ADN tương tự như với phân tích MP, các tùy chỉnh, câu lệnh mặc định dựa theo hướng dẫn của phần mềm PAUP

Phân tích ML được thực hiện nhờ phần mềm PAUP Phân tích ban đầu được tiến hành với các tùy chỉnh cụ thể: cây cộng thêm theo từng bước, với một taxon được thêm vào mỗi vòng lặp (simple taxon addition) và sử dụng thuật toán hoán đổi nhánh (TBR) Để đánh giá độ tin cậy (BP) của nhánh, phân tích bootstrap được lặp