Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam

Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẦN VĂN CƯƠNG

GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u ĐỊNH TÍNH,

ĐỊNH LƯỢNG VÀ THÃM DÒ

MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC

CỦA CÂY BỔ CÔNG ANH VIỆT NAM

(.LACTUCA INDICA L ASTERACEAE)

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 19^9-2004)

Thời gian thực hiện :15/12/2003-20/0

Hhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn cá c thầy, eô

bộ môn Dược I}ỌC c ổ Truyền, bộ môn Bượe lý, bộ môn Vi Sinh

Ký Sinh cùng cá c eô hỹ thuật viên đã giúp đỡ, tạo điều hiện tốt nhấí cho tôi hoàn thành hhoá luận này.

Tlằ nội ngày 2Q tháng 05 năm 2QQ4

Sinh viên: Trần Vần Cương

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đ ề 1

Phần 1-Tổng q u an 2

1.1 Đặc điểm thực vật, phân b ố 2

1.2 Thành phần hoá h ọ c 2

1.3 Công dụng 3

1.3.1 Theo y hoc cổ truyền 3

1.3.2 Theo y học hiện đ ạ i 5

1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 6

Phần 2-Thực nghiệm kết q u ả 7

2.1 Nguyên liệu,phương tiện,phương pháp nghiên cứu 7

2.1.1 Nguyên liệu 7

2.1.2 Phương tiện 7

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 8

2.2 Thực nghiệm kết q u ả 9

2.2.1 Định tính flavonoid 9

2.2.2 Định lượng flavonoid 12

2.2.3 Chiết xuất, phân lập 13

2.2.4.Thử tác dụng dược l ý 18

Phần 3-Kết luận và đề xuất 20

3.1 Kết luận 24

3.2 Đề xuất 25

Tài liệu tham khảo

Đ Ặ T VẤN ĐỂ •

Nước ta có nguồn dược liệu phong phú và nền y học cổ truyền dân tộc lâu đời Vì vậy việc nghiên cứu sử dụng các dược liệu sẵn có trên cơ sở kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại là một chủ trương của nhà nước

Chúng ta đang phấn đấu trong những năm tới trên thị trường thuốc nước ta, thuốc đông dược chiếm khoảng 30% thị phần để góp phần làm giảm giá thuốc Ngày nay với sự phát triển của công nghệ bào chế, việc chiết riêng các thành phần trong dược liệu để làm thuốc đang được các nhà khoa học quan tâm Do đó việc nghiên cứu, tách chiết, thăm dò tác dụng sinh học của các thành phần trong dược liệu là rất cần thiết

Cây bồ công anh (Lactuca indica L Asteraceae) là một cây thuốc mọc

hoang ở khắp nước ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến Từ lâu

đã được nhân ta sử dụng với tác dụng trị mụn nhọt, sưng vú, đầu đinh Tài liệu nghiên cứu về bồ cổng anh chưa nhiều, nguồn nguyên liệu trong nước lại rất sẩn Do vậy, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu dược liệu này với mục đích góp phần dần đưa dược liệu này vào khai thác và sử dụng hợp lý, hiệu quả hơn

Do thời gian và kinh phí có hạn nên trong khoá luận này chúng tôi mới chỉ nghiên cứu một số nội dung sau:

1 Định tính , định lượng flavonoid toàn phần từ lá bồ công anh

2 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng chất phân lập

3 Thăm dò tác dụng lợi mật và tác dụng kháng khuẩn của lá bồ công anh

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây bồ công anh Việt Nam có tên khoa học là Lactuca indica L Asteraceae

họ Cúc [1,4,8] Ngoài ra còn một số tên khác như: cây mũi mác, diếp dại, diếp trời, rau bồ cóc, rau mét, phắc b ao [8]

Cây thảo mọc đứng, sống 1 hay 2 năm, thân nhẵn, thẳng, cao 0,50 - lm có khi đến 2m, ít phân cành ,đôi khi có những đốm tía trên thân

Lá mọc so le gần như không cuống và không đều Lá ở trên ngắ rất đa dạng

Lá ở phía dưới dài khoảng 30cm rộng khoảng 5-6cm chia thành nhiều thuỳ n

và hẹp hơn có ít răng cưa hoặc nguyên

Cụm hoa là 1 đầu tụ họp thành chuỳ dài 20-40cm mọc ở ngọn thân và kẽ lá, phân nhiều nhánh mang 2 đến 5 đầu.Tổng bao hình trụ, mỗi đầu có 8 đến 10 hoa màu vàng hoặc vàng nhạt Tràng hoa có lưỡi dài, nhị 5, bao phấn có đỉnh rất tròn, tai hình dùi, vòi nhuỵ có gai

Quả bế, màu đen, có mào lông trắng nhạt, hai cạnh có cánh, hai cạnh khác giảm thành một đường lồi

Thân và lá bấm có nhựa màu trắng chảy ra Mùa hoa vào tháng 6-7, mùa quả vào tháng 8- 9

Cây bồ công anh (Lactuca indica L.) mọc hoang, phân bố chủ yếu ở vùng

ấm thuộc các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia,

Philippin Tại Việt Nam bồ công anh (Lactuca indica L.) phân bố rải rác

khắp mọi nơi Từ miền núi (thường ở độ cao dưới 1000m) trung du đến đồng bằng [1,2,4,8,13]

1.2 Thành phần hoá học

2

Lá tươi cây bồ công anh (Lactuca indica L.) có chứa 91,8% nước, 3,4%

protein, vitamin c [2,7] Ngoài ra trong cây còn có chứa flavonoid, saponin thuộc nhóm steroid, coumarin, serquiterpen lacton, tanin và sterol [6]

Năm 1995, Park Hee Juhn và cộng sự đã phát hiện trong cây Lactuca

indica L có sterol và triterpen, đã tách và xác định cấu trúc của 3 sterol là

f3- sitosterol , compesterol, stigmasterol và 6 triterpen là ị3- amyrin , lupeol, pseudotarasterol , taraxasterol [16]

Ngoài ra một số loài bồ công anh khác đã được nghiên cứu như:

Trong rễ cây Lactuca virosa L có serquiterpen lacton [17].

Phần trên mặt đất của cây Lactuca saligna L xác định có serquiterpen

lacton, triterpen, sterol, coumarin, flavonoid và đã nhận dạng cấu trúc của 3 chất serquiterpen lacton là: lactucin; lactucopicin diacetat; 11(3,13 dihydrolactucopicrindiacetat [14]

Trong cây Lactuca savita L đã tách và xác định được cấu trúc của 3

serquiterpen [15]

Đối với cây bồ công anh Trung Quốc (jTaraxacum officinale Wigg

Asteraceae) người ta phát hiện thấy toàn cây chứa chất đắng taraxacin, một chất kết tinh taraxacerin, saponosid, phytosterol ((3-sitosterol), stigmasterol, taraxasterol, homataraxasterol, flavonoid [7]

1.3 Công dụng

1.3.1 Theo y học cổ truyền [3,7]

Cây bồ công anh có vị cam khổ , tính hàn, quy vào các kinh can, tỳ, vị Công năng: Giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, lương huyết, tán ứ, trợ tiêu hoá, lợi sữa

Chủ trị: tỳ vị có hoả uất, sưng vú, tràng nhạc, đinh độc nhiệt ung nhọt, ghẻ lở, đầy bụng, khó tiêu

Kiêng kị: người có ung nhọt đã vỡ không nên dùng

Môl số vhươns thuốc trong dân gian CO vi thuốc bồ câng anh:

- Đơn thuốc chữa sưng vú, tắc tia sữa: [7]

Bồ công anh tươi 20-30 lá, rửa sạch, thêm ít muối giã nát vắt lấy nước uống còn bã dùng đắp lên nơi vú sưng đau Thường dùng 2-3 lần là đỡ

- Đơn thuốc chữa ăn uống kém tiêu hay bị mụn nhọt [7]

Lá bồ công anh khô 10 đến 15 gam sắc với 3 bát nước còn 1 bát uốngtrong 3 đến 5 ngày

- Đơn thuốc chữa đau dạ dày [7]

Lá bồ công anh khô 20g

Cách dùng: Thêm 300 ml nước sắc đun sôi trong 15 phút.Thêm ít đường

vào uống Chia 3 - 5 lần trong ngày, uống liên tục 3 - 1 0 ngày, nghỉ 3 ngày rồi tiếp tục uống cho đến khi khỏi

- Bồ công anh hợp tễ I : [10]

Công dụng: Thanh nhiệt giải độc trị chứng phổi nhiễm xạ khuẩn

- Bồ công thang (Viện Y Học Dân Tộc Việt Nam) [10]

4

Cúc hoa Cam thảo Kim ngân hoa

8g4g12g

Cách dùng: sắc uống

Công dụng: Trị mụn nhọt ngoài da

1.3.2 Theo y học hiện đại

• Nước sắc lá cây bồ công anh Lactuca indica L khòng thể hiện độc tính

qua đường uống, cụ thể với liều 200g dược liệu/kg chuột không quan sát thấy chuột nào chết [6]

• Flavonoid toàn phần của lá cây bồ công anh Lactuca indica L có tác

dụng chống oxi hoá, kìm hãm hoạt động của peroxydase máu thỏ trong phản ứng oxi hoá Indigocarmin và làm tăng lượng nhóm thiol tự do trong huyết thanh thỏ [9]

• Dịch chiết từ lá cây bồ công anh Lactuca indica L còn có hoạt tính

dọn gốc tự do [19]

• Cao lá bồ công anh (Lactuca indica L.) với liều lg dược liệu/20g chuột

có tác dụng giảm đau và tác dụng này mạnh hơn là flavonoid toàn phần với liều 0,07g flavonoid toàn phần/20g chuột (thử tác dụng giảm đau nội tạng - theo phương pháp của Kosteng) [6]

• Cao lá (2:1) cây bồ công anh (Lactuca Indica L Asteraceae) với liều

4g dược liệu/lOOg chuột và dung dịch flavonoid 2,5% liều 0,005g flavonoid toàn phần /20g chuột đều có tác dụng chống viêm bắt đầu từ giờ thứ 2 kể từ khi uống chế phẩm [6]

• Các nhà khoa học trên thế giới đã thử tác dụng dược lý với dịch chiết

cloroform và dịch chiết methanol của cây bồ công anh (Lactuca indica

L.) mọc ở nước ngoài thấy cả 2 dịch chiết có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh tương đương nhau[ 16].Thành phần serquiterpen

lacton là lactucain c, lactucasid trong cây còn có tác dụng chống đái tháo đường [18].

1.4 Bộ phận dùng, thu h á i, chế biến [12]

Thường dùng lá đôi khi người ta cũng dùng cả thân bỏ rễ, thường được thu hái vào tháng 5-7 lúc cây chưa ra hoa hoặc bắt đầu ra hoa Loại bỏ lá già, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô Phải thường xuyên phơi lại để tránh mốc

6

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên liệu , phương tiện, phương pháp nghiên cứu

• Máy đo độ ẩm Presica HA60 (Thuỵ Sĩ)

• Bộ cất quay áp suất giảm Bucher (Đức)

• Máy đo phổ hồng ngoại IR

• Máy đo phổ khối 5989B-MS tại Phòng cấu trúc -Viện Hoá Học

• Nồi hấp tiệt trùng Autoclab

• Cân phân tích presica (Thuỵ Sĩ)

• Và một số thiết bị khác

2.1.2.2 Hoá chất

• Dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích

• Bột silicagel làm bản mỏng - Viện kiểm nghiệm

- Vi sinh vật: bao gồm 5 chủng Gram(+) và 5 chủng Gram (-) do bộ môn

Vi sinh-Ký sinh cung cấp

Gram âm Escherichia coli ATCC 25922 (Ec)

Pseudomonas aeruginosa UM 201 (Pseu)

Gram dương Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)

Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs)

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

2.1.3.1 Định tính flavonoid:

- Định tính trong ống nghiệm bằng các phản ứng theo tài liệu [11]

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng theo tài liệu [5]

2.1.3.2 Định lượng: theo phương pháp cân [5]

* Nguyên tắc: chiết kiệt flavonoid bằng dung môi thích hợp, thu hồi dung

môi, sấy, cân, tính hàm lượng flavonoid toàn phần theo công thức:

x % = - - 100

mix -b )

a: khối lượng ílavonoid toàn phần (g) m: khối lượng dược liệu đem định lượng (g) b: hàm ẩm của dược liệu

2.1.3.3 Phân lập và nhận dạng một thành phần từ dịch chiết ethylacetat:

- Dùng sắc ký chế hoá và sắc ký lọc qua gel Sephadex LH20

8

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc kí lớp mỏng.

- Nhận dạng sơ bộ chất phân lập dựa vào các dữ liệu phổ IR, MS

2.I.3.4 Thử tác dụng sinh học

• Dùng cao lỏng 2:1 chiết bằng dung môi ethanol 70° và hỗn dịch flavonoidtoàn phần 5% để thử tác dụng sinh học

• Thử tác dụng lợi mật theo phương pháp Rudi

• Nguyên tắ£i Cho chuột uống chế phẩm thử trước 2 ngày, ngày thứ ba sau

khi uống 60 phút gây mê, mổ, thắt ống mật chủ, khâu lại Sau 30 phút mổ lại cắt túi mật , cân So sánh với mẫu chứng cho uống dung dịch NaCl 0,9% Độ lợi mật tính theo công thức:

L% = 100

mc

Trong đó mt : trọng lượng mật trung bình của lô thử

mc : trọng lượng mật trung bình của lô chứng

• Thử tác dụng kháng khuẩn trên 10 chủng vi khuẩn theo phương pháp khoanh giấy khuyếch tán trên môi trường đặc [12]

*Nguỵên tắc: Dựa trên sự khuyếch tán chất thử từ khoanh giấy vào môi

trường nuôi cấy đặc có sẵn vi sinh vật chỉ thị Độ kháng khuẩn được thể hiện thông qua đường kính vòng vô khuẩn Tiến hành song song với mẫu chứng làkháng sinh Penicilin (Gram +), Gentamycin (Gram -)

2.2 Thực nghiệm và kết quả

2.2.1 Định tính flavonoid

2.2.1.1 Chiết xuất flavonoid toàn phần

Cân 20 g bột lá dược liệu cho vào túi giấy lọc, đặt vào bình Shoxlet Chiết bằng methanol ở nhiệt độ 60° trên nồi cách thuỷ Chiết đến khi dịch chiết không còn cho phản ứng dương tính với NaOH 10% Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cắn thu được hoà tan trong 200ml nước cất nóng Để qua đêm, lọc loại bỏ tủa Chlorophyl Dịch nước đem lắc với Chloroform đến khi lớp Chloroform không còn phát quang tại bước sóng 365nm Dịch nước được

chiết bằng ethylacetat đến khi dịch ethylacetat không còn màu vàng Gộp dịch ethylacetat ta được dịch chiếtl và phẩn dịch nước còn lại được chiết bằng hỗn hợp nước - ethylacetat - methanol ( 4:5:1) Để phân lớp thấy lớp ethylacetat trở nên vàng đậm hơn rất nhiều so với lớp ethylacetat chiết lần cuối cùng ở trên

Bỏ phần nước lấy phần ethylacetat được dịch chiết 2

Dịch chiết 1 và 2 cất thu hồi dung môi được cắn E l, E2

Sơ đồ quy trình chiết xuất flavonoid toàn phân

2.2.1.2 Các phản ứng trong ống nghiệm

Cắn E1 và E2 được hoà tan trong ethanol tiến hành làm các phản ứng:

• Phản ứng với hơi amoniac : Nhỏ một giọt dung dịch E1 toàn phần lên tờ

giấy lọc, để khô tự nhiên rồi hơ lên miệng lọ NH3 đặc thấy màu vàng đậm lên ( phản ứng dương tính)

• Phản ứng cyanỉdin: lấy lml dung dịch E1 toàn phần thêm một ít bột Mg và

3 giọt HC1 đặc Đun sôi nhẹ, dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt ( phản ứng dương tính)

• Phản ứng với FeCỈ3: Lấy lml dung dịch E1 cho vào ống nghiệm thêm 2

giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen (phản ứng dương tính)

• Phản ứng diazo hoá: Lấy lml dịch E1 cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt

thuốc thử diazo mới pha thấy màu đỏ - vàng nhạt xuất hiện (phản ứng dương tính)

• Phản ứng với chì Acetat: Lấy lml dịch E1 cho vào ống nghiệm thêm một

giọt dung dịch chì acetat 5% thấy có kết tủa vàng (phản ứng dương tính)

• Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Lấy lml dung dịch E1 thêm vào vài

giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng đậm có ánh đỏ (phản ứng dương tính)

• Với dung dịch H2S 0 4 đặc lấy lml dung dịch E1 thêm vào vài giọt H2S04

đặc lắc đều thấy xuất hiện màu vàng đậm có ánh đỏ ( phản ứng dương tính)

Tương tự làm các phản ứng với dung dịch E2 kết quả đều cho phản ứng dươngtính

„ * Kết luân: Như vậy dung dịch E l, E2 là dung dịch Flavonoid Gộp cắn E1 và

E2 ta được flavonoid toàn phần

2.2.1.3 Định tính bằng sác ký lớp mỏng

11

Chấm sắc ký lớp mỏng dung dịch E1 trong ethanol.

Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck được hoạt hoá trong tủ sấy 110°c trong

30 phút Triển khai bằng hệ dung môi methanol - ethylactat - nước - acid acetic (tỷ lệ 17 - 100 - 13 - 1) ta thu được kết quả như bảng 1, Hình 1 trang 17

2.2.2 Định lượng flavonoid toàn phần

Cân 3 mẫu dược liệu mỗi mẫu 20 g Chiết flavonoid toàn phần theo quy trình phần 2.2.1.1 cắn ílavonoid toàn phần thu được sấy khô ở 60° đến khối lượng không đổi, cân Hàm lượng ílavonoid toàn phần trong dược liệu được tính theo công thức:

Bảng 2:Kết quả định lượng flavonoid toàn phần

Mẫu Khối lượng

dược liệu(g)

Độ ẩm

(%)

Khối lượng cắn(g)

Hàm lượng (%)

Nhân xét: Như vậy nếu chỉ dùng ethylacetat thì khó chiết kiệt được flavonoid

Do vậy sau khi chiết ílavonoid bằng ethylacetat ta nên chọn dung môi thích hợp để chiết kiệt flavonoid Trong trường hợp này ta có thể dùng hỗn hợp dung mồi là ethylacetat-methanol-nước ( 5:1:4 )

2.2.3 Chiết x u ấ t, phân lập

2.2.3.I Chiết xuất

Cắn E1 được chiết xuất như phần 2.2.1.1 cắn E1 thu được hoà tan trong 10ml ethanol tuyệt đối, cho từ từ 50ml aceton , làm lạnh, lọc Dịch thu được cất thu hồi dung môi, được cắn F

Cắn F thu được hoà tan trong nước cất Sau đó lắc với diethylether (l).LỚp diethyl ether được lắc với nước cất đến khi lớp nước cất không còn màu Lấy lớp diethylether thu hồi diethylether ta được cắn F l

Lớp nước (1) được lắc với diethylether đến khi lớp diethylether không còn màu Lấy lớp nước bỏ lớp diethyl ether Sau đó lớp nước này được chiết lại với ethylacetat Cất thu hồi ethyl acetat ta được cắn F2

Chấm sắc ký dung dịch F l, dung dịch F2, dung dịch E l

13

Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck được hoạt hoá trong tủ sấy 110°c

trong 30 phút Triển khai bằng hệ dung môi methanol - ethylactat - nước - acid acetic ( 17 - 100- 13 - 1) ( Hình 1 trang 17)

Sơ đồ quy trình chiết F ỉ, F2 từ cắn flavonoid