Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng sinh học của cây cam thảo đá bia jasminanthes tuyetanhiae t b tran rodda, apocynaceae

Từ kết quả thử nghiệm in vitro lựa chọn bộ phận có hoạt tính tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học, sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng,phương pháp sắc kí cộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC

THÁI HỒNG ĐĂNG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY

CAM THẢO ĐÁ BIA

JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA,

APOCYNACEAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC

THÁI HỒNG ĐĂNG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY

CAM THẢO ĐÁ BIA

JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA,

APOCYNACEAE

Chuyên ngành: Dược học cổ truyền

Mã số: 60720406

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Vân Anh

Thành phố Hồ Chí Minh – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trongluận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Thái Hồng Đăng

TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2018-2020 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC

DỤNG SINH HỌC VÀ CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA

(Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae)

Thái Hồng Đăng

Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Vân Anh

Đặt vấn đề: Cam thảo đá bia (CTĐB) Jasminanthes tuyetanhiae Apocynaceae là loài

dược liệu đặc hữu của vùng núi Đá Bia - Phú Yên, phần thân rễ có vị ngọt được dângian sử dụng để chữa ho và thay thế Cam thảo bắc trong các bài thuốc Do tác dụngđộc đáo, CTĐB bị khai thác triệt để dẫn đến chỉ còn vài cá thể ít ỏi và được xếp vàosách đỏ Việt Nam năm 2007 Nhằm mục đích bảo tồn, phát triển một dược liệu quý,chúng tôi thực hiện đề tài khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụngsinh học của cây CTĐB, mở đầu cho nghiên cứu phát triển ứng dụng chữa bệnh trongtương lai

Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm vi học các bộ phận rễ, thân, lá CTĐB,

phân tích mã vạch ADN vùng gen ITS và rbcL, so sánh với dữ liệu các loài trênGenbank Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 3 bộ phận theo phương pháp Ciuleycải tiến, so sánh thành phần hóa học bằng sắc kí lớp mỏng Đánh giá tiềm năng hoạttính sinh học các bộ phận bằng thử nghiệm chống oxy hóa làm giảm màu DPPH, độctính trên tế bào ung thư MDA-MB-231 và RD, ức chế sản sinh NO từ tế bào bạch cầuRAW 264.7, kháng khuẩn và kháng nấm với một số chủng vi sinh vật gây bệnh Từ

kết quả thử nghiệm in vitro lựa chọn bộ phận có hoạt tính tiến hành nghiên cứu thành

phần hóa học, sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng,phương pháp sắc kí cột để phân lập chất tinh khiết Cấu trúc chất phân lập được xácđịnh bằng phổ MS và NMR

Kết quả: Thân cây CTĐB có cấu tạo vi phẫu đặc trưng của các cây họ Apocynaceae

như ống nhựa mủ thật, libe quanh tủy và cụm tế bào sợi vách cellulose; trong khi ở

lá và cuống lá có ống nhựa mủ, libe quanh tủy Kết quả phân tích ADN bằng công cụBLAST và xây dựng cây phát sinh loài đã khẳng định sự khác biệt về gen ITS và

rbcL của CTĐB so với các loài khác trong phân họ Thành phần hóa học toàn câyCTĐB cùng chứa các nhóm hợp chất giống nhau gồm: Triterpenoid tự do, alkaloid,coumarin, đường 2-desoxy, saponin và hợp chất polyuronic Ngoài các nhóm hợpchất chung, trong mẫu lá còn có thêm tinh dầu Bằng sắc kí lớp mỏng cho thấy láCTĐB có thành phần khác biệt so với thân và rễ, trong khi ở thân và rễ các vết chínhhoàn toàn tương đồng nhau ngoại trừ ở cao nước.

Kết quả thử nghiệm in vitro: rễ và lá cho kết quả chống oxy hóa tốt hơn so với thân,

thấp nhất ở lá là cao MeOH với IC50 3,74 ± 0,085 µg/ml, ở rễ là cao DCM với IC50

4,61 ± 0,13 µg/ml Cao chiết DCM lá CTĐB là cao chiết tiềm năng có tác dụng trêncác dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 và RD với IC50 lần lượt là 95,31 ± 0.58 µg/ml

và 38,40 ± 0.92 µg/ml Lá và rễ CTĐB có hoạt tính kháng viêm tốt hơn bộ phận thân,tập trung ở các phân đoạn kém phân cực đến phân cực trung bình, cao chiết DCM từ

lá có giá trị IC50 tốt nhất 8,71 ± 0,37 μg/ml Cả 3 bộ phận không thể hiện hoạt tínhkháng khuẩn và kháng nấm

Từ 1,8 kg nguyên liệu rễ chiết ngấm kiệt với cồn 70%, chiết phân bố lỏng - lỏng vàchọn phân đoạn ether phân tách chất bằng phương pháp sắc kí cột thu được 4 chất

glycosid tinh khiết gồm Telosmoside A11 , Telosmoside A 22, Telosmoside A23 và

Tuyetanhoside 1.

Kết luận: Đề tài đã xây dựng đặc điểm vi học và mã vạch ADN phục vụ định danh

cây Cam thảo Đá Bia Hoạt tính kháng viêm vẫn là hoạt tính chủ đạo của CTĐB đặcbiệt đối với bộ phận dùng là rễ Thành phần chính trong rễ là các steroid glycosid vớiphần đường 2,6-deoxy Đề tài đã phân lập và xác định 3 chất mới từ CTĐB

(Telosmoside A22, Telosmoside A23 và Tuyetanhoside 1)

Final essay for the degree of MS Pharm Academic year 2018-2020

INVESTIGATION OF THE CHEMICAL CONSTITUENTS AND

BIOLOGICAL ACTIVITIES OF CAM THAO DA BIA

(Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae)

Thai Hong Dang

Supervisor: Dr Tran Thi Van Anh

Introduction: Cam Thao Da Bia (CTDB) Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran &

Rodda, Apocynaceae is an endemic plant of the Da Bia mountainous region in PhuYen province The stems and roots of this plant with sweet taste are used as asubstitution for licorice in traditional medicine With the aim of reserving anddeveloping this precious plant, the plant anatomy characteristics and evaluation ofsome biological effects have been conducted to establish a foundation for furtherstudies of therapeutic applications in the future

Research Methodology: For identification, the microbiological characteristics of the

roots, stems, leaves were described; DNA of ITS and rbcL genome regions wereanalyzed and compared with species data on Genbank Chemical constituents of threeparts of CTDB were preliminarily analyzed by Ciuley method and thin layerchromatography The biological activities were evaluated by DPPH antioxidant test,cytotoxicity test on MDA-MB-231 and RD cancer cell, anti-inflammatory test oninhibiting production of NO from white blood cells RAW 264.7, antibacterial andantifungal test with some pathogenic microorganisms The part of CTDB whichshowed good activities was chosen for investigation of the chemical constituents,using percolation method, liquid-liquid distribution extraction, columnchromatography Structure of isolated compounds were elucidated by analyzing MSand NMR spectroscopy

Results: The stems of CTDB have the plant anatomy characteristics of Apocynaceae

family such as non-articulated laticifer, internal phloem and bunch of cellulose wallsclerenchyma fibres; while in the leaves and petiole there is a non-articulated laticifer,the phloem around the pith Results of DNA analysis using BLAST tool andphylogenetic tree construction have confirmed the distinction of ITS gene and rbcL

of CTDB compared with other species in subfamily Chemical constituents indifferent parts of CTDB were similar in general (free triterpenoids, alkaloids,coumarins, 2-desoxy sugars, saponins and polyuronic compounds); except the leafhad essential oils The thin layer chromatography analyses showed that the leaves of

CTDB have different constituents compared with stems and roots The result of in vitro test indicated that roots and leaves showed better antioxidant activity than stems,

with IC50 3.74 ± 0.085 µg/ml of MeOH extract from leaf and IC50 4.61 ± 0.13 µg/ml

of DCM extract from the root The CTDB leaf extract showed the potential effects

on MDA-MB-231 and RD cancer cell with IC50 at 95.31 ± 0.58 µg/ml and 38.40 ±0.92 µg/ml, respectively The leaves and roots had better anti-inflammatory activitythan the stem The best IC50 value, 8.71 ± 0.37 μg/ml was found for the DCM extractfrom leaves The extract from three plant parts did not show antibacterial andantifungal function

1.8 kg of root was percolated with 70% ethanol and the separated by liquid - liquiddistribution Ether fraction was chosen for investigation chemical constituents By

different means of column chromatography, 4 glycosides including Telosmoside

A11, Telosmoside A22, Telosmoside A23 and Tuyetanhoside 1 were obtained Conclusions: The thesis has established micro-characteristics and DNA barcodes for

the identification of CTDB Anti-inflammatory activity is still the main bio-activityfor the roots, the used part in folk medicine The main components in the roots weresteroidal glycosides with a 2,6-deoxy sugar moieties 3 new compounds from CTDB

were identified (Telosmoside A22, Telosmoside A23 and Tuyetanhoside 1).

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC VIẾT TẮT 3

DANH MỤC HÌNH 1

DANH MỤC BẢNG 1

DANH MỤC SƠ ĐỒ 1

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1.TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 2

1.1.1.Giới thiệu chi Jasminanthes 2

1.1.2.Đặc điểm hình thái Jasminanthes tuyetanhiae 3

1.2.TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES 6

1.2.1.Thành phần hóa học của Jasminanthes (Stephanotis) mucronata 6

1.2.2.Thành phần hóa học của Jasminanthes tuyetanhiae 14

1.3.TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES 17

1.3.1.Tác dụng dược lý của Jasminanthes mucronata 17

1.3.2.Tác dụng dược lý của Jasminanthes tuyetanhiae 22

1.4.CÔNG DỤNG DÂN GIAN CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES 22

1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO 22

1.5.1.Tác dụng chống oxy hóa 22

1.5.2.Tác dụng độc tính tế bào ung thư 25

1.5.3.Tác dụng kháng khuẩn 25

1.5.4.Tác dụng kháng viêm 28

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1.ĐỐI TƯỢNG 30

1.1.1 Nguyên liệu 30

2.1.1.Dung môi và thuốc thử 30

2.1.2.Dụng cụ và trang thiết bị 31

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.2.1.Khảo sát thực vật 32

2.2.2.Phân tích mã vạch ADN 32

2.2.3.Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học 33

2.2.4.Đánh giá tác dụng sinh học in vitro 34

2.2.5.Nghiên cứu hóa học 38

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1.KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU 40

3.1.1.Khảo sát thực vật cây CTĐB 40

3.1.2.Phân tích mã vạch ADN định danh 45

3.1.3.Đánh giá độ tinh khiết 48

3.1.4.Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật trong Cam thảo Đá Bia 48

3.1.5.So sánh thành phần hóa học các bộ phận bằng sắc kí lớp mỏng 49

3.2.KHẢO SÁT MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO 52

3.2.1.Chiết xuất cao thử nghiệm hoạt tính sinh học 52

3.2.2.Hoạt tính chống oxy hóa 52

3.2.3.Độc tính tế bào 54

3.2.4.Hoạt tính kháng viêm 55

3.2.5.Hoạt tính kháng khuẩn 57

3.2.6.Tổng kết đánh giá tác dụng sinh học in vitro 58

3.3.NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAM THẢO ĐÁ BIA 59

3.3.1.Chiết xuất 59

3.3.2.Phân tách cao chiết toàn phần 60

Phân tách cao ether (JasA) 62

3.3.3.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập 73

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 88

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92

KẾT LUẬN 92

Kiểm tra nguyên liệu 92

Khảo sát một số tác dụng sinh học in vitro 92

Nghiên cứu thành phần hóa học của CTĐB 93

KIẾN NGHỊ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

DANH MỤC VIẾT TẮT

Con A Concanavalin A

CsA Cyclosporin A

DMSO Dimethyl sulfoxide

diphenyltetrazol bromideNBT Nitroblue tetrazolim

NFAT Nuclear factor of activated T-cells

NFκB Nuclear factor-kappa B

NO Nitric oxide

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

NSAIDs Non-steroid anti-inflammatory drugs Kháng viêm không steroid

OVA Ovalbumin

PBS Phosphate-buffered saline

PKCθ Protein kinase C-theta

TCA Trichloroacetic acid

Th1 T helper lymphocyte type 1

Th2 T helper lymphocyte type 2

TNF-α Tumor necrosis factor-α

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1: Vùng sinh thái núi Đá Bia và hình thái của Jasminanthes tuyetanhiae

[37] 4

Hình 1-2: Các bộ phận của hoa Jasminanthes tuyetanhiae [37] 5

Hình 1-3: Jasminanthes tuyetanhiae (hình vẽ bởi Lê Kim Chi) [37] 5

Hình 1-4: Cấu trúc các hợp chất Mucronatosid 7

Hình 1-5: Cấu trúc các hợp chất Stemucronatosid và Sinomarinosid 9

Hình 1-6: Cấu trúc các hợp chất Stephanosid 10

Hình 1-7: Cấu trúc các hợp chất C21 steroid aglycon 11

Hình 1-8: Cấu trúc các hợp chất pregnan glycosid 12

Hình 1-9: Cấu trúc các hợp chất oleanan saponin 14

Hình 1-10: Cấu trúc các hợp chất Telosmosid 16

Hình 3-1: Đặc điểm hình thái mẫu dược liệu CTĐB 40

Hình 3-2 :Vi phẫu và sơ đồ thân (T) và rễ (R) CTĐB 42

Hình 3-3 :Vi phẫu và sơ đồ lá (L), cuống lá (CL) và phiến lá (PL) 44

Hình 3-4: Cấu tử bột rễ (F1-6), thân (G1-6) và lá (H1-5) 45

Hình 3-5: ADN tổng số trên agarose 0,8% 46

Hình 3-6: Kết quả PCR mồi ITS1-ITS4 (trái) và mồi rbcL_F-rbcL_R (phải) 46

Hình 3-7: Cây phát sinh loài của gen ITS (trái) và rbcL (phải) 47

Hình 3-8: Sắc kí đồ phân tích cao DCM rễ, thân, lá 50

Hình 3-9: Sắc kí đồ phân tích cao MeOH rễ, thân, lá so sánh với mẫu đối chiếu (ĐC) 51

Hình 3-10: Sắc kí đồ phân tích cao nước rễ, thân, lá 51

Hình 3-11: Biểu đồ kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa (IC50 µg/mL) 53

Hình 3-12: Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh NO của các mẫu có hoạt tính 57

Hình 3-13: So sánh các phân đoạn từ cao cồn 70% toàn phần 62

Hình 3-14 Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột nhanh JasA 63

Hình 3-15: Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột silicagel JA.6 64

Hình 3-16 Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí rây phân tử JA.6.3 65

Hình 3-17 Sắc kí pha đảo kiểm tra tinh khiết JA.6.3.2 66

Hình 3-18: Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất JAS1 67

Hình 3-19 Sắc kí đồ các phân đoạn JA.7 68

Hình 3-20: Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột silicagel JA.7.1 69

Hình 3-21: Sắc kí pha đảo kiểm tra tinh khiết JA.7.1.3 và 7.1.5 69

Hình 3-22: Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất JAS2 và JAS3 70

Hình 3-23: Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất JAS4 71

Hình 3-24: Sắc kí đồ các chất phân lập từ cao ether 72

Hình 3-25: Phổ MS của chất JAS1 73

Hình 3-26: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất JAS1 77

Hình 3-27: Phổ MS của chất JAS2 77

Hình 3-28: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất JAS2 81

Hình 3-29: Phổ MS của chất JAS3 81

Hình 3-30: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất của JAS3 84

Hình 3-31: Phổ MS chất JAS4 84

Hình 3-32: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất JAS4 87

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1-1: Danh sách các loài thuộc chi Jasminanthes [27], [30], [51] 3

Bảng 1-2: Các hợp chất Mucronatosid 6

Bảng 1-3: Các hợp chất Stemucronatosid 8

Bảng 1-4: Các hợp chất Stephanosid 10

Bảng 1-5: Các hợp chất C21 steroid aglycon 11

Bảng 1-6: Các hợp chất Sinomarinosid 12

Bảng 1-7: Các hợp chất pregnan glycosid 12

Bảng 1-8: Các hợp chất oleanan saponin 13

Bảng 1-9: Tổng hợp hoạt tính sinh học các hợp chất trong Jasminanthes mucronata 21

Bảng 2-1: Kí hiệu mẫu cao thử nghiệm sinh học 34

Bảng 2-2: Hỗn hợp phản ứng 35

Bảng 2-3: Các nhóm vi sinh vật trong đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 37

Bảng 3-1: Thành phần bốn loại nucleotide của mẫu CTĐB 46

Bảng 3-2: Kết quả BLAST đoạn gen ITS và rbcL của CTĐB 47

Bảng 3-3: Kết quả thử tinh khiết mẫu Cam thảo Đá Bia 48

Bảng 3-4: Kết quả định tính trên các dịch chiết Cam thảo Đá Bia 49

Bảng 3-5: Khối lượng và hiệu suất chiết các cao thử nghiệm sinh học 52

Bảng 3-6: Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào ung thư 54

Bảng 3-7: Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao LD 55

Bảng 3-8: Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 56 Bảng 3-9 :Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 58

Bảng 3-10: Tổng kết đánh giá tác dụng sinh học in vitro 59

Bảng 3-11 Các phân đoạn thu được từ JasA 63

Bảng 3-12: Các phân đoạn thu được từ JA.6 64

Bảng 3-13: Các phân đoạn thu được từ JA.6.3 65

Bảng 3-14 Các phân đoạn thu được từ JA.7 68

Bảng 3-15: Các phân đoạn thu được từ JA.7.1 68

Bảng 3-16 : Các giá trị phổ NMR của JAS1 75

Bảng 3-17: Dữ liệu phổ NMR của chất JAS2 79

Bảng 3-18: Dữ liệu phổ NMR chất JAS3 82

Bảng 3-19: Dữ liệu phổ NMR chất JAS4 86

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3-1: Quy trình chiết xuất, phân tách các cao từ cao cồn 70% của rễ CTĐB 61

Sơ đồ 3-2: Tóm tắt quy trình phân lập các chất từ cao JasA 72

sách đỏ Việt Nam năm 2007 với tên Cam thảo Đá Bia Telosma procumbens (Blanco)

Merr Asclepiadaceae (EN B1+2B) [2]

Tháng 8 năm 2017, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm bảo tồn cây thuốc miền Trungcùng với các chuyên gia và TS Trần Thế Bách thu được mẫu ra hoa của cây CTĐB,

CTĐB được định danh lại và mang danh pháp khoa học mới là Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda Apocynaceae, Asclepiadoideae [37].

Công dụng của CTĐB xuất phát từ kinh nghiệm của các lương y địa phương sử dụngphần thân rễ để chữa ho và thay thế cam thảo bắc trong các bài thuốc Hiện nay, córất ít các nghiên cứu khoa học trên thế giới và tại Việt Nam thực hiện trên mẫu CTĐB

(Jasminanthes tuyetanhiae) Nhằm mục đích bảo tồn, phát triển một dược liệu quý,

chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng

sinh học của cây Cam thảo Đá Bia (Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda

Apocynaceae)”

Mục tiêu đề tài

- Xây dựng đặc điểm định danh CTĐB bằng phương pháp vi học và phân tích ADN(vùng ITS và rbcL) Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các bộ phận của cây CTĐB

- Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro các cao chiết: tác dụng chống oxy hóa, độc tính

tế bào, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng viêm

- Nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết tiềm năng có tác dụng tốt trên các mô hình

in vitro, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất chính.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Theo hệ thống phân loại của A.Takhtajan (2009) [61], vị trí của chi Jasminanthes

trong hệ thống phân loại của thực vật có hoa như sau:

Giới Thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)

Bộ Trúc đào (Apocynales)

Họ Trúc đào (Apocynaceae)Phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae)Tông Marsdenieae

Chi Jasminanthes Jasminanthes (Apocynaceae, Asclepiadoideae, Marsdenieae) [26] là một chi gồm

tám loài được tìm thấy ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Đông Nam Á và

Sundaland Jasminanthes chunii và J saxatilis là loài đặc hữu của Trung Quốc, J pilosa được tìm thấy ở Trung Quốc và Thái Lan, J mucronata có khu vực phân bố rộng từ miền nam Trung Quốc đến Nhật Bản [30], [42] Loài J suaveolens được tìm thấy tại Java và Borneo [62] J xuanlienensis được công bố gần đây là loài đặc hữu của Việt Nam [62] Năm 2019, thêm một loài mới được tìm thấy ở Lào là J laotica

[23]

Năm 1995, các loài thuộc chi Jasminanthes được tách riêng từ chi Stephanotis, vốn

đặc hữu cho nhiều loài ở vùng Madagascar [30], [27] Thông tin các loài trong chi

Jasminanthes được nêu trong Bảng 1.1 [51].

Ở Việt Nam không có loài Jasminanthes nào được ghi nhận cho đến năm 2016 khi J xuanlienensis được công bố Nghiên cứu thực địa sâu hơn ở Việt Nam đã phát hiện

thêm nhiều loài thuộc họ Apocynaceae chưa định danh Một mẫu thu thập từ khu bảo

tồn thiên nhiên Kon Chu Rang (Việt Nam, tỉnh Gia Lai) đã được xác định là J pilosa.

Một mẫu khác từ núi Đá Bia (Việt Nam, tỉnh Phú Yên) được nhóm nghiên cứu xác

định là một loài mới và công bố với tên Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda

Apocynaceae, Asclepiadoideae [37]

Bảng 1-1: Danh sách các loài thuộc chi Jasminanthes [27], [30], [51]

1 Jasminanthes chunii (Tsiang)

W.D.Stevens & P.T.Li

Marsdenia chunii (Tsiang) P.I.Forst.

Stephanotis chunii Tsiang

2 Jasminanthes mucronata

(Blanco) W.D.Stevens & P.T.Li

Apocynum mucronatum Blanco Marsdenia chinensis (Champ ex Benth.)

P.I.Forst

Stephanotis chinensis Champ ex Benth.

Stephanotis lutchuensis Koidz.

Stephanotis mucronata (Blanco) Merr.

Toxocarpus mucronatus (Blanco) Woodson

3 Jasminanthes pilosa (Kerr)

W.D.Stevens & P.T.Li

Huthamnus sinicus Tsiang Marsdenia pilosa (Kerr) P.I.Forst.

Stephanotis pilosa Kerr

4 Jasminanthes saxatilis

(Y.Tsiang & P.T.Li)W.D.Stevens & P.T.Li

Stephanotis saxatilis Y.Tsiang & P.T.Li

5 Jasminanthes suaveolens Blume Marsdenia jasminoides P.I.Forst.

Stephanotis suaveolens (Blume) K.Schum.

6 Jasminanthes tuyetanhiae

T.B.Tran & Rodda

Telosma procumbens (Blanco) Merr.

7 Jasminanthes xuanlienensis

T.B.Tran & Rodda

8 Jasminanthes laotica Y.H Tan

& H.B Ding

Dây leo, dài đến 10 m Thân gồm nhiều lóng, mỗi lóng dài 3-6 cm, nhẵn, đường kính 3,1-5 mm Lá đơn, cuống dài 8,3-11,2 mm, đường kính 2,1-3,2 mm, nhẵn hoặc rãi

rác lông mịn, có nhiều nốt sần xám nhạt; phiến lá hình trứng, dài 6,9-9 cm, rộng 4,5 cm, mỏng, lồi, nhẵn; đầu thuôn nhọn 0,6-1 cm; gốc hình tim; gân bên 5-7 cặp;

3-gốc lá có 9 – 11 tuyến Cụm hoa xim co, dạng tán, lên đến 10 hoa; cuống cụm hoa 0-2 cm, đường kính 2,4 mm, nhẵn Lá bắc hẹp hoặc thon hẹp, kích thước 3-4,5 x

khoảng 1 mm, nhẵn Cuống hoa 5,6-7 mm, đường kính 1,6-2,3 mm, nhẵn Nụ hoa

ngay trước khi nở dài 9,7-12,6 mm, đường kính 3-4 mm Lá đài 5, xếp chồng lên

nhau ở gốc, màu xanh lục hơi vàng, hình trứng hay tam giác 5,1-7,7 x 3,6-4,4 mm,nhẵn, đầu nhọn; giữa các lá đài có các tuyến xen giữa, hình nón 0,15-0,19 x 0,12-0,15

mm Cánh hoa 5, tràng hình đinh, đường kính 16-18 mm; các cánh hoa dính nhau

phía dưới tạo thành ống hình trụ, dài 5,6-7,4 mm, rộng 4-5 mm; bên ngoài và bêntrong màu trắng hơi xanh ở gốc, nhẵn, có 5 cặp đường dọc màu nâu dài 3,3-3,8 mm;thùy hình trứng đầu hơi nhọn 8-10 x 4,7-5 mm, gốc bất đối xứng, bên trái thẳng, bênphải có tai nhỏ, đỉnh bất đối xứng , màu trắng, nhẵn Cuống nhị nhụy cao 4 mm, rộng

2,8 mm Tràng phụ rất nhỏ, gắn với cuống nhị nhụy theo chiều dọc, cao 4,8 mm,

rộng 3 mm, màu xanh hơi vàng, nhẵn Nhịgồm 5 thùy mập xen kẻ với cánh hoa vàđính vào gốc ống tràng, dài 3,5-4,5 mm, rộng 1,5 mm, rãnh dài 2,4-2,7 mm Phấn khối hình elip 0,08-0,1 x 0,19-0,25 mm, màu vàng; vĩ phấn hình tam giác 0,08-0,1 x

0,1-0,15 mm, trong suốt; chung đới hình bầu dục 0,37-0,41 x 0,19-0,21 mm, màu nâusẫm Đầu nhị có phụ bộ hình elip 2 x 1 mm, màu trắng, dính nhau thành ống hình trụ

đầu tròn, cao 1,78-1,86, rộng 1,12-1,25 mm Bộ nhụy bầu 2 ô, đính noãn trung trụ;

lá noãn hình trụ, dài 1,43-1,99 mm, rộng 1,44-1,63 mm, nhẵn Quả và hạt không đượcquan sát [37]

Hình 1-1: Vùng sinh thái núi Đá Bia và hình thái của Jasminanthes tuyetanhiae [37]

A-C: Môi trường sống D: Cành mang hoa E: Hoa đang nở

D và E: chụp từ mẫu gốc

trước khi ép tiêu bản

Hình 1-2: Các bộ phận của hoa Jasminanthes tuyetanhiae [37]

Hình 1-3: Jasminanthes tuyetanhiae (hình vẽ bởi Lê Kim Chi) [37]

A: Nụ hoa - B: Hoa bắt đầu nở C: Hoa - D: Đài và bầu nhụy E: Tràng hoa mặt ngoài.

F: Tràng hoa mặt trong với 5 cặp

đường dọc màu nâu

G: Đường dọc màu nâu bên trong

E Tràng hoa mặt trong với 5 cặp

đường dọc màu nâu

F: Cuống nhị nhụy.

G: Phấn khối.

H: Bầu và kiểu nhụy - I: Bầu.

1.2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC LOÀI

THUỘC CHI JASMINANTHES

Trong 8 loài thuộc chi Jasminanthes, chỉ có 2 loài J mucronata và J.tuyetanhiae có

các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học Các nghiên cứu thực hiện trên thân

và rễ dược liệu cho thấy thành phần hóa học chính của chi Jasminanthes là các hợp

chất có cấu trúc khung C21 steroid glycosid và oleanan saponin, không có công bốnào về các nhóm hợp chất khác; C21 steroid glycosid là nhóm hợp chất phổ biến trongcác cây thuộc họ Apocynaceae [71]

Năm 1995, các loài thuộc chi Jasminanthes được tách riêng từ chi Stephanotis [30], tuy nhiên các nghiên cứu thành phần hóa học của J mucronata vẫn thực hiện dưới tên khoa học cũ là Stephanotis mucronata (Blanco) Merr Asclepiadaceae Theo

những công trình đã được công bố từ năm 2005 đến năm 2018, thành phần hóa học

của Jasminanthes (Stephanotis) mucronata bao gồm các nhóm hợp chất chính như

C21 steroid glycosid và oleanan saponin, phân loại thành các hợp chất Mucronatosid(M), Stemucronatosid (SM), Stephanosid (ST), Sinomarinosid (SN) và Sitakisosid(S)

KH Tên chất Cấu trúc Bộ

phận TLTK

-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl- β-D allopyranosyl-(1→4)- β-D- cymaropyranosyl-(1→4)-

-β-D cymaropyranoside

Phânđoạn

thân

[13],[44]

-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D -allopyranosyl-(1→4)-

β-D-cymaropyranosyl-(1→4)- β-D cymaropyranosid

Phânđoạn

thân

[13],[44]

12-O-cinnamoyl-20-O-tigloyl(20S)-pregn-6-ene-3 β, 5α,8 β,12β,14β,17β,20-heptanol 3-O-β-D

-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl- β-D allopyranosyl-(1→4)- β-D -cymaropyranosyl-(1→4)-

-β-D- cymaropyranosid

12-O-cinnamoyl-20-O-acetyl(20S)-pregn-6-ene-3 β, 5α,8 β,12β,14β,17β,20-heptanol 3-O- β-D thevetopyranosyl-(1→4)- β-D -cymaropyranosyl- (1→4)- β-D -cymaropyranosid

-Hình 1-4: Cấu trúc các hợp chất Mucronatosid

Các hợp chất Stemucronatosid

Bảng 1-3: Các hợp chất Stemucronatosid

phận TLTK SM1 Stemucronatosid A 12-O-deacetylmetaplexigenin 3-O-6-deoxy-3-O-

methyl- cymaropyranosyl-(1→4)-β-Dcymaropyranosid

β-D-allopyranosyl-(1→4)-O-β-D-Phânđoạn

cymaropyranosyl-SM3 Stemucronatosid C metaplexigenin 3-O- β-D-glucopyranosyl

(1→4)O6deoxy3OmethylβD allopyranosyl (1→4)-O- β-D-cymaropyranosyl (1→4)- β-D- cymaropyranosid

-SM4 Stemucronatosid D 20-O-tigloylsarcostin 3-O- β-D thevetopyranosyl

(1→4)- β-D cymaropyranosyl (1→4)- cymaropyranosid

β-D-Phânđoạn

SM6 Stemucronatosid F rostratamine 3-O-D-thevetopyranosyl (1→4)-

β-D-cymaropyranosyl (1→4)- β-D-cymaropyranosid

SM7 Stemucronatosid G isokidjoladinin 3-O- β-D-glucopyranosyl

(1→4)-β-D 6-deoxy-3-O-methyl- (1→4)-β-D-dallopyranosyl

(1→4)- cymaropyranosyl (1→4)- cymaropyranosid

β-D-SMH Stemucronatosid H mucronatin

3-O-D-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl- D-allopyranosyl-(1→4)- D-cymaropyranosyl-(1→4)- β-D cymaropyranosid

β-Phânđoạn

3-O-β-D-thevetopyranosyl-(1→4)- (1→4)- β-D cymaropyranosid

β-D-cymaropyranosyl-KH Tên chất Cấu trúc Bộ

phận TLTK SMK Stemucronatosid K 12-O-acetyl-20-O-(N-methyl) anthraniloyl

sarcostin deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl- (1→4)-β- D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-6-Phânđoạn

[74]

Hình 1-6: Cấu trúc các hợp chất Stephanosid

Các hợp chất C 21 steroid aglycon

Stephanthranilin A (STA) được phân lập từ thân cây J mucronata, là phần aglycon

của Stephanosid E và Stemucronatosid K sau khi thủy phân nhẹ trong môi trườngacid STA có khung steroid tương tự progesteron và glucocorticoid, điểm khác biệttrong cấu trúc là 2 nhóm keto ở C-3 và nhóm thế C-17 Các nhóm keto này đã đượcchứng minh là vị trí gắn kết chính với các thụ thể của progesteron và glucocorticoid[11], [66] Khác biệt tiếp theo so với hormon steroid là nhóm hydroxy ở C-8 và C-14,nhóm acetyl ở C-12 và (N-methyl) anthraniloyl ở nhóm thế C-17

[34]

SA2 12-O-tigloyl-20-O-tigloylsarcostin

Hình 1-7: Cấu trúc các hợp chất C21 steroid aglycon

Hình 1-8: Cấu trúc các hợp chất pregnan glycosid

Các hợp chất oleanan saponin

Nhóm tác giả sử dụng hệ thống LC/ESI-MSn nghiên cứu thành phần saponin có trong

rễ Stephanotis mucronata, kết quả xác định được12 saponin chia thành hai nhóm (bốn

cấu trúc saponin xác thực và tám cấu trúc saponin đề xuất) [19]

Các hợp chất S-4, 6, 7 và 12 được xác định tên sitakisosid VII, sitakisosid VI,sitakisosid II and sitakisosid I Các saponin còn lại có công thức hóa học được liệt kêtrong Bảng 1-8

Bảng 1-8: Các hợp chất oleanan saponin

phận TLTK S-1 3-O- β-D -xylopyrnosyl (1→6)- β-D -glucopyranosyl

methylanthranilyl) - β-D -glucopyranosyl marsglobiferin

Hình 1-9: Cấu trúc các hợp chất oleanan saponin

Từ năm 2000 đến 2020, chỉ có hai nghiên cứu thành phần hóa học liên quan đếnCTĐB được công bố Trước khi được định danh lại vào năm 2018, các tài liệu về

CTĐB tại Việt Nam đều sử dụng tên khoa học Telosma procumbens (Blanco) Merr.

Asclepiadaceae [2], [4] Nghiên cứu của Võ Duy Huấn và cộng sự (2001) [38] trên

thân CTĐB Telosma procumbens đã phân lập 20 hợp chất có trong CTĐB thuộc

nhóm pregnan glycosid và đặt tên là Telosmosid A1 – A20, trong đó Telosmosid A15

có độ ngọt gấp 1000 lần so với đường sucrose Năm 2020, Hòa Thắm và cộng sự [50]phân lập Telosmosid A21 từ rễ Jasminanthes tuyetanhiae.

Các hợp chất Telosmosid (Hình 1-10) có cùng khung cấu trúc pregnan với 21 carbon,

2 nhánh thế thay đổi gắn vào vị trí C-12 và C-20, mạch đường dài (từ 3 đến 6 đơn vịđường) gồm các đường 6-deoxy hoặc 2,6-deoxy như D-cymarose (Cym), D-oleandrose (Ole), D-digitoxose (Dig), D-thevetose (The), 6-deoxy-3-O-methyl-D-allose (Alm) và D-glucose (Glc)

Điểm khác biệt của Telosmosid so với các nhóm hợp chất C21 steroid glycosid đã

công bố trong J mucronata là thiếu một nhóm OH gắn ở vị trí C-8, mạch đường cũng dài hơn so với J mucronata chỉ từ 3 – 4 đơn vị đường 6-deoxy hoặc 2,6-deoxy.

Tên chất R1 R2

Hình 1-10: Cấu trúc các hợp chất Telosmosid

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES

Các hợp chất C21 steroid glycosid, thành phần hóa học chính trong chi Jasminanthes,

đã được nghiên cứu trên các cây khác cùng họ Apocynaceae có tác động chống ungthư, chống động kinh và chống đông máu [36], [49], [58], [75] Trong các loài thuộc

chi Jasminanthes, chỉ có J.mucronata có các nghiên cứu về hoạt tính sinh học, chủ yếu là tác động điều hòa miễn dịch in vitro và các tác động liên quan đến ức chế miễn dịch in vivo.

Các hợp chất được phân lập từ thân và rễ J mucronata, sau khi xác định cấu trúc đã tiến hành thử nghiệm tác động sinh học in vitro và in vivo.

Tác động điều hòa và ức chế miễn dịch in vitro

Mitogen thường được sử dụng để kích thích tế bào lympho với mục đích đánh giáchức năng miễn dịch của chất cần nghiên cứu Nhóm tác giả sử dụng Concanavalin

A (ConA) và Lipopolysaccharid (LPS) để kích thích tăng sinh Lympho bào T và Bcủa tế bào lách chuột, khả năng tồn tại của tế bào được xác định bằng phương phápMTT

Các hợp chất Mucronatosid [13], [44]: M6 và M8 có tác động ức chế miễn dịch phụ

thuộc vào liều, ngược lại M5 và M7 làm tăng cường tác động tăng sinh tế bào củaConA và LPS Không có sự khác biệt đáng kể về tác động ức chế tăng sinh tế bàolách chuột giữa mẫu chứng Cyclosporin A (CsA), M6 và M8 ở nồng độ 1 µg/ml CsAgây độc tế bào ở nồng độ 10 µg/ml, trong khi hợp chất M6 và M8 không có ảnh hưởngđến sự tăng trưởng tế bào lách của chuột ở cùng nồng độ Hiệu quả ức chế tăng sinh

tế bào kích thích bằng mitogen của M6 và M8 ở nồng độ 10 µg/ml có ý nghĩa hơn sovới CsA ở nồng độ 1 µg/ml (P <0,05)

Các hợp chất Stemucronatosid [43], [70], [71]: Kết quả cho thấy các hợp chất SM4,

SM5, SM7, SMJ có tác động ức chế miễn dịch phụ thuộc vào liều, trong khi hợp chất

SM1-3, SM6, SMH, SMI có tác động điều hòa miễn dịch, riêng SM6, SMH, SMI ởnồng độ 0,01 – 10 µg/ml làm tăng cường tác động tăng sinh tế bào của Con A và LPS

Các hợp chất pregnan glycosid khác [68]: PG1 và PG2 có tác động ức chế miễn dịch

phụ thuộc vào liều, không có sự khác biệt đáng kể về hiệu quả ức chế tăng sinh tế bàokích thích bởi LPS giữa nhóm chứng CsA so với PG1 ở nồng độ 0,1 và 1 µg/ml.Trong khi đó hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào kích thích bởi ConA của PG1, PG2 vàhiệu quả ức chế tăng sinh tế bào kích thích bởi LPS của PG2 ít có ý nghĩa hơn CsA ởcùng nồng độ (P <0,05)

Tác động in vitro và in vivo của Stemucronatosid K (SMK)

Nhóm tác giả đã thử nghiệm tác động ức chế miễn dịch của SMK trên cả in vitro và

in vivo [69] SMK ức chế có ý nghĩa khả năng tăng sinh tế bào in vitro kích thích bởi

ConA, LPS phụ thuộc vào nồng độ so với nhóm chứng CsA

Thử nghiệm in vivo tiến hành trên chuột ICR được tiêm dưới da Ovalbumin (OVA)

ngày đầu tiên và tiêm phúc mô SMK với liều 2.5, 5, và 10 mg/kg, mỗi ngày 1 lầntrong 10 ngày 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng, đánh giá khả năng tăng sinh tế bào kíchthích bởi mitogen và OVA, nồng độ các loại cytokin trong tế bào lách chuột, khángthể đặc hiệu trong huyết thanh Kết quả định lượng kháng thể IgG, IgG1 và IgG2bđặc hiệu với OVA giảm đáng kể so với nhóm chứng SMK cũng làm giảm đáng kểnồng độ các cytokine được kích thích bởi OVA gồm interleukin-2 (IL-2), interferon-

γ (IFN-γ), and IL-4 từ tế bào lách của chuột được chủng ngừa bằng OVA

Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng SMK có thể ngăn chặn phản ứng miễn dịch

tế bào và miễn dịch thể dịch

SMK cũng đã được chứng minh là ức chế đáng kể giai đoạn sớm của viêm nguyênphát cục bộ và viêm mạn tính, làm giảm sưng tấy ở bàn chân trước và các hạch ở đuôitrong thử nghiệm gây viêm khớp bằng thuốc ở chuột [68]

SMK được xác định là có tác dụng điều trị hiệu quả trên chuột bị gây viêm khớp vàchống thải ghép da ở chuột [76].

1.3.1.1 Tác động in vitro của Stemucronatoside L

Hệ thống miễn dịch của cơ thể bao gồm các tế bào trình diện kháng nguyên, lymphobào T và B Trong đó các lympho T, đặc biệt là CD4+, đóng vai trò quan trọng trong

sự hình thành và tiến triển các bệnh tự miễn ở người như viêm khớp dạng thấp, hensuyễn do dị ứng, đa xơ cứng và lupus ban đỏ hệ thống

Nhóm tác giả nghiên cứu cơ chế tế bào của Stemucronatoside L (SML) trong việc ứcchế phản ứng miễn dịch thông qua T helper lymphocyte type 1(Th1) và Th2 [18] Tácđộng của SML đối với các tế bào lympho T và việc sản xuất các cytokine Th1 (IL-2,IFN-γ), các cytokine Th2 (IL-4, IL-10) thu thập từ tế bào lách chuột gây kích thíchbởi ConA được đánh giá bằng phương pháp phân tích flow-cytometric và phươngpháp ELISA Ảnh hưởng của SML đến mức độ phiên mã gen mARN Th1/Th2cytokine, các yếu tố phiên mã T-bet và GATA-3 đã được đánh giá bằng phân tíchRT-PCR

Kết quả nghiên cứu cho thấy SML không chỉ làm giảm đáng kể tỉ lệ phần trăm tế bàolympho T CD4+ và tỷ số giữa CD4+/ CD8+, mà còn giảm sản xuất các cytokinTh1/Th2 phụ thuộc vào nồng độ SML sử dụng so với nhóm chứng ConA Mức độphiên mã mRNA Th1/Th2 cytokin và các yếu tố phiên mã (T-bet, GATA-3) cũng bị

ức chế bởi SML Nghiên cứu đã chứng minh SML có thể ức chế đồng thời phản ứngmiễn dịch Th1/Th2 bằng cách ngăn chặn sự biểu hiện gen của các Th1/Th2 cytokin

và các yếu tố phiên mã

1.3.1.2 Tác dụng dược lý (in vitro và in vivo) của Stephanthranilin A

Stephanthranilin A (STA) là phần aglycon của Stephanosid E (STE) vàStemucronatosid K (SMK) sau khi thủy phân nhẹ trong môi trường acid Trongnghiên cứu năm 2010, nhóm tác giả thực hiện lại các phương pháp như đã tiến hành

với SML với mục tiêu đánh giá về tiềm năng ức chế miễn dịch in vitro thông qua

Th1/Th2 và ảnh hưởng của chuỗi đường C-3 đến hoạt tính của STE và STA [16] Kếtquả cho thấy STE và STA ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào lách kích thích bởi

ConA và LPS, làm giảm sản xuất các Th1/Th2 cytokine (IL-2, IFN-γ, IL-4 và IL-10)

từ các tế bào lách được kích thích bởi ConA phụ thuộc nồng độ chất thử nghiệm Mức

độ phiên mã mRNA Th1/Th2 cytokine (IL-2, IFN-γ, IL-4 và IL-10) và các yếu tốphiên mã (T-bet và GATA-3) trong tế bào lách kích thích Con A cũng bị ức chế bởi

STE và STA Tác động trên đáp ứng miễn dịch thông qua Th1/Th2 in vitro của STA

mạnh hơn so với STE Những phát hiện này cho thấy STE và STA có thể ức chế phảnứng miễn dịch thông qua Th1/Th2 và sự liên kết glycosyl tại vị trí C-3 của STA có

thể làm giảm hoạt động ức chế miễn dịch in vitro.

Năm 2012, nhóm tác giả công bố nghiên cứu khả năng của STA trong việc ức chế

tăng sinh và hoạt động của lympho T in vivo và in vitro [17].

In vitro: cơ chế hoạt động ức chế miễn dịch của STA được chứng minh độc lập với

thụ thể glucocorticoid, thử nghiệm sử dụng RU486 (chất đối kháng thụ thểglucocorticoid) bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào lách kích thích bởi ConA,chứng âm CsA và chứng dương dexamethason, kết quả STA không làm giảm sự tăngsinh tế bào lymphoT STA ức chế tăng sinh lympho T được kích thích bởi CD3/CD28liên kết chéo hoặc ConA, các tế bào T CD4+ nhạy cảm hơn so với tế bào T CD8+, cơchế là do STA thúc đẩy chu kì của tế bào ở giai đoạn G0/G1 nhưng không gây raapoptosis, các gen mã hóa dẫn truyền tín hiệu trong lympho T cũng được kích hoạt

In vivo: tác dụng ức chế của STA đối với chức năng lympho T lần đầu tiên được đánh

giá trong mô hình đáp ứng quá mẫn loại trung gian tế bào ở chuột (delayed-typehypersensitivity = DTH) Trong mô hình DTH, Th1 cytokin (IFN-γ, IL-12) là cáccytokin chiếm ưu thế và chủ yếu các tế bào cảm ứng là T CD4+ [40] STA dùng đườnguống cho thấy tác dụng ức chế miễn dịch đối với chuột thử nghiệm Hơn nữa, thuốc

ức chế miễn dịch này không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể và các cơ quan chuột.Năm 2016: nhóm tác giả công bố nghiên cứu STA điều trị viêm gan miễn dịch trunggian tế bào T CD4+ thông qua suy giảm chức năng PKCθ [15] Mục đích của nghiên

cứu này là đánh giá thêm hoạt động ức chế miễn dịch in vivo của STA và làm sáng

tỏ các cơ chế tiềm năng Kết quả cho thấy điều trị ban đầu với STA làm giảm đáng

kể viêm gan do ConA và giảm kích hoạt tế bào T CD4+ trong mô gan ở chuột STA

trực tiếp ngăn chặn sự tăng sinh của các tế bào T CD4+ và ức chế các tầng tín hiệu

NFAT, NFκB và MAPK trong các tế bào T CD4+ in vitro, cơ chế tác động cơ bản

không phụ thuộc vào tín hiệu receptor trên tế bào T và con đường độc lập của kênh

Ca+ Các nghiên cứu lắp ghép phân tử dự đoán rằng STA có thể liên kết chặt chẽ vớiPKCθ thông qua năm liên kết hydro, từ đó ức chế trực tiếp hoạt động PKCθ kinase

và sự phosphoryl hóa trong các tế bào T CD4+ hoạt hóa in vitro.

Bảng 1-9: Tổng hợp hoạt tính sinh học các hợp chất trong Jasminanthes mucronata

Ức chế miễn dịch

Điều hòa miễn dịch

Tăng cường miễn dịch

OVA Kháng

viêm

Chống thải ghép

DTH

Viêm gan ở chuột

Chống trầm cảm

[44][13]

Tác động chống trầm cảm in vivo

Hai hợp chất C21 steroid aglycon mới được phân lập từ dịch thủy phân EtOAc rễ

Stephanotis mucronata [34] được thử nghiệm hoạt tính chống trầm cảm bằng phương

pháp kiểm tra bơi bắt buộc ở chuột [52], so sánh với nhóm chứng và nhóm chứng dương fluoxetin Kết quả cho thấy cả hai hợp chất có tiềm năng trong điều trị bệnh trầm cảm

Cho đến năm 2020, vẫn chưa có các nghiên cứu về tác dụng dược lý thực hiện trên

Jasminanthes tuyetanhiae được công bố

Tại Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian từ các lương y địa phương, thân và rễ J tuyetanhiae được sử dụng để chữa ho và thay thế cam thảo bắc trong các bài thuốc y

học cổ truyền

Ở Trung Quốc, thân và rễ phơi sấy khô của J mucronata được sử dụng trong các bài

thuốc y học cổ truyền miền Nam Trung Hoa để điều trị viêm khớp dạng thấp và giảm đau khớp [10]

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO

Khái niệm về stress oxy hóa

Oxy hóa không thể thiếu được với vi sinh vật ái khí Khoảng vài thập niên gần đây, các thành tựu khoa học đã chứng minh rằng oxy vào cơ thể tham giá nhiều quá trình sinh hóa học Trong các quá trình đó, oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do

Từ đầu những năm 70 I.W.Fridovich đã nhận thấy rằng khi nhận một điện tử đầu tiên, oxy tạo ra gốc superoxyd Đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào Từ gốc superoxyd (O2.−) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng

cao được tạo ra như: HO (gốc hydroxyl), H2O2, 1O2 (oxy đơn bội), LO. (gốc lipoxyd), LOO.(gốc lipoperoxyd), LOOH Tên chung các gốc là các dạng oxy hoạt động [32] Các nhà khoa học cũng phát hiện rằng sự sản sinh ra nhiều dạng oxy hoạt động cũng

có thể được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa (antioxidant) tự nhiên trong cơ thể Tiêu biểu là enzym superoxyd dismutase (SOD), glutathion (GSH), enzym glutathion peroxydase (GSH.Px), enzym catalase và phân tử nhỏ như tocopherol, ascorbat [14] Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa, đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi (homeostasis) Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cho cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý này được gọi là stress oxy hóa Hay nói một cách khác, stress oxy hóa là sự rối lọan cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các oxy hóa [29]

Trong cơ thể, những gốc của oxy hóa rất không bền Đó là các gốc O2.− (superoxyd);

HO. (gốc hydroxyl); RO. (gốc alkoxyd); LO. (gốc lipoxyd); LOO. (gốc lipoperoxyd) Các gốc bền là các gốc có cấu trúc semiquinon như gốc của vitamin E (tocopheryl), vitamin C (ascorbyl)

Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể

Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra do các phản ứng chuyển nhường điện tử Những phản ứng này có thể được thực hiện bởi enzym hoặc không enzym, thông qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp

Ðể nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một số

phương pháp sau:

Phương pháp DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng =517 nm [22]

Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity)

Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Ðánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc Hoạt tính chống oxy hóa đuợc thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe2+ và 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt Fe2+) [22]

Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd 𝑶𝟐∗ −

Ðánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2.− Gốc superoxyd đuợc tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ đuợc định luợng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức chất có màu tím đuợc đo ở buớc song  = 550nm Hoạt tính của mẫu thử đuợc thể hiện qua việc giảm sự hình

thành phức màu tím [22]

Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H 2 O 2

Hai tiểu phân O2.− và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng

độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2 , HO. là phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử đuợc thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ

phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase từ cải gia vị horseradish)

Trong các phương pháp nêu trên thì phương pháp sử dụng DPPH

(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) thường được ứng dụng để thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro [3]

Hiện nay các nghiên cứu tác dụng độc tính tế bào ung thư thường sử dụng hai phương pháp là MTT và SRB

Phương pháp MTT

Phương pháp MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazol bromid là một loại muối tetrazolium được sử dụng phổ biến để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót

và khả năng phát triển của tế bào động vật Vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của

tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng

= 570nm [48]

+ N N

S N

N

N N

S N

cellular reductase

Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím)

Phương pháp SRB

Phép thử SRB (Sulforhodamin B) được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm

1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm