Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Lục thảo hoa thưa (Chlophytum laxum R. Br.), họ Lục thảo (Anthericaceae)

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Lục thảo hoa thưa (Chlophytum laxum R. Br.), họ Lục thảo (Anthericaceae)

Trường đại học dược hμ nội

Nguyễn thị hoμi

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thμnh phần hoá học vμ một số tác dụng sinh học của cây lục

thảo hoa thưa (Chlorophytum laxum R Br.),

họ lục thảo (Anthericaceae)

Chuyên ngành: dược liệu - dược học cổ truYền

Mã số: 62.73.10.01

Tóm tắt Luận án tiến sĩ dược học

Hμ nội - 2008

Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Y - Dược Huế, Viện

Khoa học - Công nghệ Việt Nam, Viện Dược liệu

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Thanh Kỳ

Phản biện 1: GS TSKH Phan Tống Sơn

Phản biện 2: GS TSKH Hoàng Tích Huyền

Phản biện 3: GS TS Lã Đình Mỡi

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp nhà nước

họp tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Vào hồi 8 giờ, ngày 04 tháng 8 năm 2008

Có thể tìm đọc luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Hà Nội

- Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội

- Thư viện Trường Đại học Y - Dược Huế

các công trình đ∙ công bố liên quan đến luận án

1 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm (2007), Các hợp chất flavonoid từ cây Lục thảo hoa thưa

(Chlorophytum laxum R Br Anthericaceae), Tạp chí dược học, số

372, tr 29-32

2 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm (2007), Nghiên cứu thành phần hoá học rễ cây Lục thảo hoa

thưa, Tạp chí dược liệu, tập 12, số 3+4, tr 95-100

3 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ (2007), Nghiên cứu đặc điểm

thực vật cây Lục thảo hoa thưa Chlorophytum laxum R Br., Tạp chí

dược học, số 376, tr 9-11

4 Nguyen Thi Hoai, Pham Thanh Ky, Chau Van Minh, Phan Van Kiem (2007), A new derivative of furancarboxaldehyde from

Chlorophytum laxum R Br (Anthericaceae), Tạp chí hóa học, tập

45, số đặc biệt, tr.131-135

5 Nguyễn Thị Hoài, Phạm Thanh Kỳ (2008), Nghiên cứu độc tính cấp

và tác dụng gây độc tế bào của rễ cây Lục thảo hoa thưa

(Chlorophytum laxum R Br., Anthericaceae), Tạp chí thông tin y

dược, số 4, tr 31-34

• Đã xác định hàm lượng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd trong

phân đoạn chiết bằng cloroform ở rễ là 14,88% và trong rễ khô là 0,17%

3 Về tác dụng sinh học

• ở liều uống 120g dược liệu/kg chuột, cao gấp 34 và 51 lần so với liều dùng

là rễ và lá khô theo kinh nghiệm của người dân địa phương không gây ra

các biểu hiện bất thường và không gây chết chuột nhắt trắng thí nghiệm

trong 72 giờ theo dõi, do đó không xác định được LD50

• Hợp chất 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd ức chế 9 chủng vi khuẩn

thử nghiệm ở nồng độ 500μcg/ml Cũng ở nồng độ này Cirsiumaldehyd

và Chlorophaldehyd [= 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] ức chế 6

và 7 chủng vi khuẩn thử nghiệm

• Hợp chất 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd, Cirsiumaldehyd và

Chlorophaldehyd [= 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] không có

hoạt tính kháng nấm Candida albicans và Aspergilus niger

• Cao nước (1:1) của lá và rễ cây Lục thảo hoa thưa có tác dụng làm tăng cân

nhưng không thể hiện tác dụng tăng lực trong nghiệm pháp chuột bơi

cưỡng bức với liều thí nghiệm

• Hợp chất Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid có tác dụng chống oxy hoá

trên hệ DPPH với 55,57 ± 0,2% khả năng quét gốc tự do ở giá trị IC50

bằng 39,33μg/ml

• Methyl caffeat có khả năng gây độc cho dòng tế bào ung thư gan, ung thư

màng tim và ung thư phổi trong thử nghiệm invitro với giá trị IC50lần lượt

là 0,19, 0,55 và 2,6μg/ml và phần trăm tế bào sống sót sau thử nghiệm là

0,00, 12,9 và 33,9% Hợp chất 1,2-Di-O-(9Z,12Z-octade

catrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol có tác dụng với giá trị IC50 là 1,4 và

1,33μg/ml và phần trăm tế bào sống sót sau thử nghiệm là 10,8 và 12,4%

đối với tế bào ung thư gan và ung thư màng tim

• Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu về độc tính bán trường diễn và tác dụng

sinh học để giải thích đầy đủ hơn cách sử dụng của nhân dân địa phương

cho phụ nữ sau khi sinh và nghiên cứu sâu hơn về tác dụng ức chế tế bào

ung thư của các hợp chất phân lập được từ dược liệu

A Giới thiệu luận án

1 Đặt vấn đề

Nước ta có nguồn dược liệu vô cùng phong phú, tri thức sử dụng cây thuốc của nhân dân ta cũng rất đa dạng, đặc biệt là tri thức sử dụng cây thuốc bản địa của đồng bào dân tộc ít người Lục thảo hoa thưa (Chlorophytum

laxum R Br.) thuộc họ Lục thảo (Anthericaceae) (tên địa phương gọi là ngải)

là cây thuốc được đồng bào dân tộc Kà Tu, Tà ôi và Pa cô ở xã A Roàng, A

Đớt, huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế thường sử dụng cho phụ nữ sau khi sinh để phục hồi sức khỏe nhanh, sớm trở lại với công việc

Theo Võ Văn Chi, Lục thảo hoa thưa có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu thũng, chỉ thống, dùng trị rắn cắn, đòn ngã sưng đau Cho đến nay ở Việt Nam chưa thấy có công trình nghiên cứu nào

về cây Lục thảo hoa thưa Đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành

phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Lục thảo hoa thưa

(Chlorophytum laxum R Br.), họ Lục thảo (Anthericaceae).” đã được tiến

hành nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc, góp phần tạo nguồn dược liệu mới

2 Mục tiêu và nội dung của luận án:

2.1 Mục tiêu của luận án:

Xác định đặc điểm thực vật, định tên khoa học, nghiên cứu thành phần hóa

học và một số tác dụng sinh học của dược liệu nghiên cứu

2.2 Nội dung của luận án:

• Về thực vật:

o Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học của cây

nghiên cứu

o Xác định đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột của dược liệu

• Về thành phần hoá học:

o Định tính, định lượng 1 số nhóm chất trong dược liệu

o Chiết xuất, phân lập một số chất chính

o Xác định cấu trúc các chất phân lập được

• Về tác dụng sinh học:

o Xác định độc tính cấp

o Thử một số tác dụng sinh học: tác dụng kháng khuẩn, kháng

nấm, tăng lực, chống oxy hoá và gây độc tế bào

3 ý nghĩa của luận án:

Đây là lần đầu tiên cây Lục thảo hoa thưa mọc ở Việt Nam được

nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và tác dụng sinh học

- Xác định tên khoa học đã giúp cho các kết quả nghiên cứu về hoá học

và tác dụng sinh học được khẳng định rõ nguồn gốc

- Xác định các đặc điểm vi học góp phần nhận biết và tiêu chuẩn hoá

dược liệu

- Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học đã phát hiện những hợp chất

mới được phân lập từ tự nhiên và các hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ

loài Chlorophytum laxum R Br

- Kết quả nghiên cứu về độc tính và tác dụng sinh học chứng minh dược

liệu ít độc, đã góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng của người dân địa

phương và là cơ sở khoa học mở ra triển vọng nghiên cứu đầy đủ hơn để có

thể sử dụng rộng rãi dược liệu này trong cộng đồng

4 Những đóng góp của luận án:

4.1 Về thực vật: Đã xác định tên khoa học của cây nghiên cứu, mô tả chi tiết

đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học của dược liệu

4.2 Về hoá học:

- Đã xác định thành phần hoá học của rễ Lục thảo hoa thưa có các nhóm

chất: alcaloid, saponin, anthranoid, acid amin, tanin, phytosterol,

polysaccharid và chất béo; trong lá có: alcaloid, saponin, coumarin,

flavonoid, acid hữu cơ, carotenoid, acid amin, tanin, phytosterol và chất béo

- Đã định lượng 15 nguyên tố vô cơ có trong lá và rễ Lục thảo hoa thưa

- Đã phân lập và xác định cấu trúc được 14 chất, bao gồm 5 chất từ lá, 9 chất

từ rễ, một chất có ở cả lá và rễ, trong đó có:

+ 3 chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên là:

7-C-[β-D-

glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-6-O-β-D-glucopyranosyloxy-4',8-dihydroxyflavon; 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd;

β-sitosterol-3-O-(6'-O-hexadecanoyl)-β-D-galactopyranosid

kết luận

1 Về thực vật

- Đã xác định tên khoa học của cây Lục thảo hoa thưa thu hái ở A

Lưới (Thừa Thiên Huế) để nghiên cứu là Chlorophytum laxum R Br họ Lục

thảo (Anthericaceae)

- Đã xác định đặc điểm vi phẫu lá và rễ, đặc điểm bột phần trên mặt

đất và bột rễ cây Lục thảo hoa thưa

2 Về thành phần hóa học

• Đã xác định trong lá Lục thảo hoa thưa có: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, acid hữu cơ, carotenoid, acid amin, tanin, phytosterol, chất béo

và trong rễ có: alcaloid, saponin, anthranoid, acid amin, tanin, phytosterol, polysaccharid và chất béo

• Đã xác định 15 nguyên tố vô cơ có trong lá và rễ Lục thảo hoa thưa

• Đã phân lập được 5 chất từ lá Lục thảo hoa thưa, trong đó có:

ắ 1 chất mới lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên:

ƒ

7-C-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-6-O-β-D-glucopyranosyloxy-4',8-dihydroxyflavon (Laxuminosid)

ắ 4 chất lần đầu tiên phân lập từ Lục thảo hoa thưa: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid; L-rhamnopyranosid;

Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid; 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd

• Đã phân lập được 9 chất từ rễ Lục thảo hoa thưa, trong đó có:

ắ 2 chất mới lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên:

ƒ 5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd (Chlorophaldehyd)

ƒ β-sitosterol-3-O-(6'-O-hexadecanoyl)-β-D-galactopyranosid

(Laxosid)

ắ 7 chất lần đầu tiên phân lập từ Lục thảo hoa thưa: 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd; Cirsiumaldehyd hay bis(5-formylfurfuryl) ether; 1,5-Dihydroxy-3-hydroxymethylanthraquinon (ω-hydroxyziganein); Acid

chrysophanic; Stigmast-5-en-3β-ol; Methyl caffeat;

1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-galactopyranosylglycerol

Các kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học là những đóng góp

mới của luận án

4.3 Về tác dụng sinh học:

Kết quả thử độc tính cấp với liều cao nhất có thể cho chuột uống

được là 120g dược liệu/kg t.t.chuột, cao gấp 34 và 51 lần so với liều dùng là

rễ và lá khô theo kinh nghiệm của người dân địa phương nhưng không xác

định được LD50 của mẫu thử, cho thấy liều dùng theo kinh nghiệm người dân

là an toàn

Tác dụng kháng khuẩn được thử trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh

thường gặp Cả 3 dẫn chất của khung furan đều có khả năng ức chế sự phát

triển của vi khuẩn Kết quả cho thấy hợp chất có cấu trúc đơn giản nhất ức

chế nhiều chủng vi khuẩn nhất, chất có nhóm thế càng phức tạp thì tác dụng

ức chế trên số chủng vi khuẩn càng giảm Như vậy có thể thấy sự liên quan

giữa cấu trúc và tác dụng, cấu trúc cồng kềnh đã làm hạn chế khả năng ức

chế vi khuẩn của hợp chất thử Hợp chất 5 và 6 đã được biết với tác dụng ức

chế vi khuẩn lao, kết quả thí nghiệm đã chứng minh có tác dụng trên nhiều

chủng vi khuẩn khác, đây cũng là đóng góp mới của luận án

Tác dụng chống oxy hoá trên hệ DPPH, các flavonoid được phân lập

có tác dụng ở mức độ khác nhau Đây cũng là những đóng góp ban đầu về

tác chống oxy hóa của các chất tinh khiết phân lập được từ loài

Chlorophytum laxum R Br

Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào cũng phù hợp với công bố của

các tài liệu về khả năng ngăn chặn sự phát triển một số dòng tế bào ung thư

của methyl caffeat và

1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol Tuy nhiên thông báo cho biết về khả năng gây độc

cho các dòng ung thư bạch cầu, ung thư mô đại thực bào, kết quả nghiên cứu

của luận án đã chứng minh các hợp chất này có tác dụng trên các dòng tế

bào ung thư gan, ung thư màng tim và ung thư phổi

Tuy là sơ bộ nhưng đây cũng là những thông báo đầu tiên về tác

dụng sinh học của Lục thảo hoa thưa ở Việt Nam, đặc biệt tác dụng mới của

một số hợp chất đã phân lập ở dạng tinh khiết

+ 10 chất lần đầu tiên được phân lập từ Chlorophytum laxum R Br là: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid; Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid; Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid;

Cirsiumaldehyd hay bis(5-formylfurfuryl) ether; 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd; Acid chrysophanic; 1,5-dihydroxy-3-hydroxymethylanthraquinon hay ω-hydroxyziganein; Stigmast-5-en-3β-ol;

Methyl caffeat và

1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol

- Đã xác định hàm lượng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd trong phân

đoạn chiết bằng cloroform ở rễ là 14,88% và trong rễ khô là 0,17%

4.3 Về tác dụng sinh học: Thử độc tính cấp của lá và rễ Lục thảo hoa thưa ở

liều 120g dược liệu/kg t.t.chuột không thấy biểu hiện ngộ độc Cao nước lá

và rễ Lục thảo hoa thưa ở liều 10-20g dược liệu/kg t.t.chuột không thể hiện tác dụng tăng lực trong nghiệm pháp chuột bơi cưỡng bức Ba hợp chất tinh khiết phân lập từ Lục thảo hoa thưa ức chế 6-9 chủng vi khuẩn thử nghiệm

Một dẫn chất flavonoid (hợp chất 2) có khả năng chống oxy hoá trên hệ DPPH Hai hợp chất (hợp chất 8 và 10) có khả năng ức chế 2-3 dòng tế bào

ung thư thực nghiệm ở giá trị IC50 thấp Những kết quả trên là thông báo đầu tiên về tác dụng sinh học của Lục thảo hoa thưa, đặc biệt là tác dụng mới của một số hợp chất đã phân lập ở dạng tinh khiết

5 Bố cục của luận án:

Luận án có 122 trang, gồm 4 chương, 26 bảng, 34 hình, 120 tài liệu tham khảo và 15 phụ lục Các phần chính trong luận án: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (31 trang), nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (9 trang), kết quả thực nghiệm (61 trang), bàn luận (16 trang), kết luận và đề nghị (3 trang)

B Nội dung của luận án Chương 1: Tổng quan

Tập hợp và trình bày một cách hệ thống các kết quả nghiên cứu từ trước

đến nay về thực vật, thành phần hoá học và tác dụng sinh học của chi

Chlorophytum Ker-Gawl trên thế giới và ở Việt nam

Chương 2: Nguyên vật liệu vμ phương pháp

nghiên cứu

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu:

Lá và rễ cây Lục thảo hoa thưa, thu hái tại huyện A Lưới - tỉnh Thừa

Thiên Huế vào tháng 9-10 các năm 2004-2006, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ

600C Chuột nhắt trắng chủng Swiss, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ

sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Giống vi sinh vật kiểm định do Bộ môn Vi

sinh - Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp Các dòng tế bào ung

thư do Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên

- Viện Khoa học và Công nghệ cung cấp

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Thẩm định tên khoa học của cây nghiên cứu trên cơ sở phân tích đặc điểm

hình thái thực vật, so sánh với mẫu chuẩn lưu trữ và các tài liệu phân loại

thực vật

- Xác định đặc điểm rễ, lá và đặc điểm bột dược liệu bằng phương pháp hiển

vi

- Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học

- Định tính và định lượng các nguyên tố vô cơ theo phương pháp khối phổ

plasma cảm ứng

- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột dùng silicagel pha thường

(0,040-0,063mm, Merck), silicagel pha đảo YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical

Ltd.), Dianion HP-20, Sephadex LH20 và SKLM điều chế Theo dõi các

phân đoạn bằng SKLM

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý

và các phương pháp phổ: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ

cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều

- Định lượng thành phần chính trong cây bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC), tách trên cột Inertsilđ ODS-3 (cột silicagel pha đảo RP18)

- Thử độc tính cấp theo quy định 371 của Bộ Y tế và phương pháp cải tiến

của Litchfield – Wilcoxon

năng gây độc cho cả 3 dòng tế bào ung thư và hợp chất 10

[1,2-Di-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol] có khả

năng gây độc cho 2 dòng tế bào ung thư gan và ung thư màng tim Trong đó

hợp chất 8 gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư gan ở giá trị IC50 thấp (0,19μg/ml), còn giá trị IC50 đối với dòng tế bào ung thư màng tim và ung thư phổi là 0,55 và 2,6μg/ml, mức độ độc tế bào này là vừa phải khi so sánh với chất đối chứng ellipticin

Chương 4: Bμn luận về kết quả

4.1 Về thực vật:

- Việc mô tả chi tiết đặc điểm thực vật và đặc điểm vi học của dược liệu đã góp phần nhận biết và tiêu chuẩn hoá dược liệu

- Việc xác định tên khoa học của cây nghiên cứu đã giúp cho kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học được khẳng định về nguồn gốc nguyên liệu

4.2 Về thành phần hoá học:

- Kết quả của luận án đã xác định 10 nhóm chất hữu cơ có trong lá, 8 nhóm chất có trong rễ Lục thảo hoa thưa 15 nguyên tố vô cơ được xác định hàm lượng, các kim loại nặng có độc tính như As, Pb đều nằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn của WHO Sự có mặt của Se rất đáng quan tâm

- 14 hợp chất đã được phân lập lần đầu tiên từ Lục thảo hoa thưa bao gồm: 5 chất từ lá, 9 chất từ rễ, 1 chất có ở cả trong rễ và lá Trong đó có 3 hợp chất

là chất 4, 7 và chất 12 lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên, do đó đề nghị

gọi tên hợp chất 4 {7-C-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-6-O-β-D-glucopyranosyloxy-4',8-dihydroxyflavon} là Laxuminosid, hợp

chất 7 [5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] là Chlorophaldehyd và hợp chất 12 [β-sitosterol-3-O-(6'-O-hexadecanoyl)-β-D-galactopyranosid] là

Laxosid

Các hợp chất phân lập đã được chứng minh có hoạt tính sinh học

- Đã xác định hàm lượng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd trong phân

đoạn chiết bằng cloroform của rễ và trong rễ khô góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sau này

định Gr(-), hợp chất 5 ức chế 4, hợp chất 7 ức chế 2, hợp chất 6 ức chế 1

chủng Cả 3 hợp chất 5, 6, 7 đều không có tác dụng đối với vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa và 2 chủng nấm Candida albicans, Aspergilus

niger

3.3.3 Thử tác dụng tăng lực:

Mẫu thử là cao nước 1:1 của rễ và lá Lục thảo hoa thưa Sau 4 ngày

uống ở liều 10g và 20g dược liệu/kg t.t.c đã làm tăng cân chuột thí nghiệm

(8,3-12,0%), nhưng sự khác nhau so với chứng chưa có ý nghĩa thống kê

(p>0,05) Cũng ở điều kiện này thuốc không có tác dụng tăng lực trên mô

hình chuột bơi cưỡng bức của Berkman Cả bốn mẫu thử đều giảm thời gian

bơi so với lô chứng Khi dùng cao nước rễ ở liều 10g dược liệu/kg t.t.c và cao

nước lá ở liều 20g dược liệu/kg t.t.c thì giảm thời gian bơi không thực sự

khác nhau so với lô chứng (p>0,05) Tuy nhiên khi dùng cao nước rễ ở liều

20g dược liệu/kg t.t.c và cao nước lá ở liều 10g dược liệu/kg t.t.c thì việc

giảm thời gian bơi so với lô chứng có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

3.3.4 Thử tác dụng chống oxy hoá invitro

Thử nghiệm chống oxy hoá được tiến hành với 12 chất tinh khiết đã

phân lập được trên hệ DPPH Hợp chất 2

(Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid) có tác dụng chống oxy hoá mạnh nhất với 55,57% khả

năng quét gốc tự do ở giá trị IC50 39,33μg/ml Khả năng này gần tương

đương với acid ascorbic ở giá trị IC50 0,25μg/ml

Các flavonoid còn lại có tác dụng chống oxy hoá ở mức độ yếu hơn,

trong đó chất 3 [Quercetin-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-gluco

pyranosid] với 38,55% và hợp chất 1 (Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid)

với 19,02% khả năng quét gốc tự do

Hợp chất 7 [5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] có khả năng

quét 32,69% gốc tự do trong điều kiện thử nghiệm

3.3.5 Thử tác dụng gây độc tế bào

Mẫu thử là 12 chất tinh khiết phân lập từ cây Lục thảo hoa thưa Thử

nghiệm được tiến hành trên ba dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư

gan, ung thư màng tim và ung thư phổi Hợp chất 8 (Methyl caffeat) có khả

- Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch

- Thử tác dụng tăng lực bằng nghiệm pháp bơi cưỡng bức, áp dụng phương pháp của Brekhman

- Thử tác dụng chống oxy hoá invitro trên hệ DPPH

- Thử tác dụng gây độc tế bào được tiến hành theo phương pháp của Likhitwitayawuid

- Các số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật:

3.1.1 Thẩm định tên khoa học:

Cây Lục thảo hoa thưa có đầy đủ các đặc điểm của họ Lục thảo

(Anthericaceae), các đặc điểm của chi Chlorophytum Ker-Gawl và các đặc

điểm của loài Chlorophytum laxum R Br Mẫu tiêu bản cây Lục thảo hoa

thưa đã được các chuyên gia thực vật giám định tên khoa học là

Chlorophytum laxum R Br., họ Lục thảo – Anthericaceae

3.1.2 Đặc điểm vi học cây Lục thảo hoa thưa

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu:

Vi phẫu rễ: Mặt cắt hơi tròn, từ ngoài vào trong có : Ba đến bốn lớp tế bào

ngoại bì có vách hoá bần, tiếp dưới là mô mềm vỏ Nội bì là một hàng tế bào

có đai caspary hoá bần, tiếp theo là một hàng tế bào trụ bì xếp so le với nội bì Libe cấp một nằm xen kẽ giữa các bó gỗ, các mạch gỗ cấp một phân hoá hướng tâm Tia ruột nằm giữa các bó libe gỗ Trong cùng là mô mềm ruột là các tế bào hình trứng hay đa giác thành mỏng

Vi phẫu lá: Phần bẹ lá : Tế bào biểu bì trên to hơn rất nhiều so với biểu bì

dưới, dưới biểu bì là mô mềm, bó libe gỗ, mô cứng Bao quanh bó libe gỗ là

các tế bào thu góp Phần phiến lá : gần giống phần bẹ lá với bó libe gỗ có

cấu tạo tương tự, điểm khác nhau là biểu bì trên có kích thước gần như biểu bì dưới, lỗ khí nằm rải rác trên biểu bì Dưới biểu bì là mô mềm đồng hoá, tiếp đến là mô mềm xốp với những khoảng gian bào chứa đầy khí ở giữa

3.1.2.2 Đặc điểm bột dược liệu:

Bột rễ có các đặc điểm: mảnh bần, mảnh mô mềm, nhiều mảnh mạch điểm,

mạch chấm, mạch hình thang, tinh thể calci oxalat hình kim đứng riêng lẻ

hoặc tập trung thành từng bó

Bột phần trên mặt đất của cây: mảnh bần có màng hoá bần, tế bào biểu bì

mang lỗ khí hình hạt đậu, mảnh mô mềm, mảnh mạch xoắn, tế bào mô cứng,

sợi xếp thành bó, tinh thể calci oxalat hình kim tập trung thành bó

3.2 Kết quả nghiên cứu về hoá học:

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong rễ và lá Lục thảo hoa thưa

- Trong rễ Lục thảo hoa thưa có 8 nhóm chất: alcaloid, saponin, anthranoid,

acid amin, tanin, phytosterol, polysaccharid và chất béo

- Trong lá Lục thảo hoa thưa có 10 nhóm chất: alcaloid, saponin, coumarin,

flavonoid, acid hữu cơ, carotenoid, acid amin, tanin, phytosterol và chất béo

3.2.2 Xác định các nguyên tố vô cơ trong cây

Bảng 3.2 Hàm lượng các nguyên tố vô cơ trong rễ và lá Lục thảo hoa thưa

Hàm lượng nguyên tố (mg/kg) Stt Nguyên tố

Rễ Lá

2 Mg 1422,30 2234,90

3 Al 4614,60 3964,80

5 Ca 1572,20 3214,50

7 Fe 2004,71 1179,38

Nhờ có thiết bị hiện đại, độ nhạy cao, đây là lần đầu tiên xác định

được 15 nguyên tố có mặt trong rễ và lá Lục thảo hoa thưa Hàm lượng kim

loại nặng có độc tính cao như As, Pb ở trong khoảng giới hạn cho phép theo

tiêu chuẩn của WHO

3.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học 3.2.1 Thử độc tính cấp

Kết quả khảo sát độc tính cấp trên chuột nhắt trắng bằng đường uống với liều 120g dược liệu/kg t.t.c (cao gấp 34 và 51 lần so với liều dùng là rễ

và lá khô theo kinh nghiệm của người dân địa phương) không gây ra các triệu chứng ngộ độc biểu hiện trên hành vi, hoạt động tự nhiên, hô hấp và tiêu hoá của chuột; không gây chết chuột nhắt trắng thí nghiệm, do đó không xác định được LD50

3.3.2 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

- Các giống sinh vật kiểm định bao gồm: 5 chủng vi khuẩn Gr (-):

Escherichia coli ATCC 25922 (EC), Proteus mirabilis BV 108 (Pro), Shigella flexneri DT 112 (Shi), Salmonella typhi DT 220 (Sal), Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu) và 5 chủng vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta), Bacillus pumilus ATCC 10241(Bp), Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs), Bacillus cereus ATCC 9941 (Bc), Sarcina lutea

ATCC 9341 (SL)

- Vi nấm: Candida albicans và Aspergilus niger

- Kháng sinh chuẩn: Gram (-): Gentamycin (nồng độ thử 20mcg/ml);

Gram (+): Penicillin benzathin (nồng độ thử 28,9UI/ml)

- Mẫu thử là hợp chất tinh khiết 5, 6 và 7; nồng độ thử 500mcg/ml

Kết quả: Hợp chất 5 (5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd) ức chế 9/10

chủng vi khuẩn kiểm định, có đường kính vòng vô khuẩn (trong ngoặc, mm): Sal (10,53), Shi (9,03), EC (8,98), SL (8,57), Sta (8,57), Bc (8,53), Bp (8,13),

Bs (7,93), Pro (7,27)

Hợp chất 7 [5-(ethoxymethyl)-2-furancarboxaldehyd] ức chế 7/10 chủng

vi khuẩn kiểm định, có đường kính vòng vô khuẩn (trong ngoặc, mm): Sta (8,70), SL (8,57), Shi (8,27), Bs (7,87), Pro (7,37), Bc (6,93), Bp (6,87)

Hợp chất 6 [Cirsiumaldehyd hay bis(5-formylfurfuryl) ether] ức chế 6/10

chủng vi khuẩn kiểm định, có đường kính vòng vô khuẩn (trong ngoặc, mm):

SL (9,23), Sta (8,37), Bp (8,17), Bs (8,10), Bc (7,60), Pro (7,50)

Qua đó cho thấy các hợp chất 5, 6, 7 ở nồng độ 500mcg/ml có tác dụng

ức chế cả 5 chủng vi khuẩn kiểm định Gr(+) Đối với 5 chủng vi khuẩn kiểm

galactopyranose Chiều dài của mạch acid béo được xác định là 16 cacbon

bằng kết quả phổ ESI-MS với các pic ion m/z: 815,0 [M+H]+ và 796,6

[M-H2O+H]+- tương ứng với công thức phân tử C51H90O7

Từ những phân tích dữ liệu phổ nêu trên, xác định hợp chất 12 là

β-sitosterol-3-O-(6'-O-hexadecanoyl)-β-D-galactopyranosid

3.2.4.13 Hợp chất 13 (L2)

Hợp chất 13 được phân lập từ lá, dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt,

nhiệt độ nóng chảy 35-36oC Kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng pha thường và

pha đảo thấy trùng với hợp chất 5 được phân lập từ rễ Các số liệu phổ 1

H-NMR, 13C -NMR và DEPT trùng khớp với hợp chất 5 Như vậy ở trong lá

cũng có 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd

3.2.4.14 Hợp chất 14 (N6)

Hợp chất 14 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng, nhiệt

độ nóng chảy 1960 - 1970C

Phổ ESI-MS cho pic ion tại m/z 254, tương ứng với công thức phân tử

C15H10O4 So sánh với thư viện phổ thấy phổ của chất 14 trùng với phổ của

1,8-dihydroxy-3-methylanthraquinon (acid chrysophanic) tới 99% Do đó

hợp chất 14 được nhận dạng là 1,8-dihydroxy-3-methylanthraquinon (acid

chrysophanic)

O

1 3 8

9 10

Hình 3.27 Cấu trúc hoá học của hợp chất 14

3.2.5 Định lượng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd trong rễ bằng

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Chất chuẩn là hợp chất 5 phân lập tinh khiết từ rễ được xác định là

5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd Kết quả định lượng cho thấy hàm

lượng 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyd là 14,88% trong phân đoạn

chiết bằng cloroform của rễ và 0,17% trong rễ dược liệu khô

3.2.3 Chiết xuất và phân lập các hợp chất:

Bột lá Lục thảo hoa thưa (0,5kg) được chiết với methanol Sau khi cất thu hồi dung môi, cao đặc được phân tán với nước rồi lắc lần lượt với các dung môi n-hexan, cloroform, ethyl acetat, n-butanol Dịch nước còn lại

được phân lập nhiều lần bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng điều chế thu

được 4 chất sạch CL5C5 (25mg), CL5C4 (20mg), CL5C3 (17mg) và CL5R8 (10mg) Từ cao chiết cloroform (0,5g) phân lập bằng sắc ký cột thu được chất sạch L2 (15mg)

Bột rễ Lục thảo hoa thưa (0,5kg) được chiết với methanol Sau khi cất thu hồi dung môi, cao đặc được phân tán với nước rồi lắc lần lượt với các dung môi n-hexan, cloroform, ethyl acetat, n-butanol Sau khi cất thu hồi dung môi cao chiết cloroform (5,5g) được phân lập nhiều lần bằng sắc ký cột

và sắc ký lớp mỏng điều chế thu được 5 chất sạch: C2 (45mg), C1 (17mg), N1 (15mg), CL1R4B (13mg) và N4 (70mg) Từ cao chiết ethyl acetat (2,6g) phân lập bằng sắc ký cột nhiều lần thu được 4 chất: L1 (80mg), N5 (22mg), CL1R1A7 (10mg) và N6 (2,5mg)

3.2.4 Xác định cấu trúc các chất phân lập được:

3.2.4.1 Hợp chất 1 (CL5C5), 2 ( CL5C4) và 3 ( CL5C3)

Dựa vào điểm chảy và kết quả phân tích các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC và HSQC) đã xác định các hợp chất 1, 2

và 3 là các flavonoid có cấu trúc như hình 3.11, 3.12 và 3.14

O

O OH

HO

O

OH

2 3 5 6

7 8 9 10 1' 3' 5'

OH

OH

CH 2 OH HO

O

1"

HO

Hình 3.11 Cấu trúc hoá học của

chất 1:

Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid

O CH3 OH HO OH

OH OH

OH

HO

O O

O

2 3 5 6

10 1' 3' 5'

1"

2" 3"

4"

5" 6"

Hình 3.12 Cấu trúc hoá học của

chất 2:

Quercetin-3-O-α-rhamnopyranosid (Quercitrin)

Hình 3.14 Cấu trúc hoá học của chất 3: Quercetin

-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid (Rutin)

3.2.4.2 Hợp chất 4 (CL5R8)

Hợp chất 4 thu được dưới dạng chất bột màu vàng, điểm chảy

254-255oC IR (KBr) νcm-1: 3407,57 (OH), 2936,49 (CH), 1654,08 (C=O),

1059,28 (C-O-C) Cấu trúc của chất 4 được kiểm tra chi tiết trên các phổ 1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC và HSQC (xem bảng 3.6) Ngoài ra trên phổ

ESI-MS xuất hiện píc ion m/z 757,0 [M+H]+ và píc 755,3 [M-H]- tương ứng

với công thức phân tử C33H40O20

Bảng 3.6 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất 4

Vị

trí C

δCppm a,b DEPT δHppm a,c, J(Hz) HMBC

(H→C)

3 104,13 CH 6,689 (1H, s) C-2, C-4, C-10, C-1’

5 94,43 CH 6,876 (1H, s) 4, 6, 7, 9,

C-10

2’ 129,69 CH 7,888 (d, J = 8,5 Hz) C-2, C-4’

3’ 117,33 CH 6,933 (d, J = 8,5 Hz) C-1’, C-4’

5’ 117,33 CH 6,933 (d, J = 8,5 Hz) C-1’, C-4’

6’ 129,69 CH 7,888 (d, J = 8,5 Hz) C-2, C-4’

Glc I

1 72,82 CH 5,003 (1H, d, J = C-6, C-7, C-8, C-2

O

O HO

OH

OH OH

O

O CH2 O

O

OH

CH3 OH OH OH

2 3 5 6

8 9 10 1' 2' 4' 5' 6' 1'' 2''

6'' 1''' 2'''

6’ 61,1 63,28 CH2 4,280 (1H, dd, J = 2,0,

12,0)

4,438 (1H, dd, J = 5,5,

12,0)

2” 32,5 31,95 CH2 2,343 (2H, t, J = 7,5 Hz)

3” 30,1 29,74 CH2 1,257d

4”-15

”

29,1-28,8 29,74-

28,25

CH2 1,257d

16

” 14,5 14,12 CH3 0,870 (3H, t, J = 6,5 Hz)

δ∗ của longiside-B, Đo trong CDCl

3 , 300 MHz

a Đo trong CDCl 3 , b 125MHz, c 500 MHz, d Tín hiệu bị che lấp

O

HO HO OH O

1 2 3

4 5 6 8 9

1 0

1 1 1 21 3

1 5

1 6

1 7

1 8

1 9

2 0

2 1 2 2

2 3

2 4

2 5

2 6

2 7

2 8

2 9

1 '

2 '

3 '

4 '

5 '

6 '

1 "

2 "

1 6 "

Hình 3.25 Cấu trúc hoá học của hợp chất 12

Các giá trị δCppm của phân tử đường trong hợp chất 12 được so sánh với

các giá trị phổ tương ứng của galactopyranose (δCppm 97,4, 72,9, 73,8, 69,7, 75,9 và 61,8) đã được tài liệu công bố cho kết quả phù hợp Hằng số tương

tác cao của H-1’ (J = 7,5 Hz) cho thấy cấu hình β của phân tử đường