TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

TP HỒ CHÍ MINH, ngày 11/12/2011

MỤC LỤC

1 KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH 5

2 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 6

2.1 Tổng quan 6

2.1.1 Lĩnh vực áp dụng 6

2.1.2 Ưu điểm và hạn chế 6

2.2 Nguyên tắc chung 6

2.3 Định lượng nitơ tổng 8

2.3.1 Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte) 8

2.3.2 Cất đạm (trong máy cất đạm) 8

2.3.3 Chuẩn độ 8

2.4 Định lượng nitơ phi protein 9

3 PHƯƠNG PHÁP BIURET 9

3.1 Nguyên tắc chung 9

3.2 Ưu điểm và hạn chế 10

3.3 Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol 10

3.4 Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp của TCA 10

3.5 Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu lipid 10

3.6 Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử 10

3.7 Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA 10

4 PHƯƠNG PHÁP LOWRY 11

4.1 Nguyên tắc chung 11

4.2 Ưu điểm và hạn chế 11

5 PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) 12

5.1 Nguyên tắc chung 12

5.2 Phương pháp Bradford 12

5.2.1 Nguyên tắc 12

5.3 Phương pháp Udy 13

5.3.1 Nguyên tắc 13

5.4 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm 13

6 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS-SPECTROPHOTOMETRIC) 13

6.1 Nguyên tắc 13

6.2 Ưu điểm và hạn chế 13

7 PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET ABSORPTION) 14

7.1 Nguyên tắc chung 14

7.2 Ưu điểm và hạn chế 14

7.3 Lĩnh vực áp dụng 14

8 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) 15

8.1 Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography) 15

8.1.1 Nguyên tắc 15

8.1.2 Các bước tiến hành tổng quát 16

8.1.3 Ưu điểm và hạn chế 16

8.2 Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) 17

8.2.1 Nguyên tắc 17

8.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid

Chromatography – HPLC) 18

8.3.1 Nguyên lí 18

8.3.2 Ưu điểm và hạn chế 19

8.4 Phương pháp sắc ký ái lực – hấp phụ (Affinity Chromatography) 19

8.4.1 Nguyên tắc 19

9 PHƯƠNG PHÁP DUMAS 20

9.1 Nguyên tắc 20

9.2 Ưu điểm và hạn chế 20

Tài liệu tham khảo 20

Danh mục hình

Hình 1.phức hợp protein-đồng 9

Hình 2 đo cường độ màu sắc ở 540 nm 9

Hình 3 đo cường độ màu ở 750 nm 11

Hình 4 phản ứng nhuộm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250 13

Hình 5 cột sắc ký lọc gel 15

Hình 6 sắc ký trao đổi ion 17

Hình 7 tương tác của protein với pha tĩnh và pha động 18

Hình 8 veggies cap 20

Hình 9 quy trình của Phương Pháp Dumas 20

1 KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH

Để hạn chế những biến đổi có thể xảy ra đối với protein, mẫu nên được thu nhận nhanh nhất có thể và đặt ngay vào môi trường cách ly ở nhiệt độ thấp (từ 0 đến

4oC) Điều này là tối quan trọng, đặc biệt khi protein được cách li để tiến hành các phân tích sâu hơn (ví dụ như điện di), môi trường cách ly bao gồm những chất ngăn ngừa sự tạp nhiễm của vi khuẩn (VD: 0,1 mM sodium azide), bảo vệ protein khỏi những chất tạo phức (VD: Cu, …) như (VD: Ethylenediaminetetraacetic acid

2 mM), ngăn chặn các thoái hóa protein do các protease nội sinh (VD: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM)

Protein cần được phân riêng và tinh chế, nhằm múc đích tách riêng biệt protein, ở dạng đồng nhất hoặc một nhóm protein phù hợp cho quá trình phân tích sâu hơn,

từ nguyên liệu ban đầu Có nhiều biện pháp phân riêng và tinh chế protein, cụ thể như:

o Chiết (Etraction)

o Deproteination

o Lọc (Filtration)

o Ly tâm (Centrifugation)

o Kết tủa bằng muối (Salting-Out)

o Thẩm tách và thẩm tách điện (Dialysis & Electrodialysis)

o Lọc bằng phương pháp sắc ký

2 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

- Sai số không vượt quá 1%

- Khả năng lặp lại kết quả tốt

- Dễ thao tác

- Phân tích được tất cả các loại protein thực phẩm

2.1.2.2 Hạn chế

- Yêu cầu lượng mẫu lớn

- Thời gian phân tích dài

- Độ phân giải thấp do tính chọn lọc không cao

2.2 Nguyên tắc chung

Sự khác biệt chủ yếu giữ các phương pháp Kjeldahl là chất xúc tác được sử dụng trong quá trình vô cơ hóa mẫu, kỹ thuật cất đạm và chuẩn độ Tuy có sự khác nhau nhưng chung nhất phương pháp Kjeldahl bao gồm năm bước:

a) Chuẩn bị mẫu và cân mẫu b) Bổ sung chất phản ứng c) Vô cơ hóa mẫu

d) Cất đạm e) Chuẩn độ Khối lượng mẫu được lấy có thể biến động từ 0,2 đến 2,0g, phụ thuộc vào lượng protein trong mẫu đem kiểm nghiệm Đối với mẫu lượng protein nằm trong khoảng 5 – 25%, lượng mẫu tối ưu cần lấy là 0,5 – 1,0g

Trong quá trình tiến hành cần thêm vào mẫu 3 nhóm chất với các chức năng khác nhau trong quá trình vô cơ hóa mẫu:

a) Sulfuric acid: tác nhân oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2, H2O, bẻ gãy và chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ thành khí NH3 tự do, sau đó liên kết với NH3 tạo thành muối (NH4)2SO4

b) Muối (K2SO4, Na2SO4): cần thiết cho quá trình nâng cao nhiệt độ trong quá trình vô cơ hóa

c) Các chất xúc tác đẩy nhanh quá trình oxy hóa: bao gồm các kim loại: Hg,

Cu, Se; oxide: CuO, HgO, P2O5, TiO2; peroxide: Hg2O2; muối: CuSO4,

Hg2SO4

Thủy ngân và oxide thủy ngân là chất xúc tác oxy hóa hiệu quả nhất tuy nhiên, có thể gây ô nhiễm môi trường, nguy hiểm cho người và đặc biệt có thể tạo phức hợp với NH3, gây khó khăn cho quá trình cất đạm sau này Để phân tách các phức hợp amoniac – thủy ngân, cũng như nitrate và nitrite, dung dịch natri thiosulfate và salicylic được thêm vào Tuy khả năng xúc tác kém hơn, và quá trình vô cơ hóa mẫu chậm hơn so với thủy ngân nhưng đồng thân thiện với môi trường nên chúng được sử dụng nhiều hơn (đã được phê duyệt bởi ISO và AOAC) Hiệu quả nhất và thân thiện với môi trường là xúc tác CuSO4 Qua trình vô cơ hóa mẫu được sử dụng để chuyển hóa nitơ trong hợp chất hữu cơ thành ion amoni Sự có mặt của sulfuric acid làm hạn chế nhiệt độ vô

cơ hóa (nhiệt độ sôi của sulfuric acid là 338oC, do đó muối K2SO4 hoặc

Na2SO4 được thêm vào nhằm tăng điểm sôi của hỗn hợp, giảm thời gian phân hủy các hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện phân hủy những hợp chất khó vô cơ hóa Nhiệt độ sôi của hỗn hợp tăng gần như tuyến tính với tỷ lệ K2SO4/H2SO4

(g/mL), đạt 383oC vơi tỷ lệ 1:1, ở tỷ lệ 2:1 nhiệt độ đạt 450oC K2SO4 không chỉ được thêm vào để tăng nhiệt độ sôi hỗn hợp mà còn hấp thu bớt lượng

H2SO4 để tạo thành KHSO4

Trong thực phẩm còn bào gồm các hợp chất kháng vô cơ hóa như nitrate, nitrite, alkaloid, pyridine, chinoline derivative, triazole, pyrazolone, aminopyrine và antipyrine Để quá trình vô cơ hóa dễ dàng hơn, ta cần bổ sung các chất như crom, kẽm, sắt (IV) sulfate, salicylic acid và đường sucrose Những mẫu có chất béo với protein sẽ khó vô cơ hóa và dễ tạo bọt hơn so với các mẫu giàu protein, carbohydrate Để ngăn chặn sự tạo bọt boiling rod hoăc chip được sử dụng, thêm một vài giọt hydrogen peroxide hoặc octanol, hoặc dùng chất tạo nhũ đặc biệt chống tạo bọt Trong điều kiện bình thường, chất chống tạo bọt có thể được bỏ qua khi áp dụng làm nóng hai giai đoạn Ở giai đoạn đầu, mẫu được đốt thành tro, phải tiến hành cẩn thận nâng nhiệt mẫu lên đến 200oC Giai đoạn hai, nâng nhiệt mẫu đến 420oC, bao gồm cả thời gian

cần thiết để mẫu được vô cơ hoàn toàn Sau khi khoáng hóa hoàn thành, phải

làm lạnh nhiệt độ mẫu đến nhiệt độ phòng

Theo nguyên tắc, protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng

và nitơ phi protein, từ đó tính được nitơ của protein Định lượng được nitơ protein ta

nhân kết quả này với một hệ số nhất định (VD: 6,25 vì hàm lượng Nitơ trong protein

2.3.1 Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte)

 Ở nhiệt độ cao, dưới tác dụng của H2SO4 các hợp chất chứa nitơ bị phân hủy và bị

oxy hóa thành CO2, H2O, và NH3 NH3 kết hợp H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4

2.3.2 Cất đạm (trong máy cất đạm)

 Đuổi NH3 ra khỏi muối bằng dung dịch NaOH

 (NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O

 Lượng NH3 được lôi cuốn bằng máy Parmas, sau đó được dẫn đến erlen có chứa sẵn

lượng thừa H2SO4 đã xác định chính xác nồng độ NH3 sẽ kết hợp H2SO4 tạo thành

2.4 Định lượng nitơ phi protein

 Nguyên tắc tiến hành

 Dùng dung môi chiết rút tất cả các dạng nitơ phi protein

 Do trong dịch chiết vẫn còn lẫn vài loại protein, vì vậy ta cần dùng chất kết tủa

protein hòa tan trong quá trình chiết rút

 Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách nhưng phổ biến nhất ta dùng TCA 10%, Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% trong hỗn hợp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1

 Phương pháp Biuret dựa trên sự hình thành phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại

ở bước sống 540nm của đồng và liên kết amide trong dung dịch kiềm mạnh Cường

độ màu tỷ lệ thuận với số liên kết peptide trong chuỗi

Hình 1.phức hợp protein-đồng

Hình 2 đo cường độ màu sắc ở 540 nm

 Phản ứng Biuret trải qua một số CẢI BIẾN sau

3.3 Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol

Các thiol (β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, glutathione) có thể được ngăn chặn trong hầu hết các trường hợp bằng cách thêm vào các chất phản ứng Biuret là các chalate với EDTA Tuy nhiên nếu mẫu có dithiothreitol (DTT), ta cần thêm vào iodoacetamide trước khi thêm các chất phản ứng

3.4 Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp của TCA

Phương pháp này dựa trên việc kết tủa protein bằng cách thêm vào trichloacetic (nồng độ 5 – 25%) tùy thuộc vào thành phần protein, phân tách kết tủa ra khỏi dịch mẫu bằng phương pháp lọc, giải kết tủa bằng dung dịch muối hoặc KOH, xác định protein với phản ứng Biuret

3.5 Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu lipid

Mẫu với tỷ lệ lipid/protein hoặc phospholipid/protein cao có độ đục cao sẽ khó tiến hành xác định so màu Vì vậy trước khi tiến hành phản ứng so màu cần phải tách lipid ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp trích ly (VD: acetone:petroleum ether 1:1) Mẫu không chứa lipid sẽ được hòa tan vào muối natri deoxycholate 10% hoặc NaOH Sau đó xử lí mẫu với các chất phản ứng Biuret

3.6 Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử

Đường khử có khả năng làm gây trở ngại phản ứng Biuret Do đó, H2O2 được thêm vào để oxy hóa đường khử Ngoài ra, tăng thêm 10 lần nồng độ của chất phản ứng Biuret

3.7 Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA

Độ hấp thu tia cực tím của phức hợp Protein – đồng trong dung dịch đồng sulfate nhạy gấp 10 – 15 lần so với phản ứng Biuret tiêu chuẩn Có thể định lượng được xác định được protein trong dung dịch rất loãng (0,01 – 0,1 mg/mL) Ellman (1962), đề xuất phương án đo độ hấp thu của phức hợp protein – đồng ở 263nm, sử dụng đồng sulfate 0,04% và dung dịch NaOH 2N sự lựa chọn bước

sóng trong trường hợp mẫu protein có chứa DNA bị giới hạn, do khả năng hấp thu cao của DNA Và do đó, Itzhaki và Gill (1964) phát triển thủ tục dựa trên đo

độ hấp thu ở 310 nm, nó an toàn khi sử dụng với mẫu ngay cả khi nồng độ DNA đạt 0,7 mg/mL trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng

4 PHƯƠNG PHÁP LOWRY

4.1 Nguyên tắc chung

Phương pháp được phát triển bởi Lowry (1951) dựa trên cơ sở phản ứng màu của thuốc thử Folin-Ciocalteau với liên kết peptide trong protein, peptide và các acid amin thơm (tyrosine, tryptophan,histidine) trong môi trường kiềm thích hợp

Phản ứng tiến hành qua hai giai đoạn cơ bản:

a) Phản ứng Biuret: ion đồng (Cu2+) sẽ tạo phức với protein có ít nhất hai liên

kết peptide

b) Khử phosphomolybdic acid (thuốc thử Folin): khử Folin bởi phực hợp

protein đồng thành molybdenum blue có độ hấp thu cực đại ở 750 nm

Hình 3 đo cường độ màu ở 750 nm

Thuốc thử Folin-Ciocalteau có phản ứng với một số chất hóa học khác như amino acid tự do, các hợp chất thiol, saccharide, lipid, fatty acid, các amin, EDTA,… đây là nguyên nhân gây nhiễu cho quá trình định lượng bằng phương pháp Lowry Để loại bỏ hoặc hạn chế tác động của những chất gây nhiễu trên, kỹ thuật phải trải qua các quá trình bổ sung bao gồm: nâng nhiệt trước và sau khi cho thuốc thử Folin, thêm perhydrate, chloramine-T, SDS, trích với dung môi hữu cơ

để loại bỏ lipid

4.2 Ưu điểm và hạn chế

Ưu điểm: độ nhạy rất cao (gấp 100 lần so với Biuret và gấp 10 lần so với đo

quang phổ)

Hạn chế: dễ bị nhiễu và không thể xác định các protein trong phân tử không

chứa vòng thơm

5 PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING)

Kỹ thuật này được khuyến nghị chủ yếu dùng cho phân tích protein sữa và để phân tích định kỳ các sản phẩm thực phẩm có hàm lượng protein rất thấp như: bia, rượu vang, nước ép rau quả, …

5.1 Nguyên tắc chung

Cơ sở của phương pháp, khi phản ứng, trong điều kiện cụ thể, với thuốc nhuộm có chứa nhóm sulfunic acid (– SO3H), các nhóm chức năng đặt biệt là các nhóm cơ bản trong các chuỗi bên của arginine, lysine, histidine tạo màu trong dung dịch thuốc nhuộm, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong thực phẩm Thuốc nhuộm hữu cơ liên kết với protein bằng các liên kết ion, tĩnh điện, hoặc cả van der Waals Phản ứng này tối ưu trong môi trường acid mạnh, tạo ra các phức tan hoặc không tan Vì vậy nồng độ protein có thể dễ dàng xác định thông qua đo cường độ màu của dung dịch thuốc nhuộm trước và sau khi thêm protein, hoặc sau khi tách riêng phức hợp protein-thuốc nhuộm không tan bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm Một số thuốc nhuộm như: Amido Black 10B, Coomassie Brilliant Blue G-250, Orange G, and Acid Orange 12 được sử dụng phổ biến trong phân tích thực phẩm Trong đó hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tích hàm lượng protein trong thực phẩm là Bradford và Udy

5.2 Phương pháp Bradford

5.2.1 Nguyên tắc

Được phát triển bởi Bradford (1976), thuốc nhuộm được sử dụng là Coomassie Brilliant Blue G-250 tạo phức với protein trong môi trường kiềm yếu Có thể tạo kết tủa ở nhiệt độ thấp (0oC) hoặc sử dụng TCA ở nhiệt độ phòng, hay dùng muối calci phosphate để đông tụ protein

Hình 4 phản ứng nhuôm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250

5.3 Phương pháp Udy

5.3.1 Nguyên tắc

Được phát triển bởi Udy (1971), thuốc nhuộm được dùng là Acid Orange 12 để kết tủa phức protein – thuốc nhuộm

5.4 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm

Ưu điểm: phương pháp này nhanh và đơn giản, thuận tiện cho việc sử dụng

thường xuyên, rất nhạy (nhạy lơn Lowry 2 – 3 lần), ít tốn kém Màu thường phát triển chưa đến 5 phút và bền trong 0,5 – 1 h Ít bị nhiễu bởi các muối, chất đệm

và chất khử như đối với phương pháp Lowry Không cần phải thao tác khéo léo

cũng như sử dụng các hóa chất ăn mòn như phương pháp Kjeldahl

Hạn chế: do mỗi loại thuốc nhuộm có ái lực khác nhau đối với một số protein

tinh khiết sẽ phản ứng và liên kết khác nhau, tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Hầu như phương pháp phải được điều chỉnh với từng loại protein cho mỗi lần áp dụng Do đó phương pháp không được áp dụng để định lượng protein tổng trong

các kiểm nghiệm tổng quát

6 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS-SPECTROPHOTOMETRIC)

6.1 Nguyên tắc

TNBS (2,4,6-trinitrobenzene 1-sulfonic acid) chỉ phản ứng với nhóm amino đầu tiên của amino acid, peptide và protein trong điều kiện kiềm nhẹ (pH 8 đến 9) phản ứng kết thúc bởi sự giảm pH

6.2 Ưu điểm và hạn chế

Độ nhạy cao hơn vài lần so với phương pháp hấp thu tia cực tím, ưu điểm chính là có tính cụ thể cao, ít bị ảnh hưởng bởi các chất gây nhiễu