Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía nam và nghiên cứu vắc xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa tt

Để cùng giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau c

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

PCV2 liên quan đến một số bệnh trên heo, gọi chung là các bệnh do circovirus trên heo (Procine circovirus diseases - PCVDs) (Segalés và ctv, 2012) Trong đó, đáng lưu ý nhất là hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết và loại thải, tăng tiêu tốn thức ăn và giảm tăng trọng, vì thế gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi heo Các ca nghi ngờ PMWS trên heo được báo cáo đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2004

có liên quan đến việc gia tăng tình trạng còi cọc trên các đàn heo sau cai sữa (Lâm Thị Thu Hương và ctv, 2005) Sự đa dạng di truyền của PCV2 không chỉ là mối quan tâm

về mặt dịch tễ, mà cả về hiệu quả bảo hộ của vắc-xin phòng bệnh do PCV2 Các nghiên cứu về trình tự gen cho thấy, PCV2 lưu hành ở hầu khắp các tỉnh thành Việt Nam được xếp vào genotype 2b, 2d và nhóm tái tổ hợp (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị

Mỹ Lệ và ctv, 2012; 2013; Phạm Hồng Quân và ctv, 2017) Tiêm vắc-xin PCV2 được

áp dụng rộng rãi ở Việt Nam, giúp cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỉ lệ chết và loại thải, giảm lượng vi-rút bài thải cũng như giảm bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết Tuy nhiên, tất cả các loại vắc-xin này đều dựa trên genotype PCV2a, trong khi đó PCV2 lưu hành ở Việt Nam chủ yếu thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái

tổ hợp Takahagi và ctv (2010) cho rằng, genotype của PCV2 có thể ảnh hưởng đến hiệu quả phòng PMWS bằng vắc-xin Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng PCV2b, genotype lưu hành phổ biến ở Việt Nam là cần thiết, nhằm giúp chủ động nguồn cung vắc-xin, góp phần hiệu quả trong phòng bệnh PMWS cũng như giảm giá thành

chăn nuôi Để cùng giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “Phân tích trình tự ORF2

của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa” được tiến hành

Mục tiêu của luận án

- Xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành tại một số tỉnh thành ở Việt Nam

- Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa

và 275 tiếng nước ngoài) và 12 phụ lục Trong tóm tắt luận án này, chúng tôi chỉ trình bày từ chương 2 trở đi và những phần chính của nội dung

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm

Được thực hiện từ năm 2012 đến 2018, tại Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y thuộc

Công ty cổ phần thuốc thú y trung ương NAVETCO, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam bao gồm 12 tỉnh thành phía Nam (Cà Mau, Cần Thơ, Bến Tre, Long An, Tp Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Bình Dương, Đồng Nai, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Phú Yên và Bình Định) và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ

(Nghệ An)

2.2 Vật liệu - Sinh phẩm - Bộ kit - Động vật thí nghiệm

Tế bào dòng thận heo PK15A, đối chứng dương PCV2b do Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc - AAHL cung cấp Bộ kít ly trích ADN QIAamp® Mini kit (QIAGEN, Đức), các hóa chất nuôi cấy tế bào (Gibco, Mỹ) Bộ kít ELISA Ingezim PCV IgG (Ingenasa, Tây Ban Nha), HRP protein A (Invitrogen, Mỹ), bromoethylamine (Sigma, Mỹ), sodium thiosulfate (Merck, Đức) Heo con 3 tuần tuổi từ một số trại heo thương phẩm đã được kiểm tra âm tính với kháng nguyên PCV2, CSFV, PRRSV và

Mycoplasma hyopneumoniae (kiểm tra bằng phương pháp PCR, RT-PCR)

2.3 Nội dung nghiên cứu

(1) Khảo sát đa dạng di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành miền Nam Việt Nam (2) Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập (3) Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu (4) Khảo sát tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2

vô hoạt nhũ dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành miền Nam Việt Nam

Tổng cộng 48 mẫu bệnh phẩm heo dương tính ADN-PCV2 được thu thập từ năm 2007-2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành phía Nam Việt Nam Mẫu bệnh phẩm được bảo quản ở -700C Xác định mẫu dương tính ADN-PCV2 bằng phương pháp PCR được thực hiện tại NAVETCO Gởi sản phẩm PCR để giải trình tự đoạn gen ORF2 PCV2 tại 1st BASE – Malaysia Trình tự chuỗi nucleotide gen ORF2 của các chủng vi-rút thực địa và các chủng vi-rút tham khảo được sắp xếp vào cột và so sánh tương đồng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (2013) Sử dụng phần mềm MEGA 5.2.2 (2012) theo phương pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại để thiết lập cây phát sinh chủng loại Sử dụng phần mềm RDP phiên bản 4.39 (2015) và SimPlot phiên bản 3.5.1 (2003) để phân tích sự tái tổ hợp và ước đoán vị trí tái tổ hợp (recombinant breakpoint)

2.4.2 Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập

2.4.2.1 Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, 9 mẫu phổi, 2 mẫu huyết thanh

và 1 mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã được xác định genotype) bằng cách nuôi cấy trên tế bào dòng PK15A theo quy trình được chuyển giao kỹ thuật từ Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc Mỗi mẫu được tiếp đời 3 lần Ở lần tiếp đời thứ 3, mẫu được xác định dương tính bằng phương pháp PCR hoặc nhuộm IPX, sau đó được xác định hiệu giá vi-rút Chuẩn độ hiệu giá PCV2 phân lập trên môi

trường tế bào PK15A theo quy trình của AAHL Hiệu giá vi-rút được thể hiện log10

TCID50/ml bằng phương pháp Reed-Muench (1938)

2.4.2.2 Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm

Sử dụng dịch nuôi cấy vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) ở lần tiếp đời thứ 6 (P6) để khảo sát hiệu giá vi-rút PCV2 trên tế bào PK15A với 5 tỉ số gây nhiễm (lượng vi-rút/ lượng tế bào), MOI (multiplicity of infection) khác nhau gồm 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 và 1 Cụ thể, tế bào PK15A dạng tế bào tươi (tế bào sau khi được tách rời bằng trypsin) được nhiễm vi-rút với lượng vi-rút/lượng tế bào được tính toán để đạt các tỉ số gây nhiễm MOI như trên Tế bào nhiễm được nuôi trên chai 25 cm2 (T25) với số lượng

2 T25/nồng độ/thời điểm thu hoạch Sau 24 giờ gây nhiễm tiến hành xử lý glucosamine như mô tả trong mục 2.5.4 của luận án Thu hoạch vi-rút ở 3 thời điểm khác nhau: 72, 96 và 120 giờ sau gây nhiễm Thí nghiệm được lặp lại 4 lần Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm và thời gian thu hoạch để thu được dịch vi-rút có hiệu giá cao nhất

D-2.4.2.3 Xác định thời gian thu hoạch tối ưu đối với các chủng phân lập

Các chủng phân lập NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) (ở lần tiếp đời thứ 7) được gây nhiễm trên tế bào PK15A (dạng tế bào tươi) với tỉ số gây nhiễm MOI = 0,1 Tế bào nhiễm được nuôi trên chai 25 cm2 (T25), với số lượng 2 T25/chủng/thời điểm thu hoạch Sau 24 giờ gây nhiễm, tiến hành xử lý D-glucosamine như mô tả trong mục 2.5.4 của luận án Thu hoạch vi-rút theo thời gian mỗi 12 giờ, từ thời điểm 36 giờ đến

120 giờ sau gây nhiễm Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 2 lần Xác định thời gian thu hoạch để thu được dịch vi-rút có hiệu giá cao nhất đối với từng chủng

2.4.2.4 So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập thuộc các genotype khác nhau

Các chủng vi-rút dùng trong thí nghiệm này là chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re) Các mẫu huyết thanh heo chứa kháng thể chống PCV2b: thu thập từ các heo đối chứng (6ĐC3, 8ĐC3 và 10ĐC3) ở 28 dpc trong thí nghiệm 3; chống PCV2d: 3 mẫu huyết thanh từ heo thu thập ở 28 ngày sau gây nhiễm với chủng NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) (số liệu thí nghiệm chưa công bố); chống PCV2-Re: 3 mẫu huyết thanh lưu trữ từ thí nghiệm gây nhiễm chủng NAVET-vietnam3/2004 trên heo của tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008)

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập

Mẫu huyết thanh heo Vi-rút trung hòa

Kháng PCV2b Trung hòa Trung hòa chéo Trung hòa chéo Kháng PCV2d Trung hòa chéo Trung hòa Trung hòa chéo Kháng PCV2-Re (2h)* Trung hòa chéo Trung hòa chéo Trung hòa

* PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018)

Thực hiện phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập thuộc genotype PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h) với các mẫu huyết thanh heo chứa kháng thể chống

lại PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h), mỗi mẫu huyết thanh được thực hiện lặp lại 2 lần Thí nghiệm được bố trí theo Bảng 2.2 Phương pháp trung hòa được thực hiện dựa theo quy trình của Fort và ctv (2007) (trình bày ở mục 2.5.3.3)

2.4.2.5 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b)

Chủng vi-rút NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), đã được khảo sát các đặc tính di truyền và đặc tính nuôi cấy trên môi trường tế bào PK15A được sử dụng Liều gây nhiễm: mỗi heo ở lô thí nghiệm được nhỏ mũi 2 ml và tiêm bắp 2 ml dịch vi-rút phân lập ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá 5,33log10 TCID50/ml Sử dụng dịch chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng

Thí nghiệm gồm 9 heo 3 tuần tuổi, tại thời điểm chuyển về cả 9 heo này đều có kháng thể thụ động kháng PCV2, hàng tuần heo được lấy máu để kiểm tra kháng thể PCV2 bằng phương pháp IPMA Tiến hành gây nhiễm thí nghiệm lúc heo 10 tuần tuổi Nhằm tránh ảnh hưởng của kháng thể thụ động đến việc đánh giá tính gây bệnh của PCV2 trên heo, 6 heo (có ký hiệu 1TN1, 4TN1, 5TN1, 6TN1, 10TN1, 12TN1) có hiệu giá kháng thể thụ động  5,32log2 được chọn vào lô thí nghiệm Ba heo (có ký hiệu 2ĐC1, 3ĐC1, 11ĐC1) vẫn còn kháng thể thụ động (trung bình 10,31log2) được xếp vào lô đối chứng Hai lô heo được nuôi ở 2 khu chuồng riêng biệt Theo dõi các biểu hiện lâm sàng về hô hấp (khó thở, ho, chảy dịch mũi), tiêu chảy, sưng hạch bẹn cạn, tình trạng lông, da Đo nhiệt độ trực tràng heo ngày 2 lần, từ thời điểm trước gây nhiễm 3 ngày đến 21 ngày sau gây nhiễm (day post challenge - dpc) Cân khối lượng heo, lấy máu kiểm tra số lượng bạch cầu, tình trạng vi-rút huyết, hiệu giá kháng thể tại các thời điểm 0, 7, 14 và 21 dpc

Mổ khảo sát bệnh tích ở 7 dpc (heo 6TN1, lô thí nghiệm), 14 dpc (heo 5TN1, lô thí nghiệm và heo 3ĐC1, lô đối chứng) và 21 dpc (heo 10TN1, lô thí nghiệm)

2.4.3 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu

2.4.3.1 Quy trình vô hoạt PCV2

- Xác định nồng BEI bất hoạt hoàn toàn PCV2

Vi-rút: dịch nuôi cấy chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) ở lần tiếp đời thứ 8

đã chuẩn độ hiệu giá vi-rút đạt 6log10 TCID50/ml

Quy trình vô hoạt PCV2 được xây dựng dựa trên quy trình của Bahnemann (1975; 1990) Binary ethylenimine (BEI) 0,1 M được chuẩn bị bằng cách tạo vòng 2-bromoethylamine trong 0,2 M NaOH trong 1 giờ ở 370C và trữ ở 40C và sử dụng trong vòng 18 giờ sau khi chuẩn bị PCV2 được vô hoạt bằng cách ủ với các nồng độ BEI cuối cùng khác nhau 1 mM, 3 mM và 5 mM ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ Thể tích dịch vi-rút ở mỗi nồng độ BEI là 200 ml Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút mỗi giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt BEI được trung hòa bằng 0,1 mM sodium thiosulphate trong vòng 2 giờ ở 370C Vi-rút sau khi vô hoạt được trữ ở -700C Xác định vi-rút đã được

vô hoạt hoàn toàn hay chưa bằng cách ủ 1 ml dịch vi-rút sau khi vô hoạt với tế bào PK15A, đánh giá như trong quy trình phân lập PCV2 Thí nghiệm trên được thực hiện lặp lại 2 lần PCV2 được xem là đã vô hoạt hoàn toàn khi kết quả phân lập dịch vi-rút sau khi bất hoạt ở 3 lần tiếp đời đều âm tính

- Xác định khả năng bất hoạt hoàn toàn PCV2 thuộc các chủng khác nhau với nồng

độ BEI 3 mM

Nhằm xác nhận khả năng vô hoạt hoàn toàn các chủng PCV2 thuộc các genotype khác nhau của BEI ở nồng độ thích hợp Sau khi xác định được nồng độ BEI 3 mM có thể vô hoạt hoàn toàn PCV2 chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), tiến hành vô hoạt đồng thời các chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) ở nồng độ BEI 3 mM, nhiệt độ

370C trong vòng 24 giờ Thể tích dịch vi-rút mỗi chủng là 200ml Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút mỗi giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt BEI được trung hòa bằng sodium thiosulphate 1 M với thể tích bằng 10% thể tích BEI sử dụng, trong vòng 2 giờ ở 370C Vi-rút sau khi vô hoạt được trữ ở -700C

2.4.3.2 Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu

Chế tạo vắc-xin vô hoạt nhũ dầu chứa kháng nguyên PCV2 chủng DongNai2/2009: Vi-rút sau khi vô hoạt (đã được kiểm tra vô hoạt hoàn toàn) được phối trộn với nhũ dầu theo công thức nhũ của Công ty NAVETCO, mỗi liều vắc-xin (2 ml) chứa lượng kháng nguyên vi-rút lần lượt là 4,5log10 hoặc 6,0log10TCID50/liều (hiệu giá vi-rút trước khi vô hoạt)

NAVET-2.4.3.3 Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm

Thí nghiệm 2: Đánh giá an toàn và khả năng gây đáp ứng miễn dịch của vắc-xin

thử nghiệm Năm heo 3 tuần tuổi (âm tính với PCV2, CSFV và PRRSV được xác định bằng phương pháp PCR và RT-PCR) được chuyển về trại chăn nuôi của Công ty NAVETCO Tại thời điểm chuyển về heo vẫn còn kháng thể thụ động kháng PCV2 Lúc 7 tuần tuổi có 3 heo có hiệu giá kháng thể thụ động giảm xuống thấp (hiệu giá IPMA trung bình 6,64log2) được bố trí vào lô vắc-xin gồm 3 heo (các heo có ký hiệu 5TN2, 9TN2, 11TN2) được tiêm vắc-xin 2 lần (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên 4,5log10 TCID50/liều) cách nhau 21 ngày và lô đối chứng gồm 2 heo (heo có ký hiệu 14ĐC2, 15ĐC2) (có hiệu giá kháng thể thụ động còn cao, hiệu giá IPMA trung bình 9,64log2) mỗi heo được tiêm 2 ml dịch chiết tế bào PK15A

Biểu hiện lâm sàng được theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước tiêm vắc-xin 3 ngày đến sau tiêm vắc-xin lần thứ nhất 21 ngày và sau tiêm vắc-xin lần thứ hai 28 ngày bao gồm: phản ứng viêm ngay vị trí tiêm, phản ứng toàn thân, các biểu hiện về hô hấp, tiêu hóa, tình trạng lông, da Thân nhiệt: đo nhiệt độ trực tràng heo ngày 2 lần sáng (8 giờ) và chiều (16 giờ) từ thời điểm trước tiêm vắc-xin 3 ngày đến sau tiêm vắc-xin 21 ngày Trọng lượng: cân khối lượng heo lúc 0 và 21 sau tiêm vắc-xin lần 1 và 28 ngày sau tiêm vắc-xin lần 2

Kháng thể chống PCV2 được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 ngày sau tiêm xin lần 1, và vào các thời điểm 7, 14, 21, 28 ngày sau tiêm vắc-xin lần 2

vắc-Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu lực của vắc-xin thử nghiệm: gồm 10 heo 3 tuần tuổi

được chọn lựa có kháng thể thụ động IPMA thấp (5,64log2 – 6,64log2) Heo được bố trí gồm 2 lô: lô vắc-xin gồm 6 heo (heo số 1TN3, 2TN3, 3TN3, 4TN3, 5TN3, 7TN3) được tiêm 1 liều vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên 6,0log10

TCID50/liều) và lô đối chứng gồm 4 heo (heo số 6ĐC3, 8ĐC3, 9ĐC3, 10ĐC3) được tiêm

2 ml dịch chiết tế bào PK15A lúc heo 4 tuần tuổi Sau tiêm vắc-xin 28 ngày, tất cả heo

được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml và tiêm bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá 5,33log10TCID50/ml

Biểu hiện lâm sàng và thân nhiệt được theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước tiêm vắc-xin 3 ngày đến sau tiêm vắc-xin 28 ngày và sau công cường độc 28 ngày Cân heo lúc 0 và 28 dpv và 28 dpc Kháng thể chống PCV2 được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21, 28 dpv và 7, 14, 21, 28 dpc Tình trạng vi-rút huyết, số lượng bạch cầu, tình trạng bài xuất vi-rút qua phân và dịch tiết mũi được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 và 28 dpc Bệnh tích đại thể và vi thể: lúc 28 ngày sau công độc, chọn 2 heo có khối lượng cơ thể nhỏ nhất, biểu hiện lâm sàng bất thường ở mỗi lô mổ khảo sát bệnh tích

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích di truyền của các phân lập PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam 3.1.1 Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2

Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của 48 mẫu PCV2 thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 13 tỉnh thành Việt Nam (Hình 3.1) cho thấy, các mẫu PCV2 được xếp vào PCV2b chiếm 50,00% (24/48), PCV2d chiếm 33,33% (16/48) và PCV2-Re (2h) chiếm 16,67% (8/48), không có mẫu PCV2 nào được xếp vào genotype PCV2a Theo cách phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) một số chủng PCV2 trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp nay được xếp vào genotype PCV2h Vì thế trong phần trình bày này các chủng PCV2 trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp mà nay theo cách phân loại mới được xếp vào PCV2h sẽ được viết tắt là PCV2-Re (2h)

Sự phân bố theo thời gian và nguồn gốc địa lý của 48 mẫu PCV2 trong nghiên cứu này được thể hiện qua Biểu đồ 3.1 và Biểu đồ 3.2 Qua đó cho thấy sự lưu hành phổ biến của genotype PCV2b qua các năm khảo sát, đồng thời có sự xuất hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là PCV2d-2 Có sự lưu hành cùng lúc nhiều genotype trên cùng địa phương Các nghiên cứu dịch tễ học trên toàn thế giới đã chứng minh sự phân bố theo thời gian của các genotype PCV2 và có sự biến đổi toàn cầu từ PCV2a sang PCV2b và sự xuất hiện vượt trội của PCV2b từ sau năm 2003 (Olvera và ctv, 2007; Cortey và ctv, 2011) Các nghiên cứu gần đây cho thấy, PCV2d đặc biệt là PCV2d-2 lưu hành khá phổ biến và thậm chí trở nên vượt trội hơn so với PCV2b (Xiao

DQ629115/isolate n32eu/USA/2005 EU340258/strain 16845/USA/2007 EU340257/strain 17639/Canada/2006

TpHCM3/2010 NAVET-DongNai2/2009 BinhDinh6/2013 CaMau/2007 BinhDuong7/2013 KhanhHoa/2007 BinhDuong1/2009 BinhDuong3/2009 PhuYen/2014 BinhDuong11/2015 NAVET-TpHCM8/2016 LamDong2/2013 NAVET-BinhDuong2/2009

KF871068/strain SNUVR000463/Korea

BinhDinh5/2013

AAHL-strain

DongNai4/2013 DongNai1/2009 BinhDuong5/2010

AY181946/strain TJ/China/2002

PCV2d-1

NAVET-LongAn2/2012 BinhDuong10/2014 LamDong3/2013 BinhDuong9/2014 LamDong1/2013 BinhDinh1/2013 TayNinh/2014 LongAn1/2012 LongAn3/2012 DongNai8/2016 NAVET-NgheAn1/2015 NAVET-NgheAn2/2015

KJ133547/strain SNUVR130689/Korea/2013

BinhDuong12/2016 DongNai7/2016

JX535296/isolate 22625-33/USA/2012

BinhDuong8/2013

HM038017/strain BDH/China/2008 JQ181600/isolate Han8/Vietnam/2011 KJ437506/strain SNUVR140004/Korea/2013 KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016 KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016

PCV2d-2

PCV2d

MH465453/strain GXLZ1208a/China/2012 MH465473/strain GXYL1208/China/2012

CanTho/2008

JX099781/isolate P477LG/Vietnam/2009

vietnam2/2006

HQ395058/strain 10QH/China/2010 KJ729072/isolate PCV2Izn-89-13/India/2013 KM042398/strain 549-QNa/Vietnam/2009

TpHCM4/2010 BinhDinh4/2013

NAVET-vietnam3/2004

BinhDinh2/2013 TpHCM2/2010 BinhDuong6/2012 BinhDinh3/2013

HM038034/strain LG/China/2008

PCV2a

MF139076/isolate SC5/China/1999 KT369067/strain Papuan 04.1/Indonesia/2013 LC004750/isolate MZ-5/India/2013

PCV2f JN006443/isolate WB/ROM3/Romania/2008

FJ998185/strain SCNB/CHA/05/China/2005 JX099786/isolate P2425NT/Vietnam/2008

PCV2g EU148503/isolate DK1980PMWSfree/Danmark/1980 KJ094599/strain PM163/Brazil/2010 PCV2c

KT867799/isolate PCV2/USA/MN-088/2006 KT867801/isolate PCV2/MEX/YU-002/2012 KT795287/strain MEX/41238/2014 KX510062/isolate 19792-IA-2016-APRIL KT795290/strain USA/45358/2015 KT867795/isolate PCV2/USA/IA-084/2013

PCV2e 99

99 99

98 99

97 9664 64

58 94 99 98

76 64

89 87 87

mức độ trại cũng đã được Kwon và ctv (2017a) ghi nhận khi nghiên cứu sự đa dạng di truyền và sự biến đổi genotype PCV2 xảy ra ở Hàn Quốc Tuy nhiên, vấn đề này cần được nghiên cứu thêm

Biểu đồ 3.2 Phân bố địa lý của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam từ năm

2007 đến 2016

3.1.2 Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2

Kết quả phân tích khoảng cách di truyền trong cùng genotype và giữa các genotype PCV2 dựa trên ORF2 của 48 mẫu PCV2 lưu hành ở miền Nam Việt Nam trong khoảng thời gian từ năm 2007 đến 2016 cho thấy, các mẫu PCV2 được xếp vào genotype

PCV2d có tính đa dạng di truyền cao nhất với khoảng cách di truyền p = 0,0078  0,0018, cao gần gấp đôi so với các mẫu PCV2 được xếp vào PCV2b (p = 0,0038  0,0014) và PCV2-Re (2h) (p = 0,0038  0,0010) Ngoài ra, khoảng cách di truyền giữa

các genotype biến động từ 0,0595  0,0096 đến 0,0663  0,0102, các giá trị này cao

hơn rất nhiều so với giá trị ngưỡng phân định genotype p = 0,035 (Segalés và ctv,

2008) Nhìn chung, khoảng cách di truyền giữa các genotype khá cao, là cơ sở để phận định thành các genotype riêng biệt

2

1 2

1

2

2 4

1

3 1 3

Biểu đồ 3.1

Phân bố thời gian của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam từ năm 2007 đến 2016

3.1.3 Đặc điểm ORF2 của các chủng PCV2 ở Việt Nam

Bảng 3.2 Các a-xít a-min của protein Cap khác nhau giữa các genotype PCV2

Phân tích kết quả giải trình tự toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2 cho thấy, chiều dài toàn bộ ORF2 là 702 nt (24/48) đối với các mẫu PCV2 được xếp vào genotype PCV2b, hoặc 705 nt (24/48) đối với các mẫu PCV2 được xếp vào PCV2d hoặc PCV2-Re (2h) Chiều dài chuỗi polypeptide của protein capsid suy ra từ trình tự chuỗi nucleotide tương ứng là 233 hoặc 234 aa Phân tích sự tương đồng về a-xít a-min giữa các genotype của PCV2 cho thấy, chiều dài toàn bộ protein capsid của PCV2a và PCV2b là 233 aa, tuy nhiên ở PCV2d, PCV2c và PCV2-Re (2h) thì chiều dài protein capsid là 234 aa, thêm lysine (ký hiệu K) ở vị trí 234 (Bảng 3.2)

Mức độ tương đồng giữa 24 mẫu PCV2 được xếp vào genotype PCV2b khá cao, từ 98,7% đến 100% về nucleotide và từ 97,8% đến 100% về a-xít a-min Tương đồng với chủng chủng 48285 và chủng WuHan từ 98,5% - 99,8% về nucleotide, và 97,8% -99,5%

về a-xít amin So sánh tương đồng giữa các mẫu PCV2d-2 trong nghiên cứu này với nhau và với một số chủng tham khảo trên thế giới cho thấy chúng tương đồng với nhau rất cao (98,5 - 100% về nucleotide và 98,2 - 100% về a-xít a-min) và chúng tương đồng với chủng BDH và chủng SNUVR130689, từ 99,0% - 99,8% về nucleotide và từ 99,1 - 100% về a-xít a-min Mức độ tương đồng giữa các mẫu PCV2 được xếp vào genotype PCV2-Re (2h) biến động từ 98,7% đến 100% về nucleotide và về a-xít a-min, các mẫu PCV2 này tương đồng rất cao với phân lập HUN-11

3.1.4 Phân tích sự tái tổ hợp

Kết quả phân tích bằng phần mềm RDP4 và SimPlot 3.5.1 cho thấy có sự tái tổ hợp xảy ra trên 8 mẫu PCV2 thuộc genotype PCV2-Re (2h)), bao gồm các mẫu CanTho/2008, TpHCM2/2010, TpHCM4/2010, TpHCM5/2010, BinhDuong6/2012, BinhDinh2/2013, BinhDinh3/2013, BinhDinh4/2013, có bố mẹ giả định là chủng AY181946/strain

TJ/China/2002 (PCV2d) (major parent) và AF465211/strain SC/Taiwan/2002 (PCV2a) (minor parent) với phần trăm tương đồng tương ứng là 95,7 – 96,3% và 95,1 – 96,2% Trong đó, 7/8 mẫu có vị trí tái tổ hợp bắt đầu ở nucleotide 96 và kết thúc ở vị trí 227 hoặc

238, riêng mẫu CanTho/2008 tuy có cùng bố mẹ nhưng vị trí tái tổ hợp khác biệt so với các mẫu còn lại với điểm bắt đầu ở vị trí 677 và kết thúc ở vị trí 227 (vị trí trên gen ORF2) Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại Trong đó, mẫu CanTho/2008 xếp trong nhóm PCV2-Re (2h) nhưng lại nằm ở 1 nhánh riêng biệt so với các mẫu còn lại trong nhóm (Hình 3.1)

3.2 Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2

3.2.1 Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa

Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, 9 mẫu phổi, 2 mẫu huyết thanh

và 1 mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã được xác định genotype ở phần 3.1) trên tế bào dòng PK15A Kết quả sau 3 lần tiếp đời phân lập được 18/21 (85,71%) mẫu dương tính PCV2 (Bảng 3.5) Trong các loại mẫu bệnh phẩm dùng phân lập PCV2 thì mẫu hạch đạt tỉ lệ phân lập dương tính cao nhất 100% (9/9) với hiệu giá vi-rút ở lần tiếp đời thứ 3 biến động từ 1,67 đến 5,50log10 TCID50/ml Ngoài ra, PCV2 cũng phân lập được từ mẫu huyết thanh, nhưng hiệu giá vi-rút ở lần tiếp đời thứ 3 khá thấp, chỉ đạt 1,67log10 TCID50/ml Đã phân lập được 9/18 (50%) mẫu PCV2 dương tính thuộc genotype PCV2b, 6/18 (33,33%) mẫu dương tính thuộc genotype PCV2d và 3/18 (16,67%) mẫu dương tính thuộc genotype PCV2-Re (2h)

3.2.2 Xác định liều lượng gây nhiễm của chủng NAVET-DongNai2/2009 trên

Biểu đồ 3.4 Hiệu giá vi-rút theo hệ số MOI và thời gian thu hoạch của

chủng NAVET-DongNai2/2009 a, b, c: khác biệt thống kê với P < 0,05

Bảng 3.5 Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

ST

type

Loại mẫu Loại heo

Triệu chứng lâm sàng a

Kết quả phân lập

Hiệu giá b (P3) log 10 TCID 50 /ml

7 NAVET-DongNai2/2009 2b Hạch 16 tuần Còi, khó thở, viêm da, da nhợt nhạt + 4,50

8 TpHCM6/2010 2b Phổi Sau cai sữa Triệu chứng hô hấp: ho, khó thở + 1,67

9 BinhDinh5/2013 2b Huyết thanh Nái Mắc bệnh tai xanh, sinh ra heo con chết + 1,67

10 BinhDinh6/2013 2b Huyết thanh Nái Mắc bệnh tai xanh, sẩy thai + 1,67

12 NAVET-LongAn2/2012 2d-2 Hạch Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da + 5,50

19 TpHCM4/2010 Re (2h) Hạch Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da + 4,33

20 BinhDuong6/2012 Re (2h) Phổi 1 tuần tuổi Gầy trơ xương, tiêu chảy nặng + 1,67

* Re: recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018)

a: Các heo được xác định mắc bệnh tai xanh và dịch tả heo thông qua triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và xác định có sự hiện diện của vi-rút PRRS và CSF trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp RT-PCR

b: xem Phụ lục 6

Xác định liều lượng gây nhiễm thông qua việc xác định hệ số gây nhiễm (multiplicity of infection - MOI) Kết quả ghi nhận có sự gia tăng hiệu giá vi-rút cùng với sự gia tăng của hệ số MOI (Biểu đồ 3.4) Trung bình hiệu giá vi-rút thu hoạch ở thời điểm 96 giờ (5,32  0,65log10 TCID50/ml) sau nhiễm đạt cao hơn so với thời điểm thu hoạch 72 giờ (5,26  0,66log10 TCID50/ml) và 120 giờ (5,14  0,57log10 TCID50/ml), tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê (P

> 0,05) Kết quả so sánh hiệu giá vi-rút thu được giữa các hệ số MOI cho thấy không có sự khác biệt về hiệu giá vi-rút thu được giữa hệ số MOI = 1 (5,86  0,29 log10 TCID50/ml) và MOI = 0,1 (5,72  0,30log10 TCID50/ml); MOI = 0,1 (5,72  0,30log10 TCID50/ml) và MOI = 0,05 (5,46  0,35log10 TCID50/ml); MOI

= 0,02 (4,67  0,26log10 TCID50/ml) và MOI = 0,01 (4,50  0,17log10

TCID50/ml) Tuy nhiên, có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hiệu giá thu được ở hệ

số MOI = 0,05 và MOI = 1; MOI = 0,01 và 0,02 so với MOI = 0,05; 0,1 và 1 (P < 0,05) Từ kết quả nghiên cứu này chúng tôi chọn hệ số MOI = 0,1 để tiếp tục khảo sát khả năng nhân lên của các phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

3.2.3 Khả năng gây bệnh tích tế bào

Khi gây nhiễm PCV2 trên tế bào PK15A với hệ số MOI thấp 0,01 – 0,02 không ghi nhận được sự khác biệt về hình dạng giữa tế bào bị nhiễm vi-rút và tế bào đối chứng Tuy nhiên, khi gây nhiễm vi-rút với hệ số MOI từ 0,05 trở lên nhận thấy có sự thay đổi hình dạng ở các tế bào bị nhiễm vi-rút: tế bào có vẻ to hơn, co tròn, đậm màu và có nhiều tế bào chết so với tế bào đối chứng không nhiễm Kết quả nghiên cứu này tương tự như báo cáo của Dvorak và ctv (2013) khi gây nhiễm PCV2 trên dòng tế bào võng mạc bào thai heo VR1BL (porcine fetal retina cell line) Như trình bày ở trên, hiệu giá vi-rút thu được ở các mức MOI thấp cũng thấp hơn so với các mức MOI cao Điều này cho thấy có mối liên hệ giữa MOI và hiệu giá vi-rút thu nhận được và biểu hiện về hình dạng của

tế bào nhiễm Có thể ghi nhận được bệnh tích tế bào ở hệ số MOI cao ( 0,1)

3.2.4 Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

Kết quả đường cong sinh trưởng các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A với hệ

số gây nhiễm MOI = 0,1 (Biểu đồ 3.5) Trung bình hiệu giá vi-rút qua các thời điểm thu hoạch khác nhau của chủng NAVET-vietnam3/2004 cao nhất (5,20  0,31log10 TCID50/ml), kế đến là chủng NAVET-LongAn2/2012 (4,75  0,60log10

TCID50/ml) và thấp nhất là chủng NAVET-DongNai2/2009 (4,30  0,62log10

TCID50/ml) (P < 0,01) Ngoài ra, có sự khác biệt về trung bình hiệu giá vi-rút ở các thời điểm thu hoạch khác nhau (P < 0,01) Phân tích đường cong sinh trưởng cho thấy, thời điểm thu hoạch để đạt hiệu giá vi-rút cao nhất khác nhau tùy theo chủng PCV2, cụ thể, đối với chủng NAVET-vietnam3/2004 là 72 giờ, chủng NAVET-DongNai2/2009 là 84 giờ và chủng NAVET-LongAn2/2012 là 108 giờ