Tieu Luan Phan tich thuc pham AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Tiểu luận Phân tích thực phẩm đề tài: AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH giúp sinh viên có hiểu biết tổng quan về Aflatoxin và E.Coli trong thực phẩm, tác hại đến sức khỏe và các phân tích chúng.

TIỂU LUẬN MÔN HỌC PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ

◊…….◊

NỘI DUNG

1 Tổng quan về Aflatoxin và phương pháp phân tích

2 Tổng quan về E.Colivà phương pháp phân tích

1 Tổng quan về Aflatoxin và phương pháp phân tích

1 1 Tổng quan về Aflatoxin

1.2 Các phương pháp xác định Aflatoxin

1.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng

1.4 phương pháp Elisa

1.1 Tổng quan về Aflatoxin

Khái niệm, tính chất

Độc tính Các thực phẩm chứa Aflatoxin

Giới hạn cho phép

 Aflatoxin là một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus,

 Giữa 4 loại trên thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản

và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất

Khái niệm, công thức cấu tạo

Hình AFB1 và AFB2 Hình AFG1 và AFG2

Khái niệm, công thức cấu tạo

 Độc tính của aflatoxin cao gấp 10 lần HCN và gấp 68 lần Arsen

 Gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg)

 Phá huỷ tế bào gan, thận và các bộ phận sống còn khác

 Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch

 Ăn mòn thành ruột và dạ dày

 Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết, gây ra ung thư cho gia súc, gia cầm.Và nếu con người ăn thịt chứa aflatoxin thì có thể bị ung thư gan

Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư

Hình Bệnh ung thư gan

Độc tính

Thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin

Hàm lƣợng

(ppm) Tiêu chí

20 Ngô và các loại hạt cho vật

nuôi chưa trưởng thành

100 Ngô và các loại hạt cho giống

vật nuôi đã trưởng thành

200 Ngô và các loại hạt dùng cho

lợn thịt từ 100 pound trở lên

300 Ngô và các loại hạt cho bò

giai đoạn cuối

FDA đƣa ra giới hạn tối đa Bộ Y tế Việt Nam

ML (g/kg) Tiêu chí

Giới hạn cho phép

1.2 Các phương pháp phân tích Aflatoxin

Nguyên tắc

Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích

Công thức tính Aflatoxin Lưu ý

Phương pháp sắc ký bản mỏng phân tích Aflatoxin

Mẫu sau khi xử lý sẽ được đưa qua cột sắc ký, cột được nhồi bằng các gel kháng thể

Khi mẫu đi qua cột, các gel kháng thể sẽ làm nhiệm vụ hấp phụ các vi nấm Aflatoxin

Sau đó, chúng ta rửa cột bằng nước cất để loại bỏ các chất còn lại và giải hấp Aflatoxin bằng dung môi methanol

Tiến hành định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc

 Methanol HPLC grade chiết mẫu

 Aflatoxin chuẩn B1 trong Benzen

- Acetonitrit (98:2)

 Dung dịch triển khai: Cloroform – Aceton (9:1)

 Nước cất

Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu

Mẫu đã

nghiền

Trộn đều 25g mẫu 125ml MeOH 70%

Bình định mức

Lắc đều Để yên 15p-20p Lọc

Lấy 15ml pha loãng 1/3 nước Lọc và lấy 15ml phân tích 5g NaCl

Quy trình phân tích Qua cột sắc ký

H 2 O vào đầy cột

Tránh tạo bọt khí

20 ml PSB để rửa Dịch lọc qua cột (tốc độ 1 giọt)

20ml dd chiết mẫu đã lọc

Bơm 2-3 ml không khí qua cột

để khô, tháo cột và lau cột

1ml MeOH rửa giải, hứng dd Lấy 15 ml dd

Dung dịch

mẫu

Dd mẫu

Quy trình phân tích Qua cột sắc ký

Hình Minh hoạ cột

Quy trình phân tích Định lƣợng

Làm khô dd giải hấp bằng khí N 2 ở 40-50 o C

Hoà tan cặn bằng Benzen-acetonitril (98:2)

Chấm mẫu và chuẩn

trên giấy silicagen

Cho vào hệ dung môi, đậy nấp

Lấy bản ra Làm khô

Soi đèn UV 365nm

Kết quả

Clorofom-aceton (9:1)

Khoảng 30 phút

X: Thể tích có độ sáng bằng S l chuẩn

W: Số gam mẫu đi qua cột (1g)

Nồng độ của Aflatoxin B1 là

Lưu ý

 Chấm trong tủ hút để dung môi bay nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoàng 1mm/chấm,\

 Đeo găng tay khi làm thí nghiệm

 Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước Javen 10 %

 Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa

Nguyên tắc

Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích

Công thức tính Aflatoxin Lưu ý

Phương pháp Elisa phân tích Aflatoxin

Phương pháp này kết hợp của kháng thể và kháng nguyên Kháng thể kháng Aflatoxin được phủ lên bề mặt các giếng nhựa thử

Aflatoxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với Aflatoxin có gắn enzyme Tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ có màu Càng nhiều Aflatoxin trong mẫu thì càng ít Aflatoxin có gắn enzyme bám vào kháng thể

Như vậy, màu sẽ đậm khi có ít Aflatoxin và màu nhạt khi có nhiều Aflatoxin

Bằng phương pháp đo màu trên máy Elisa có thể xác định được hàm lượng Aflatoxin

Nguyên tắc

• Các thành phần của bộ kit Elisa

để kiểm tra Aflatoxin

Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu

Mẫu đã

nghiền

Trộn đều 5g mẫu 25 ml MeOH 60%

Bình định mức

Lắc đều Để yên 15p-20p Lọc

Lấy 15ml phân

tích

Quy trình phân tích Phân tích mẫu

50 ml MeOH

50 ml chuẩn 50 ml mẫu 50 ml MeOH

Tiến hành song song

Các giếng mẫu (không phải Erlen, hình minh họa)

Để yên 10p Cho vào chậu nước Javen 5% Đập khăn giấy

Rửa lại 5 lần bằng dd rửa Phân tích

 = 450 nm

Công thức tính toán

Màu đậm  Aflatoxin ít

Màu nhạt  Aflatoxin nhiều

Tính độ ức chế màu theo công thức:

% Ứ𝑐 𝑐ℎế = 1 − 𝐴1

𝐴0 100

A1: là mật độ quang A của mẫu

A0: Là mật độ quang A của chuẩn

Dựa vào % ức chế màu của mẫu và đồ thị Aflatoxin của chuẩn tính được nồng độ Aflatoxin của mẫu

Nồng độ Aflatoxin trong mẫu = 5 Nồng độ Aflatoxin trong giếng

Lưu ý

 Chấm trong tủ hút để dung môi bay nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoàng 1mm/chấm,\

 Đeo găng tay khi làm thí nghiệm

 Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước Javen 10 %

 Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa

2 Tổng quan về E.coli và phương pháp phân tích

2 1 Tổng quan về E.Coli

2.2 Các phương pháp xác định E.Coli

2.3 Phương pháp đếm lạc khuẩn

2.1 Tổng quan về E.Coli

Khái niệm, tính chất

Độc tính

Các thực phẩm chứa E.Coli

Vi khuẩn E.coli (Escherichia coli) thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng

Khái niệm

Hình Vi khuẩn E.Coli Hình Vi khuẩn E.Coli biến chứng mới

Vi khuẩn E.Coli được chia thành 5 nhóm với các tác hại như sau:

• Enteroaggregative (EAggEC): ST là vi khuẩn bền nhiệt

• Enterohemorrhagic (EHEC): Gây bệnh chảy máu ruột, tiêu chảy

• Enteroinvasive (EIEC): Gây sốt, nôn mửa, co rút cơ bắp

• Enteropathoaenic (EPEC): Nội độc tố

• Enterotoxigenic (ETEC): Độc, tiêu chảy, lây nhiễm

Như vậy, khi E.Coli xâm nhập vào cơ thể với hàm lượng đủ lớn sẽ gây

ra các bệnh về đường ruột

Độc tính

Thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin

1.2 Các phương pháp phân tíchE.Coli

•Phương pháp đếm lạc khuẩn

• Phương pháp MNR

Nguyên tắc

Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích

Công thức tính Aflatoxin Lưu ý

Phương pháp đếm lạc khuẩn xác định E.Coli

Mẫu đã đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định trong môi trường thạch thích hợp có chứa Lactozo

Môi trường có chứa Natri sunfit và fucshin có khả năng ức chế

• Môi trường EMB

• Môi trường Endol

• Môi trường Istatri

• Thuốc thử Indol Các hóa chất phải được pha chế trước, khử trùng, bảo quản lạnh

Quy trình phân tích

Nuôi ủ 370C, 24h

Khẳng định E.coli

Kiểm tra hình thái

Nhuộm gram, soi kính xác

Quan sát

Cấy(Clark Lubs)

Nuôi ủ 370C, 24h Cấy(MT: Trypton)

Nuôi ủ 440C, 36h

Quy trình phân tích

Kết quả

• Phản ứng Indol: sau khi thêm thuốc thử Indol, để yên 1 phút

Kết quả dương tính là màu đỏ

• Phản ứng MR: sau khi thêm MR Kết quả dương tính là có màu

đỏ ngay khi cho vào

• Phản ứng VP: Kết quả dương tính khi không có màu đỏ sau khi

cho thuốc thử 15 – 20 phút

• Phản ứng citrate: Kết quả dương tính khi màu đỏ thành màu

xanh

Công thức tính toán

Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là E.Coli đã đếm được trên các đĩa, tổng

số ống nghiệm thử Indol dương tính và tổng số ống nghiệm thử Indol

Số lượng E.Coli có trong 1ml (1g) mẫu:

n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thấp nhất

n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng cao nhất

f1: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất v: Thể tích mẫu cấy cả đĩa Petri

R: Số ống nghiệm thử Indol dương tính/Số ống nghiệm thử Indol

Lưu ý

• Khi tiến hành phân tích xác định vi sinh vật phải tiến hành trong môi trường vô trùng

• Dụng cụ, thiết bị phải được khử trùng

• Hóa chất phải được pha trước, vô trùng, bảo quản lạnh

• Đeo gang tay khi tiến hành thí nghiệm

TÀI LIỆU THAM KHẢO