PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN

ĐỊNH NGHĨA GIẢI TRÌNH TỰ GEN• Là phương pháp thực nghiệm để xác định trình tự nucleotide của một đoạn ADN • Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trong một đoạn ADN www.accessex

Giảng viên hướng dẫn: TS Võ Văn Toàn Học viên thực hiện: Phùng Tấn Thi

Lớp: Sinh học thực nghiệm khóa 12

Qui Nhơn, tháng 3 năm 2011

TIN SINH HỌC

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AND

VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC TẾ

What is bioinformatics?

Tin sinh h c l gì? ọ à

􀂁 Bio: Sinh h c phân t (Molecular ọ ử

Biology)

􀂁 Informatics: Khoa h c tính toán ọ

􀂁 Bioinformatics: Gi i quy t các b i toán ả ế à

sinh h c b ng vi c s d ng các ph ng ọ ằ ệ ử ụ ươ pháp c a khoa h c tính toán ủ ọ

Synonyms: Computational

biology,Computational molecular biology,

Biocomputing

DNA/RNA

CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA ĐƯỜNG RIBOSE VÀ DEOXYRIBOSE

Trạng thái tự nhiên Trạng thái biến tính sợi đơn Trạng thái lại tính

ĐỊNH NGHĨA GIẢI TRÌNH TỰ GEN

• Là phương pháp thực nghiệm để xác định trình tự

nucleotide của một đoạn ADN

• Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trong một đoạn ADN

www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene27.html

• Phân tích trình tự của các đơn vị mang thông tin di truyền

www.mwgbiotech.com/html/glossary/glossary_overview.shtml

LỊCH SỬ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN

 1870 Mischer: PHÁT MINH DNA

 1940 Avery: DNA LÀ “CHẤT LIỆU DI TRUYỀN”

 1953 Watson & Crick: CẤU TRÚC XOẮN KÉP CỦA DNA

 1965 Holley: TRÌNH TỰ CỦA t RNA NẤM MEN

 1977 Wu: TRÌNH TỰ CỦA ĐẦU DÍNH DNA TRỰC KHUẨN λ

 1977 Sanger: PHƯƠNG PHÁP DỪNG CHUỖI BẰNG DIDEOXY

Maxam & Gilbert: PHƯƠNG PHÁP PHÂN GiẢI HÓA HỌC

 1980 Messing: CHỌN LỌC DÒNG TRỰC KHUẨN M13

 1986 Hood et al: TỰ ĐỘNG HÓA MỘT PHẦN

 1990 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ BẰNG CHU TRÌNH NHIỆT (PCR); CÁC ENZYME ĐƯỢC HOÀN THIỆN ĐỂ ĐỌC TRÌNH TỰ; CÁC HỆ THỐNG DÒ HUỲNH QUANG ĐƯỢC HOÀN THIỆN (ĐỌC QUA ỐNG MAO DẪN)

PHÂN BỐ SỐ LƯỢNG GENOM ĐÃ ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ HOÀN TOÀN Ở CÁC SINH VẬT

Archea (16)

Eukarya (20)

Bacteria (139)

Viruses (1500)

NGUYÊN LÝ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN

PHƯƠNG PHÁP SANGER

Frederick (Fred) Sanger

PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT

Walter Gilbert

PHẢN ỨNG CHUỖI/DÂY CHUYỀN (CỦA/BẰNG/NHỜ/DO) POLYMERASE

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Kary Mullis

GIẢI NOBEL VỀ HÓA HỌC, 1993

Mullis, K.B (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction

Scientific American 262 (4) 56-65

devised by Kary Mullis c1983

POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR

A 'licence' to do molecular biology

A key central technique that has revolutionised molecular and consequently cell biology

Schematic illustration of PCR steps

Sơ đồ minh họa các buớc PCR

From: Recombinant DNA by Watson, Gilman, Witkowski & Zoller

Target Amplification

MỤC TIÊU KHUẾCH ĐẠI

No of No Amplicon Cycles Copies of Target

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

TRÌNH TỰ GENE

1 Phương pháp Maxam-Gilbert (hoá học)

Phương pháp được phát minh đầu tiên nhưng đến

nay ít được sử dụng, chỉ dùng cho

“footprinting”

Sử dụng DNA polymerase, primer, dNTP và một

lượng nhỏ ddNTP (để kết thúc chuỗi)

5’-Xử lý bằng hoá chất cắt đặc hiệu tại một base nào đó

4 ống

G-rxn A>G

-rxn

T>C -rxn C-rxn

C

C

Trình tự được đọc trực tiếp

autoradiograph of dried sequencing gel

C T A G

3’

G C A T T C C A T A G G 5’

D a v o s th y phân c tr ng phân t DNA c n ự à ự ủ đặ ư ử ầ xác nh trình t b ng ph ng pháp hóa h c đị ự ằ ươ ọ

- Tr c h t DNA ướ ế đượ đ c ánh d u b ng P32 m t u ấ ằ ở ộ đầ

- Sau ó, chúng đ đượ c chia th nh à n m phân o n, ă đ ạ

Hóa ch t ấ Base b nh h ng ị ả ưở

5’-DNA Polymerase +dNTPs + one of:

In the ddGTP reaction there is a

random chance a ddGTP will be

incorporated across from a C

C T A G

ddNTP Reaction Mix

5’

C G T A A G G T A T C C 3’

Khi các Dideoxynucleotide b t c p b sung ắ ặ ổ

v i nucleotide t ng ng trên m ch g c thì ớ ươ ứ ạ ố

ph n ng t ng h p ng ng l i do không t o ả ứ ổ ợ ừ ạ ạ

c liên k t phosphodister.

DNA Sequencing sau khi t¹o dßng

Primer

O (P)-(P)-(P)-

H

Base

O (P)-(P)-(P)-

be added

OH

P O OH

 DNA Sequencing using the Sanger

method involves the use of

2’3’-dideoxynucleotide triphosphates in

addition to regular

2’-deoxynucleotide triphosphates

 Because 2’3’-dideoxynucleotide

triphosphates lack a 3’ hydroxyl

group, and DNA polymerization

occurs only in the 3’ direction,

once 2’3’-dideoxynucleotide

triphosphates are incorporated (lk

chặt), primer extension stops

H

2’3’-dideoxynucleotide monophosphate

dideoxynucleotide monophosphate

2’-S U G A R -P H O S P H A T E B A C K B O N E

N

O

O

NH 2 N

NH N

H 2 N N

H 2 O

2

’3

’d id e o x y n u c le o

ti d e

The dideoxy method has been

modified (bổ sung) so it can be

done in one tube In this case all of the ddNTP’s are labeled with

different, coloured fluorescent

molecules

This makes automation much

simpler, reduces the cost of the

reactions, and speeds up the

process tremendously (rất lớn)

Large sequencing centres use

this method and can read

millions of bp every single day

Trong k thu t n y, không dùng các ng v ĩ ậ à đồ ị

phóng x , thay v o ó l các hóa ch t có kh ạ à đ à ấ ả

n ng phát hu nh quang (fluochrome) ă ỳ

M i lo i Dideoxynucleotide ỗ ạ đượ đ c ánh d u b ng ấ ằ fluochrome có m u khác nhau à

Sequencing Data

Máy giải trình tự DNA tự động

(Automated DNA Sequencers)

 ABI: ABI 377, 310, 3100, 3100 Avant, 3700, 3730…

 Amersham: MegaBace 500, 100

 Beckman-Coulter: CE2000, 8000

 Li-Cor:

 Shimatzu: DSQ1000, 2000…

 ABI 3100 Avant (4 capillaries): 5/ VCNSH, TTCNSH (ĐHQGHN);

ABI sequencers

ABI 377

ABI 373

ABI 371

ABI Automated Sequencers

(contd.)

ABI 310

ABI 3700

ABI 3100Avant ABI 3100

Lý giải trình tự DNA

123123123

654654654

Khung đọc mở 2 Khung đọc mở 1

C¸c C¬ së d÷ liÖu gen

Quèc tÕ

- EMBL/EBI (EU);

- NCBI (USA);

CỞ SỞ DỮ LIỆU GEN CỦA EMBL/EBI

 CSDL trình tự nucleotide của EMBL là một thành viên các nước châu Âu trong 3 CSDL lớn nhất thế giới Có thể truy cập vào hàng trăm trình tự genom hoàn chỉnh cùng với các sản phẩm protein dịch mã nhờ máy chủ của EBI

 ASD: CSDL phân cắt nảy sinh (Alternative Splicing Database) chứa dữ liệu về các exon phân cắt phát sinh cùng với các thông tin bổ sung đi kèm Dự án ASD nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế cắt ghép nảy sinh ở quy mô genome.

 ATD: CSDL đa dạng về các bản phiên mã nảy sinh (Alternate Transcript Diversity Database ATD) chứa dữ liệu về các bản phiên mã trong đó mỗi bản phiên mã được

mô tả cho một dạng cắt ghép nảy sinh và sự polyadenyl hóa nảy sinh (alternative polyadenylation).

 EMBL-Align database: CSDL so sánh nhiều trình tự

 EMBL-Bank: Ngân hàng EMBL còn được gọi là CSDL trình tự nucleotide EMBL, đóng góp vào nguồn trình tự nucleotide sơ cấp của châu Âu

 EMBL CDS: là một CSDL của trình tự nucleotide của trình

tự mã hóa (CDS coding sequence)

 Ensembl: Mô tả tự động của các genome eukaryote

 Genomes Server: một cái nhìn tổng quan của các genom hoàn chỉnh ở EBI Những trang web này cho phép truy cập với một số lượng lớn các genom hoàn chỉnh.

 Genome Reviews: CSDL genom được chỉnh sửa bao gồm các phiên bản chính xác của các mục tra cứu (entry) genom hoàn chỉnh từ CSDL trình tự nucleotide của EMBL/GenBank/DDBJ

 Karyn's Genomes: thu thập và mô tả một số trình tự genom

 IMGT/HLA: CSDL di truyền miễn dịch, bao gồm CSDL IMGT/HLA của phức hệ phù hợp tổ chức (MHC) CSDL

di truyền miễn dịch IMGT/LIGM bao gồm CSDL IMGT/LIGM của các Ig và các thụ thể tế bào T

 IPD: CSDL đa hình miễn dịch (Immuno Polymorphism Database IPD), bao gồm các gen đa hình của hệ thống miễn dịch, chẳng hạn như KIR, HPA và MHC không phải của người.

 LGICdb: CSDL các chất gắn các kênh Ion (Ligand Gated Ion Channel Database)

 Mutations: Dự án CSDL sự đa hình trình tự (Sequence variation database project)

 Parasites: CSDL genome ký sinh (Parasite Genome databases)

CÔNG CỤ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ AND CỦA EMBL/EBI

 Sử dụng rất nhiều phương pháp tin sinh học để xác định chức năng sinh học, cấu trúc của các gen và protein mà chúng mã hóa.

 Các công cụ như Transeq có thể giúp xác định các vùng mã hóa protein của một trình tự DNA ClustalW được sử dụng

để so sánh trình tự DNA hoặc protein để làm sáng tỏ mối quan hệ cũng như nguồn gốc tiến hóa của chúng

Các công c phân tích do EBI cung c p: ụ ấ

hợp cho các promoter.

W hoặc T-Coffee phụ thuộc vào tùy chọn khác nhau

promoter

được với một số phương pháp so sánh khác nhau

CƠ SỞ DỮ LIỆU GEN CỦA NCBI

 GenBank: Tập hợp tất cả các trình tự nucleotide và axit amin hiện có

 GenBank® là CSDL trình tự di truyền của NIH Có khoảng 51.674.486.881 base trong 46.947.388 bản trình tự trong các nhánh của GenBank và 53.346.605.784 base trong 10.276.161 bản ghi trình tự ở nhánh WGS vào 8/2005

 Chẳng hạn, chúng ta có thể xem bản ghi cho một gen của

Cứ sau 2 tháng, một phiên bản update được đưa ra

 GenBank là một phần của (International Nucleotide Sequence Database Collaboration) bao gồm ở DDBJ, EMBL

và NCBI Ba tổ chức này trao đổi dữ liệu với nhau hàng ngày.

 Trong lần công bố gần đây nhất, INSDC cho biết CSDL trình tự DNA đã vượt quá 100 Gb GenBank là một thành viên quan trọng đóng góp cho mức này và tất nhiên đó là kết quả đóng góp của rất nhiều các nhà khoa học trên toàn thế giới.

 dbEST (data base of Expressed Sequence Tags): Theo Nature Genetics 4:332-3; 1993 thì dbEST là một tập hợp của các trình tự đeo thẻ hoặc các trình tự ngắn, duy nhất lấy từ mRNA (cDNA) dbEST cũng là một nhánh của GenBank.

 dbGSS (data base of Genome Survey Sequences): cũng là một nhánh của GenBank nhưng khác với dbEST là hầu hết các trình tự đều có nguồn gốc từ genomic chứ không phải là cDNA (mRNA) Nhánh dbGSS chứa các dạng dữ liệu sau:

•Single - pass genom sequence

•Các trình t t n cùng c a cosmid/BAC/YAC ự ậ ủ

(transposon –tagged).

 dbSNP (data base of Single-base Nucleotide Polymorphism):

là CSDL các đa hình do sự thay thế hoặc thêm, bớt một nucleotide

 RefSeq: CSDL của các trình tự tra cứu không có sự dư thừa (non-redundant reference sequence) bao gồm: các đoạn contig DNA genom, các mRNA, các protein của các gen đã biết

 dbSTS (data base of sequence tagged sites): CSDL của các

vị trí trình tự được đeo thẻ hoặc các trình tự ngắn thường chỉ có mặt một lần duy nhất trong genom.

 UniSTS: là một cơ sở dữ liệu toàn diện của các STS (các vị trí đánh dấu trình tự) được lấy từ các bản đồ STS và các thí nghiệm khác.

 UniGene: Tập hợp của các trình tự EST và các trình tự mRNA có chiều dài đầy đủ được nhóm vào các cụm và mỗi cụm đại diện cho một gene duy nhất được biết hoặc gene người được mô tả cùng với bản đồ và những thông tin về quá trình biểu hiện gen.

 dbHTG (data base of high-throughput genom sequence): tập hợp của các trình tự genom thu được từ các trung tâm xác định trình tự genom.

 HomoloGene: Sử dụng để so sánh trình tự nucleotide giữa hai sinh vật để đánh giá mức độ

ortholog giả định.

 MGC: (Mamalian Gene Collection) cung cấp các dòng đầy đủ chiều dài các khung đọc mở (full- length open reading frame FL-ORF) cho người, chuột nhắt và chuột cống

 PopSet: PopSet là một hệ thống các trình tự DNA được thu thập để phân tích mối quan hệ tiến hóa của một quần thể

 RefSeq: Cung cấp hệ thống các trình tự: DNA, các loại RNA và sản phẩm protein để nghiên cứu các sinh vật

 TPA: Third Party Annotation (TPA) Sequence: Được thiết

kế để thu hút các kết quả thực nghiệm và hỗ trợ cho những người đăng ký mô tả, giải thích về trình tự mà người đăng

ký không xác định được trực tiếp nhưng có thể lấy từ dữ liệu sơ cấp của GenBank.

 RHdb: là một cơ sở dữ liệu của các dữ liệu thô được sử dụng trong việc thiết kế các bản đồ lai phóng xạ Nó bao gồm các dữ liệu STS, điểm số, các điều kiện thí nghiệm và các tra cứu chéo.

CÁC CÔNG CỤ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ AND

 HomoloGene: So sánh các trình tự nucleotide giữa các cặp sinh vật để xác định các gen ở các loài khác nhau được tiến hóa từ một gen tổ tiên chung do quá trình phân loài và chúng thường vẫn giữ được nguyên chức năng trong quá trình tiến hóa.

 CSDL các vùng bảo thủ (Conserved Domain Database CDD): Tập hợp các bản so sánh trình tự (sequence alignment) và các profile của các vùng bảo thủ của các phân

tử protein trong quá trình tiến hóa phân tử.

 Tập hợp các gen động vật có vú (Mammalian Gene Collection MGC): Một nỗ lực mới của NIH để thu được các nguồn cDNA với chiều dài đầy đủ.

 Clone Registry: Một CSDL được sử dụng bởi sự tham gia của các trung tâm trình tự genom người và chuột để lưu giữ những dòng được lựa chọn từ việc đọc trình tự, các dòng đang được đọc trình tự và các dòng đã hoàn tất và được lưu giữ ở GenBank

 Trace Archive: Được phát triển để lưu giữ các dữ liệu trình

tự thô được tạo ra từ các dự án xác định trình tự.

 Tìm khung đọc mở (ORF Finder): Một công cụ phân tích hiện thị dưới dạng đồ hoạ cho phép tìm các khung đọc mở của một đoạn trình tự hoặc một trình tự có trong CSDL.

 VecScreen: Một công cụ cho phép xác định các đoạn trình

tự nucleotide mà có thể là của vector, các vùng linker hoặc các điểm khởi đầu sao chép (origin) trước khi sử dụng các công cụ phân tích trình tự hoặc đăng ký trình tự.

 Electronic-PCR (e-PCR): Có thể được sử dụng để so sánh một trình tự truy vấn (query sequence) với các vị trí trong trình tự đánh dấu (sequence-tagged sites) để tìm ra một vị trí bản đồ có thể cho trình tự truy vấn.

Tìm khung c m (ORF Finder) đọ ở

Các trình t DNA mã hóa thông tin di truy n ự ề

d i d ng các b ba nucleotide Khi có m t ướ ạ ộ ộ trình t DNA, chúng ta c n ph i tìm trình t ự ầ ả ự

protein n u mu n xác nh s n ph m sau d ch ế ố đị ả ẩ ị

mã c a trình t n y Tuy nhiên, các trình t ủ ự à ự

DNA, sau khi đượ c phiên mã, ch ỉ đượ c d ch mã ị

th nh protein khi chúng l m t khung c m à à ộ đọ ở (Open Reading Frame - ORF) Các khung c đọ

tìm các khung c m có th có trong m t trình t DNA, chúng

ta s d ng m t ch ng trình có tên l ORF finder c a NCBI ử ụ ộ ươ à ủ

Ch ng trình n y s tìm ki m nh ng khung c m có th có c a ươ à ẽ ế ữ đọ ở ể ủ trình t nh p v o v trình t b sung c a nó Sau ó a ra b n ự ậ à à ự ổ ủ đ đư ả đồ khung c m v i các trình t ã d ch mã th nh trình t amino đọ ở ớ ự đ ị à ự acid.

B c 1: T google chúng ta nh p v o t khóa orf finder ướ ừ ậ à ừ

B c 2: M trang ướ ở ORF finder t trang ch NCBI b ng ừ ủ ằ cách nh n vào dòng ấ ORF finder.

AGATCTTCTAGCTACCTTGCAGTCTTGCTTAATTGCTTGCGTTGATTTACCGTGCGCACTCATGCCGCTA

TATATTCTCTGATCGACCAGGGGTTGGCTTGCTCACCGTGCCCTACGCCCTCTCCGAGGGGGGCTGGGTG

AGCCTCGCGCTGCTCGCCGCCGTGGCCGCCGCCTGCTGGTACACCGGGATCCTCCTCTGCCGCTGCATGG ACGCCGACGACGCCATCCGGACGTACCCGGACATCGGCGAGCGCGCGTTCGGCCGCACGGGCCGCCTCCT CGTGTCCGCCTTCACGTACGTCGAGCTCTACCTCGTCGCCACCGGCTTCCTCATCCTCGAGGGCGACAAC

CTCGACAAGCTCTTCCCAGGAGCCAGAGTCACCCTGGGGACGGTGTCCCTCGCCGGGAAGCGGCTGTTCG TCGTGCTCGTCGCGCTCGTGGTGGCGCCCACGACGTGGCTGCGCAGCCTCGGCGTGCTCGCGTACGTCTC CGCCACGGGCGTGTTCGCGTCCGTCGTCATCGTGCTCAGCGTGCTGTGGCCGCGGCCGTCGACGGCGTCG GATTCTCCGGACGAGGGACGACGACGCCGCTACGGATCGCGGGGCTCCCGACGGCTCTCGGGCTGTACAT CTTCTGCTACGGGGGACACCCCATGTTCCCGACGCTCTACACATCTATGAAGAGGAAGTCTCAGTTTCCA

GCTGCCCTGCGCCTGCTACGTCAGGATCTTCGGGGCGCCGTCGATGAGCAGCGTGGAGGCCGTGGCGATC GGCGGGATACTGGTGCTGGGCTCGCTGGTGGCTGTCACGGGGACTTACTATTCCCTGATGAAAATTATCC

GTGAGTTGGTGTGA