bài thực hành số 2 sắc ký cột và sắc ký bản mỏng

Trang 1

22/02/2006 Lê Văn Dăng ĐHSP

THỰC HÀNH HÓA HỮU CƠ

Thí nghiệm tổng hợp Hữu Cơ

THỰ C HÀ NH HÓ A HỮU CƠ

Trang 2

22/02/2006 Leâ Vaên Daêng ÑHSP

Trang 3

20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP

II- CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH

CÁC CHẤT HỮU CƠ

A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ

1- Sơ lược về sắc kí :

Sắc kí là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa

pha tĩnh và pha động

 Pha tĩnh có thể là cột nhồi (sắc kí cột), mà pha

động là dung môi hữu cơ sẽ di chuyển ngang qua

 Pha tĩnh có thể là một lớp mỏng (sắc kí bảng mỏng)

chất hấp phụ được tráng lên một nền phẳng bằng vật

liệu thủy tinh, nhôm, lúc đó pha động sẽ được hút thấm

lên lớp mỏng nhờ lực hút mao dẫn.

Trang 4

 Trong sắc kí phân bố pha tĩnh là một lớp chất lỏng

thật mỏng được hấp thụ lên bề mặt của một chất mang

rắn, trơ, còn pha động là chất lỏng (sắc kí phân bố lỏng

- lỏng) hoặc chất khí (sắc kí khí)

 Trong cả hai trường hợp, sự tách sẽ tùy thuộc nhiều

vào sự phân bố của dung chất giữa hai pha Trên thực

tế, quá trình này rất phức tạp do có sự tác động qua lại

giữa việc các cấu tử được hấp thụ lên chất mang và

việc tách cấu tử đó ra trong suốt quá trình sắc kí

 Trong sắc kí hấp phụ pha động thường là chất lỏng

và pha rắn là chất hấp phụ rắn, nhuyễn; việc tách ở

đây dựa vào sự hấp phụ có chọn lọc một số hợp chất

nào đó của hỗn hợp lên bề mặt của chất rắn (sắc kí rắn

-lỏng : dùng resin trao đổi ion để tách các hợp chất có tính axit

hoặc bazơ như aminoaxit hoặc aminophenol)

Trang 5

 Ngoài ra còn có sắc kí lọc gel, việc tách các hợp chất

dựa vào sự khác biệt về kích thước của các hợp chất

Trong kĩ thuật này, pha tĩnh là những hạt gel có dạng

hình cầu, có những lỗ rỗng với kích thước qui định

(nhà sản xuất có đủ cỡ để lựa chọn cho phù hợp với

chất mình cần tách) Các hợp chất có khối lượng phân

tử nhỏ sẽ chui vào trong các lỗ rỗng của các hạt gel và

được giữ lại trong hạt gel, nghĩa là được giữ lại trong

cột; các hợp chất có khối lượng phân tử lớn hơn nên

không thể chui vào trong các lỗ rỗng của các hạt gel sẽ

bị đuổi ra khỏi cột sắc kí trước tiên Kỹ thuật này áp

dụng cho các hợp chất có khối lượng phân tử lớn như

protein, peptit, enzym, hormon

Trang 6

2- SẮC KÍ CỘT :

Sắc kí cột là một phương pháp hiện đại, tinh

vi để tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp chủa

chúng Nếu lựa chọn đúng các điều kiện, người ta

có thể tách hầu hết các chất bất kì một hỗn hợp

nào.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm :

- Lựa chọn chất hấp phụ.

- Sự lựa chọn dung môi giải li.

- Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp phụ, lượng mẫu chất được dùng.

- Vận tốc giải li.

Trang 7

a) Chất hấp phụ : Lựa chọn chất hấp phụ tùy theo

Xenlulozơ, tinh bột, đường dùng cho các nguyên liệu

nguồn gốc thực vật, có chứa các nhóm chức nhạy cảm

với các tương tác axit, bazơ Silicat magie dùng để

tách các chất đường, steroit, tinh dầu Silica gel,

alumin, florisil là loại được sử dụng rộng rãi áp dụng

este, axit cacboxylic, hợp chất azo, amin Alumin tính

axit có pH = 4 thường dùng để tách các hợp chất có tính chất

axit như axit cacboxylic, aminoaxit Alumin kiềm có pH = 10

để tách các amin Alumin trung tính để tách nhiều lọai nguyên

liệu không có tính axit và cũng không có tính bazơ.

Trang 8

a) Chất hấp phụ : Cần biết rằng khi cho bột alumin

hoặc silicagel vào một dung dịch có chứa một hợp

chất hữu cơ, thì các phân tử của hợp chất hữu cơ đó sẽ

bị hấp thu hoặc bị dính vào các hạt alumin Có nhiều

loại lực hút làm cho các phân tử hữu cơ dính vào hạt

alumin, các lực hút này thay đổi tùy loại Phân tử

không phân cực sẽ gắn vào hạt alumin bởi lực hút

thường thì phân tử không phân cực sẽ không gắn chặt

vào alumin ngoại trừ khi chúng có khối lượng phân tử

cực lớn Các tương tác không tác thông dụng là các tương tác

thường thấy trong các phân tử phân cực Lực giảm dần của các

lọai nối được xếp như sau : Sự thành lập muối > liên kết phối

trí > liên kết hiđro > tương tác lưỡng cực > Van-Đec-Van.

Trang 9

a) Chất hấp phụ : Lực nối thay đổi tùy loại hợp chất

Hợp chất mang các nhóm Định chức có tính phân cực

alumin Về nguyên tắc, những hợp chất không phân

cực sẽ đi ngang qua cột mau hơn những hợp chất phân

cực là do nó có ái lực yếu đối với chất hấp phụ Nếu

chất hấp phụ gắn chặt tất cả các phân tử của dung

chất, thì các chất đó sẽ không thể di chuyển xuống

cột; ngược lại, nếu chọn phải một dung môi quá phân

cực dùng để dung li, thì dung môi này sẽ giải li tất cả

các dung chất (kể cả chất phân cực và chất không

phân cực) ra khỏi cột và như thế thì không thể thực

hiện được sự tách li bằng sắc kí cột

Trang 10

a) Chất hấp phụ : Có nhiều lọai chất hấp phụ dùng

cho sắc kí cột, được phân loại tùy theo khả năng bám

của chúng vào các phân tử phân cực; được sắp xếp

theo mức độ tăng dần như sau :

CaCO 3 , Ca 3 (PO 4 ) 2 , MgCO 3 , Ca(OH) 2 , silica gel, florisil

(MgSiO 3 ), MgO, alumin (kiềm, axit, trung tính), than

hoạt tính.

Các loại thường dùng có bán sẵn là alumin, hoặc silica gel với kích cỡ hạt gel 50-239m sẽ giúp cho việc

nhồi cột tương đối chặt chẽ và đạt được vận tốc giải li

vừa phải dưới tác động của sức hút trọng lực

Trang 11

b) Lựa chọn dung môi giải li :

Lựa chọn dung môi nào có thể hòa tan được mẫu chất sắc kí Nếu mẫu chất ở dạng dung dịch thí

dụ dung dịch trích li từ cây cỏ, phải làm bay hơi dung

dịch này đến khô dưới áp suất thấp rồi hòa tan mẫu

chất trở lại với một lượng tối thiểu dung môi lọai ít

phân cực nhất nếu có thể được Dung dịch càng đậm

đặc thì sẽ tạo thành một dãy băng sắc mỏng trong cột

giúp quá trình tách li được hiệu quả Thông thường,

dùng dung môi kém phân cực nào có thể tan mẫu thì

được chọn làm dung môi để nạp chất hấp phụ vào cột

và dĩ nhiên đây cũng là dung môi đầu tiên của quá

trình giải li.

Trang 12

Thử nghiệm chọn dung môi giải li thích hợp : với một mẫu chất mới chưa có tài liệu tham khảo, thì phải

lựa chọn chất hấp phụ và dung môi giải li Muốn vậy,

phải nhờ kỹ thuật sắc kí bảng mỏng (xem phần sắc kí

bản mỏng) với bảng alumin hoặc silica gel, nếu không

tách tốt mới phải tìm loại chất hấp phụ khác Thiết

lập một loạt thử nghiệm với những bình triển khai sắc

kí bảng mỏng trong mỗi bình chứa một trong các dung

clorofom, ete etylic, axetat etyl, axeton, metanol Các

nhau như đã chuẩn bị

Trang 13

Ghi nhận độ di dộng của của các cấu tử trong mẫu : Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử

mằm lại tại chỗ mức xuất phát hoặc di chuyển hết lên

mức tiền tuyến dung môi thì dung môi đó không phù

hợp Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ

thống đơn dung môi như vừa làm nêu trên không cho

những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần triển khai hệ thống

gồm hỗn hợp dung môi, thí dụ như hỗn hợp

toluen-metanol, hoặc hexan-etyl axetat

Trang 14

Cần hiểu kết quả phân tích trên sắc kí bảng mỏng sẽ tốt, đẹp hơn trên sắc kí cột Toluen là loại

dung môi có độ phân cực trung bình và có thể áp dụng

để tách nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau Nếu

mẫu nguyên liệu đầu là các hiđrocacbon thì nên dùng

hexan, ete dầu hỏa, benzen, toluen Các hỗn hợp ete

dầu hỏa-toluen; hexan-toluen; ete dầu hỏa-ete etylic;

thường rất thích hợp để tách nhiều lọai hợp chất

thông dụng khác nhau Các mẫu nguyên liệu có tính

etanol.

Trang 15

Dung môi dùng để giải li phải là dung môi tinh khiết, nếu không tinh khiết phải chưng cất lại trước

khi sử dụng, đặc biệt các dung môi hiđrocacbon là loại

dễ cho nhiều cặn hơn các loại dung môi khác.

Các dung môi thường dùng để sắc kí cột được trình bày theo thứ tự tăng dần về độ phân cực mà khả

năng mà dung môi đó có đối với những nhóm chức

phân cực như sau :

tetraclorua, benzen, toluen, điclometan, clorofom, ete

Trang 16

Thường thường, nên bắt đầu bằng một dung môi không phân cực để loại một cách tương đối các hợp chất không phân

cực ra khỏi cột và kế đó dung môi giải li sẽ được tăng dần độ

phân cực để đuổi các hợp chất có tính phân cực hơn Muốn

thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi

từ từ bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trăm một lượng

dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải li Thí

dụ đang giải li với hexan, sau đó muốn đổi sang toluen thì phải

thêm từ từ theo tỉ lệ 99 : 1 ( nghĩa là 99 ml hexan và 1 ml

toluen); 98 : 2; 95 : 5; 90 : 10; 70 : 30; 50 : 50; 10 : 90; 0 : 100

Nếu cho thêm vào vội vã, đột ngột thì sẽ làm gãy cột do

alumin hay silica gel được trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt,

nhiệt này khiến cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh

ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt gãy cột ; cột gãy thì khả năng tách

của cột kém đi.

Trang 17

Thông thường, hợp chất không phân cực

di chuyển nhanh và được giải li ra khỏi cột

trước; còn các hợp chất phân cực sẽ di chuyển

chậm hơn, lưu ý là khối lượng phân tử cũng có

liên quan đến thứ tự các chất được giải li : một

hợp chất không phân cực và có khối lượng

phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn một hợp

chất không phân cực và có khối lượng phân tử

nhỏ Thứ tự tương đối các hợp chất được giải li

ra khỏi cột là :

Trang 18

Lọai chất được giải li

ra khỏi cột Mức giải độ li Thứ giải tự li Ankan

Trang 19

Cần hiểu thêm khi dùng các chất hấp phụ là alumin hay silica gel; nhất là khi môi trường

có điều kiện axit hoặc kiềm với họat tính cao,

dung môi axeton sẽ cho phản ứng anđol hóa để

tạo thành ancol đixeton Còn khi dùng dung môi là etyl axetat và có thêm một ancol khác

nữa để làm dung môi thì sẽ có thể có hỗn hợp

của các este do sự trao đổi este Khi dùng các

dung môi có dạng hoạt động cao như piriđin,

metanol, nước, axit axetic chúng có thể hòa

tan và giải li một số chất hấp phụ

Trang 20

c) Kích thước cột sắc kí và lượng chất hấp phụ :

Kích thước cột sắc kí và lượng chất hấp phụ cần được lựa chọn thích đáng để có thể tách tốt các mẫu cần sắc kí

Thông thường, khối lượng phân tử chất hấp phụ phải nặng gấp

25 -50 lần khối lượng mẫu chất cần sắc kí và cột sắc kí và cột

sắc kí cần có kích cỡ là chiều cao phần chất hấp phụ trong cột

sắc kí cần thỏa tỉ lệ chiều cao 8 : 1 Tuy nhiên, đối với các hợp

chất khó tách thì có thể dùng cột lớn hơn và lượng chất hấp

phụ nhiều hơn.

Trang 21

d) Vận tốc giải li : Mẫu chất cần phân tách bằng sắc kí cột cần

lưu lại trong cột một thời gian vừa đủ lâu để đạt được sự cân

bằng giữa pha động và pha tĩnh; nhờ thế các chất khác nhau

trong một hỗn hợp mới có thể được tách riêng nhau ra : trong

thời gian này tùy thuộc vào vận tốc giải li Nếu vận tốc giải li

quá nhanh, các dung chất trong hỗn hợp mẫu chưa đủ thời gian

để tạo cân bằng với chất hấp phụ khi chúng đi ngang cột Nếu

vận tốc giải li ra chậm, các hợp chất riêng biệt của hỗn hợp sẽ

phân tán lẫn vào nhau trong dung môi giải li, việc phân tán sẽ

nhanh hơn là việc chúng được làm di chuyển xuống dưới cột, và

như thế, các dãy băng phân li sẽ rộng hơn, có thể làm cho dãy

này trùng chập vào dãy kia, làm cho việc tách các chất ra khó

hơn Nếu vận tốc giải li quá chậm, hoặc ngưng quá trình giải li

lại một thời gian hoặc ngưng lại qua đêm, thì các dung chất sẽ

bị phân tán khắp mọi hướng, làm xấu đi việc tách Đa số các

trường hợp, vận tốc giải li nằm trong khoảng 5-50 giọt/ phút.

Trang 22

e) Kỹ thuật nhồi cột :

Cần tuân theo các kỹ thuật hướng dẫn để có được cột nhồi chặt chẽ, đồng đều, không bọt khí,

không nứt gãy.

Cột sắc kí là một ống thủy tinh dưới đáy có một robinet khóa; cột được bắt vào giá ở vị trí thẳng đứng,

dưới cột có một bese hứng, dưới đáy cột có đặt một

lớp bông gòn mỏng khoảng 2-3 mm, lớp bông gòn này

có tác dụng giữ cho chất hấp phụ không tuột ra khỏi

benzen vào 1/2 cột rồi để đó, chuẩn bị chất hấp phụ

khô và phương pháp sệt.

Trang 23

Phương pháp sệt : Tức là chất hấp phụ được nạp vào

cột ở dạng sệt, dạng sệt này được chuẩn bị như sau :

một bese có chứa sẵn một lượng dung môi có khối

lượng gấp 5-10 lần khối lượng chất hấp phụ sẽ dùng

(dung môi là lọai dung môi ít phân cực nhất, sẽ được

dùng cho phần thực hành sắp làm); cho chất hấp phụ

ở dạng khô vào bese từ từ mỗi lần một ít và khuấy

đều, đến khi cho hết chất hấp phụ vào bese Tiếp tục

khuấy đều đến khi hỗn hợp đồng nhất và tương đối

hết bọt khí Không được làm ngược lại tức là cho dung

môi vào chất hấp phụ, vì chất hấp phụ sẽ solvat hóa

và sinh ra nhiệt khiến cho hỗn hợp cuối cùng có dạng

lỗn nhỗn, lục cục, không đồng đều.

Trang 24

Phương pháp sệt : Bấy giờ, mở nhẹ khóa cột sắc kí để cho

dung môi có sẵn trong cột chảy ra chầm chậm, hứng vào một

bese để ở bên dưới cột và tiếp liền sau đó, rót chất hấp phụ

dạng sệt vừa chuẩn bị như mô tả phần trên vào đầu cột đến vị

trí theo ý muốn Dùng một thanh cao su cứng để khỏ nhẹ vào

thành ngòai của cột, động tác này giúp cho chất hấp phụ lắng

đều dưới xuống cột, việc nạp cốt được chặt chẽ, không có bọt

khí Tiếp tục vừa rót chất sệt vào cột, vừa khỏ nhẹ, đến khi rót

hết số lượng chất sệt vào cột Lưu ý trong quá trình nạp cột,

dung môi vẫn liên tục chảy đều đều ra khỏi cột hứng vào bese

đặt dưới cột và sẽ được dùng để rót trở lại lên đầu cột Cho

dung môi chảy ra, rồi rót trở lại đầu cột vài ba lần để giúp cho

việc nạp cột được chặt chẽ Lưu ý, luôn giữ không được để cho

cột khô nghĩa là nếu dung môi chảy ra hết thì phần chất hấp

phụ trên đầu cột sẽ bị khô.

Trang 25

Phương pháp khô : Cột được đổ đầy dung môi, vừa

cho dung môi chảy ra chầm chậm bên dưới, vừa cho

từng ít một chất hấp phụ ở dạng khô vào đầu cột

(dùng một ờ giấy lọc tròn xếp thành hình cái phễu,

dưới đáy tờ giấy lọc hình phễu đó có đục một lỗ nhỏ

đủ cho bột khô ở bên trong phễu chảy thành dòng nhỏ

xuống dung môi trong cột), vừa khỏ nhẹ vào thành

cột Khi chất hấp phụ đạt đến chiều cao cần thiết

trong cột thì ngưng không cho thêm nữa Tiếp tục cho

dung mọi chảy ngang qua chất hấp phụ vài lần như

mô tả ở phần nhồi cột theo phương pháp sệt.

Trang 26

f) Kỹ thuật nạp mẫu vào đầu cột :

Nếu mẫu chất là chất lỏng cần làm bay hơi đến khô rồi hòa tan trở lại trong một lượng tối thiểu dung

môi Nếu mẫu là chất rắn, hòa tan mẫu vào một lượng

tối thiểu dung môi, đó là loại dung môi phân cực ít

nhất mà mẫu đó có thể hòa tan tốt Thông thường

dung môi để hòa tan mẫu cũng là dung môi để giải li

đầu tiên Dung dịch màu càng đậm đặc và có thể tích

nhỏ càng tốt sẽ giúp cho dung dịch thành một lớp dày

hẹp nằm trên đầu cột, điều này sẽ giúp cho việc tách

tốt các cấu tử của hỗn hợp mẫu Nếu mẫu không tan

hoàn toàn trong dung môi sắp giải li thì có thể thêm

một ít dung môi phân cực; tuy nhiên các chất không

tan này thường là tạp chất rất phân cực, cần nên

được lọc, loại bỏ trước khi nạp mẫu vào cột.

Trang 27

Trang 28

Mở khóa để hạ mực dung dịch mẫu xuống sát mặt thoáng chất hấp phụ, khóa lại, dùng ống nhỏ giọt cho một

lượng nhỏ 5-10 ml dung môi vào đầu cột (nhớ tranh thủ rửa

sạch phần đầu cột) lại mở khóa để dung dịch chảy ra, sao cho

mặt thóang chất hấp phụ vừa vặn khô Lại khóa lại, cho thêm

một lượng nhỏ dung môi nữa, tiếp tục đến khi thấy mẫu chất

đã được gắn chặt vào chất hấp phụ ở phần đầu cột (tức là khi

thêm dung môi vào thì dung môi này trong suốt, không bị lây

màu của chất mẫu).

Cho một lớp bông gòn hoặc một lớp giấy lọc (hình tròn, dày khoảng 2-3 mm), đường kính bằng với đường kính trong

của ống) đặt nhẹ lên mặt thóang của chất hấp phụ; cẩn thận

để không làm xáo trộn bề mặt đang nằm ngang ngay nắn của

mặt thoáng Cho thêm dung môi lên đầy cột và bắt đầu quá

trình giải li.

Trang 29

g) Theo dõi quá trình giải li :

Trang 30

g) Theo dõi quá trình giải li :

Trang 31

Bông gòn

Dung môi

Silica gel Mẫu chất

Trang 32

Cấu tử sau khi tách cùng với dung môi Bình hứng dung môi

Máy cô quay (Rotary Evaporator) dùng để cất đuổi dung môi

Trang 33

h) Cô lập các chất đã được tách ra bởi sắc kí cột :

Biểu đồ cho thấy cột đã phân li mẫu hỗn hợp ban đầu thành 3

chất riêng biệt, tạm gọi tên là A, B, C, căn cứ vào ba mũi 1, 3, 3

trên biểu đồ Gom chất trong các eclen đánh số từ 2-7 sẽ có

chất A, gom chất trong các eclen đánh số từ 8-10 sẽ có chất B

và gom chất trong các eclen từ 11-15 sẽ có chất C.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Khối lượng

Số Phân đoạn

Mũi 1 Mũi 2 Mũi 3

Trang 36

3- SẮC KÍ BẢNG MỎNG

a) Sơ lược về lí thuyết :

Sắc bảng mỏng là một kỹ thuật chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ mẫu chất (10-7gam) để tách

nhanh định tính một hỗn hợp chất Do đó có các

nguyên tắc cơ bản liên quan mật thiết với kỹ thuật săc kí cột nên cần nắm vững kiến thức với

sắc kí cột khi ứng dụng phương pháp này.

Giống như sắc kí cột, sắc kí bản mỏng là kỹ thuật phân bố rắn-lỏng, trong đó pha lỏng di động được cho đi lên một lớp mỏng chất hấp phụ, chất này được tráng phủ lên một nền là một

tấm kiếng, một bảng nhôm hay một miếng platic

Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng

nên có tên là tấm bảng mỏng.

Trang 37

a) Sơ lược về lí thuyết :

* Chất hấp phụ : Có hai loại chất hấp phụ thông dụng là alumin G (nhôm oxit) và silica gel

G Chữ G là do chữ gypsum (canxi sunfat ngậm

nước : CaSO4.H2O), khi chất này tiếp xúc với

nước hoặc hơi ẩm sẽ đóng rắn CaSO4.2H2O sẽ

giúp cho chất hấp phụ dính lại vào nhau và dính

lên tấm bảng nền Trong chất hấp phụ dùng cho

bảng mỏng, thường có 10-13% chất gypsum để

làm chất kết dính và có cỡ hạt nhỏ hơn hạt dùng

trong sắc kí cột, vì thế không thể dùng chất hấp

phụ của sắc kí bảng mỏng để nhồi cột làm sắc kí

cột.

Trang 38

b) Tráng bảng khổ nhỏ (2-3 x 6-8) :

- Các tấm kiếng được rửa sạch sẽ bằng các chất tẩy rửa thông dụng để loại hết các vết dầu

mỡ, bẩn; nếu không thì rửa bằng dung dịch axit

cromic; tráng lại bằng nước cất, dựng đứng cho

ráo nước và sấy khô Từ lúc này chỉ được cầm

bảng bởi các cạnh hoặc cầm ở bề mặt dưới là bề

mặt không có tráng chất.

- Chuẩn bị dung dịch sệt : Trong một bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật lọai cổ rộng,

có đậy nắp, chứa sẵn 100 ml CH2Cl−2 hoặc 100

ml nước cất, cho từ từ vừa khuấy đều 30 gam

chất silica G hoặc alumin G.

Định dạng
Số trang	77
Dung lượng	1,36 MB