Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía nam và nghiên cứu vắc xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa

Các nghiên cứu thí nghiệm và thực địa đã chứng minh hiệu quả của việc phòng PMWS bằng vắc-xin như cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỷ lệ chết, tỷ lệ loại thải, giảm lượng v

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

LÊ TH Ị THU PHƯƠNG

Chuyên ngành: B ệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi

Mã s ố: 9.64.01.02

LU ẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Nguy ễn Ngọc Hải

TS Nguy ễn Thị Thu Hồng

TP H ồ Chí Minh – tháng 11 năm 2019

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận án này là trung thực, một phần dữ liệu

là công trình nghiên cứu của tôi chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác, một phần dữ liệu trong luận án thuộc đề tài độc lập trong chương trình nhiệm vụ nghiên cứu đặc thù, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đặt hàng theo công văn số 2151/BNN-KHCN ngày 21/4/2011 và theo hợp đồng số 23 HĐ/TC-KHCN giữa Văn phòng Bộ NN-PTNN và Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y – Công ty TNHHMTV Thuốc Thú Y Trung Ương – NAVETCO ngày 07/6/2011 do TS Nguyễn Thị Thu Hồng làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận án được phép công bố với

sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì

Tác giả

Lê Thị Thu Phương

L ỜI CẢM ƠN

Xin thành kính biết ơn công lao sinh thành dưỡng dục đến Ba Má

Xin thành kính ghi ơn PGS TS Nguyễn Ngọc Hải và TS Nguyễn Thị Thu Hồng đã hết lòng hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình công tác,

học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này

Xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Tất Toàn, PGS.TS Lâm Thị Thu Hương, PGS TS Nguyễn Văn Khanh, TS Hồ Thị Kim Hoa, PGS.TS Lê Thanh

Hiền, PGS.TS Trần Thị Dân, PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân đã động viên và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Công ty Cổ phần Thuốc Thú Y Trung Ương NAVETCO, BLĐ Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y đã đồng ý và tạo điều kiện về thời gian, cơ sở vật chất để tôi được học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành luận án này

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm và quý Thầy Cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng đạo tạo sau đại học đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cũng như những hỗ trợ khác để tôi hoàn thành khóa học

Xin chân thành cảm ơn Ông Chris J Morrissy và Ông Darren Schafer thuộc phòng thí nghiệm Australian Animal Health Laboratory – CSIRO, đã cung cấp một

số sinh phẩm trong nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn Anh Đặng Hùng, Chị Lam Hương và các bạn đồng nghiệp Ngọc Ánh, Nhị Hà, Vô Ngôn, Hồng Phúc, Tấn Liêm, Hào Quang, Thu Lâm, Minh Hải ở Trung Tâm Nghiên Cứu, bạn Kim Phúc và anh Hải, Chị Thu Hà, Chị Diệu Thúy, Em Thanh Phong đã đồng hành và động viên tôi trong suốt quá trình học

tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài

Xin gởi lời cảm ơn và lời yêu thương chân thành đến đại gia đình đã ủng hộ, động viên tôi trong công tác, học tập và hoàn thành luận án

Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2 thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam (gồm 12 tỉnh phía Nam và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ) cho thấy, có sự lưu hành đồng thời PCV2b, PCV2d

và PCV2-Re (2h) (trước đây được xếp vào nhóm PCV2 tái tổ hợp, theo cách phân

loại mới được xếp vào genotype PCV2h), trong đó phổ biến nhất là PCV2b (24/48)

Sự xuất hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là

PCV2d-2 (15/16 mẫu thuộc PCVPCV2d-2d) từ năm PCV2d-201PCV2d-2 trở đi Mức độ tương đồng về nucleotide ở

mỗi genotype tương ứng 98,7% - 100% đối với PCV2b, 98,5 - 100% đối với

PCV2d-2 và PCVPCV2d-2-Re (PCV2d-2h) là 98,7 - 100% Khoảng cách di truyền (p - distance) giữa các

genotype khá cao, từ 0,0595  0,0096 đến 0,0663  0,0102, cao hơn rất nhiều so với

ổn định qua các lần tiếp đời (≥ 5,0log10 TCID50/ml): NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) được sử dụng để lựa chọn làm giống gốc nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng

bệnh do circovirus trên heo

Đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc các genotype khác nhau bằng phản ứng trung hòa chéo Kết quả cho thấy giữa chủng NAVET-

DongNai2/2009 và NAVET-vietnam3/2004 tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên với

hệ số R là 104,20% Hệ số R giữa chủng DongNai2/2009 và chủng LongAn2/2012; giữa NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 tương ứng là 91,60% và 91,30%, tất cả đều > 70% Qua đây cho thấy, cả 3 chủng này tuy khác nhau

NAVET-về genotype nhưng tương đồng với nhau về kháng nguyên

Từ các kết quả nghiên cứu về đặc tính di truyền, nuôi cấy trên tế bào, tương đồng kháng nguyên cho thấy, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) đáp ứng đầy

đủ các tiêu chí để được chọn làm giống gốc trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin

Sử dụng binary ethylenimine (BEI) để bất hoạt vi-rút chế tạo kháng nguyên PCV2, với nồng độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn các vi-rút thuộc các chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 và NAVET-LongAn2/2012, với tốc độ bất hoạt tương ứng với các chủng lần lượt là 0,71; 0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ

Đánh giá hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) Thí nghiệm 3: lúc 4 tuần tuổi, heo ở lô thí nghiệm (n = 6) được tiêm vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên

106,0TCID50) và sử dụng dịch chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng (n = 4) Sau tiêm vắc-xin 28 ngày, tất cả heo được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml và tiêm

bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá 5,33log10TCID50/ml Ở lô thí nghiệm, heo có sự chuyển đổi kháng thể ở 14 - 21 ngày sau tiêm vắc-xin Heo sau tiêm vắc-xin và công cường độc đều khỏe mạnh, tăng trọng bình thường, có thời gian vi-rút huyết ngắn, bài thải vi-rút qua phân và dịch tiết mũi

với tỉ lệ thấp hơn so với heo đối chứng Tỉ lệ heo mắc PMWS trên lô vắc-xin là 0/6

và ở lô đối chứng là 1/4 Kết quả cho thấy vắc-xin vô hoạt nhũ dầu này có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm sàng chống lại PCV2b, giảm tỉ lệ heo có vi-rút huyết và giảm hiệu giá vi-rút trong mô lúc 28 ngày sau công cường độc

Full-length ORF2 of 48 PCV2 isolates from 44 pig farms in 13 provinces in Vietnam (including 12 Southern and 1 North Central Coast provinces) between 2007 and 2016 was analysed nucleotide sequence The results showed that genotype PCV2b, PCV2d and PCV2-Re (2h) (formerly classified as recombinant cluster) co-existed, of which the most prevalent genotype was PCV2b (24/48) PCV2d genotype was emergent and predominant, especially PCV2d-2 (15/16) from 2012 onwards Nucleotide homology for each genotype was 98.7% - 100% for PCV2b, 98.5 - 100%

for PCV2d-2 and 98.7 - 100% for PCV2-Re (2h) p - distance among genotypes were

quite high and range from 0.0595  0.0096 to 0.0663  0.0102

Eighteen PCV2 strains were isolated from the PCV2 PCR positive samples, belonged to genotype PCV2b (9 strains), PCV2d (6 strains) and PCV2-Re (2h) (3 strains) The viral titer of PCV2 isolates at the third passages in PK15A cells was in the ranges from 1.67 to 5.50log10 TCID50/ml Three PCV2 field strains, which the viral titers were stably high (≥ 5.0log10 TCID50/ml) through passages, belonged to different genotypes, namely NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) and NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)), were selected as master seed for studying of PCV2 vaccines

Applying cross neutralization test and R value (cross-reactivity value) to determine antigenic diversity of PCV2 strains The R value obtained by cross neutralization test between NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-vietnam3/2004 was 104.20%; NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012; NAVET-

LongAn2/2012 and NAVET-vietnam3/2004 were 91.60% and 91.30%, respectively These results indicated that no antigenic differences were found among these strains (R > 70%)

Using binary ethylenimine (BEI) to inactivate virus for producing PCV2 antigen, BEI at 3 mM, 370C after 24 hours was able to inactivate completely NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012 strains with inactivation rates 0.71; 0.86 and 1.33log10 TCID50 per hour, respectively

Efficacy of experimental inactivated oil emulsion PCV2 vaccine based on NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) strain: Experiment 3: at 4 weeks of age, vaccine group (n = 6) were vaccinated with the experimental PCV2 vaccine (2 ml/dose, contains 106.0TCID50) by intramuscular route, and control group (n = 4) were injected with 2 ml of PK15A cell extract After 4 weeks post-vaccination, the vaccinated together with unvaccinated controls were challenged intranasally and intramuscularly with 4x105,33TCID50 of NAVET-DongNai2/2009 strain, and observed for 28 days post challenge The seroconversion started at 14 - 21 dpv in vaccinated pigs The vaccinated pigs had no increase in body temperature, without any clinical signs during the experiment The obtained results indicated that this vaccine induced immunological responses in vaccinated pigs that appeared to provide clinically protective against PCV2b infection Viremia, shedding and viral load in tissues were reduced in vaccinated pigs compared to controls

M ỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt/Summary iv

Mục lục viii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt xii

Danh mục các bảng xv

Danh mục các hình, biểu đồ và sơ đồ xvii

Mở đầu 4

Chương 1 Tổng quan 4

1.1 Giới thiệu về PCV2 4

1.1.1 Phân loại PCV2 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2 5

1.1.3 Đặc điểm nuôi cấy của PCV2 6

1.2 Các bệnh do circovirus trên heo 8

1.2.1 Tên gọi 8

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ 9

1.2.3 Cơ chế sinh bệnh 11

1.2.4 Đáp ứng miễn dịch chống PCV2 13

1.2.5 Triệu chứng và bệnh tích 17

1.2.6 Các biện pháp phòng và kiểm soát PMWS 18

1.3 Các nghiên cứu về di truyền của PCV2 18

1.3.1 Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 trên thế giới 18

1.3.2 Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 ở Việt Nam 21

1.4 Các nghiên cứu về vắc-xin PCV2 22

1.4.1 Các loại vắc-xin PCV2 22

1.4.1.1 Vắc-xin cổ điển 22

1.4.1.2 Vắc-xin thế hệ mới 23

1.4.2 Các nghiên cứu vắc-xin PCV2 ở Việt Nam 26

1.4.3 Hiệu quả của việc tiêm phòng vắc-xin PCV2 27

1.4.3.1 Lâm sàng 27

1.4.4.2 Cận lâm sàng 28

1.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2 30

1.4.5.1 Kháng thể thụ động 30

1.4.5.2 Quy trình tiêm phòng 31

1.4.5.3 Các tác nhân đồng nhiễm 33

1.4.5.4 Sự biến đổi di truyền của PCV2 34

1.4.6 Thất bại sau tiêm phòng vắc-xin PCV2 34

1.5 Cơ sở khoa học nghiên cứu sản xuất vắc-xin PCV2 35

1.5.1 Cơ sở chọn thể loại vắc-xin để nghiên cứu 35

1.5.2 Cơ sở chọn chủng vi-rút vắc-xin 36

1.5.3 Cơ sở lựa chọn chất vô hoạt PCV2 36

1.5.4 Cơ sở lựa chọn chất bổ trợ 38

1.5.5 Tiêu chuẩn đánh giá vắc-xin 39

1.5.5.1 An toàn 39

1.5.5.2 Hiệu lực 39

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 43

2.1 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 43

2.1.1 Địa điểm 43

2.1.2 Thời gian 43

2.1.3 Đối tượng 43

2.2 Nội dung nghiên cứu 43

2.3 Vật liệu, hóa chất 43

2.3.1 Vật liệu thí nghiệm 43

2.3.2 Hóa chất và các sinh phẩm 44

2.3.3 Dụng cụ và trang thiết bị 45

2.4 Phương pháp nghiên cứu 45

2.4.1 Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam 45

2.4.2 Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập 47

2.4.2.1 Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A 47

2.4.2.2 Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm 48

2.4.2.3 Xác định thời gian thu hoạch tối ưu đối với các chủng phân lập 49

2.4.2.4 So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập thuộc các genotype khác nhau 50

2.4.2.5 Thí nghiệm 1 Đánh giá khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVET-DongNai2/2009 52

2.4.3 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu 55

2.4.3.1 Quy trình vô hoạt PCV2 55

2.4.3.2 Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu 56

2.4.3.3 Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm 56

2.5 Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu 59

2.5.1 Phương pháp ly trích ADN 59

2.5.2 Kỹ thuật PCR phát hiện PCV2 59

2.5.3 Các phương pháp huyết thanh học 60

2.5.3.1 Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp định lượng kháng thể 60

2.5.3.2 Phương pháp ELISA phát hiện IgG 60

2.5.3.3 Phương pháp trung hòa 60

2.5.4 Phương pháp phân lập PCV2 trên tế bào PK15A 61

2.5.5 Phương pháp chuẩn độ PCV2 62

2.6 Xử lý thống kê 62

Chương 3 Kết quả và thảo luận 63

3.1 Phân tích di truyền của các mẫu PCV2 tại một số tỉnh thànhViệt Nam 63

3.1.1 Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2 63

3.1.2 Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2 67

3.1.3 Đặc điểm ORF2 của các chủng PCV2 ở Việt Nam 68

3.1.4 Phân tích sự tái tổ hợp 72

3.2 Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2 78

3.2.1 Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa 78

3.2.2 Xác định liều lượng gây nhiễm của chủng NAVET-DongNai2/2009 trên tế bào PK15A 82

3.2.3 Khả năng gây bệnh tích tế bào 83

3.2.4 Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A 85

3.2.5 Tính ổn định 86

3.3 Sự tương đồng kháng nguyên giữa các phân lập PCV2 thuộc các genotype khác

nhau 87

3.4 Thí nghiệm 1: Khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVET-DongNai2/2009 89

3.5 Kết quả vô hoạt PCV2 97

3.5.1 Vô hoạt PCV2 với các nồng độ chất vô hoạt khác nhau 97

3.5.2 Kết quả vô hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI 3 mM 100

3.6 Đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 103

3.6.1 Thí nghiệm 2 103

3.6.2 Thí nghiệm 3 107

Chương 4 Kết luận và đề nghị 124

Danh mục các công trình đã công bố của tác giả 126

Tài liệu tham khảo 127

Phụ lục 155

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AAHL Australian Animal Health

Laboratory

Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent

IPMA Immunoperoxidase monolayer

peroxidase trên tế bào một lớp

peroxidase

MOI Multiplicity of infection Tỷ số gây nhiễm

NIPC Natural interferon producing cell Tế bào tiết interferon tự nhiên

PAM Porcine alveolar macrophages Đại thực bào phế nang của heo

PBMC Peripheral blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng tạo chuỗi do

polymerase PCV2 Porcine circovirus type 2

PCVD Porcine circovirus diseases Các bệnh do circovirus trên

heo PDNS Porcine dermatitis and nephropathy

syndrome

Hội chứng viêm da và bệnh lý thận ở heo

PMWS Postweaning multisystemic wasting

PRRS Porcine reproductive and

respiratory syndrome Hội chứng rối loạn sinh sản và

hô hấp trên heo

TCID Tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm tế bào

TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u

VNT Virus neutralization test Xét nghiệm trung hòa vi-rút

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tóm tắt triệu chứng và bệnh tích bệnh PCVD 17

Bảng 1.2 Tổng kết các nghiên cứu về vắc-xin PCV2 25

Bảng 1.3 Các loại vắc-xin PCV2 thương mại ở Việt Nam 27

Bảng 2.1 Các mẫu dương tính ADN-PCV2 thu nhận từ năm 2007 đến 2016 46

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập 50

Bảng 3.1 Khoảng cách di truyền trong cùng genotype và giữa các genotype lưu hành ở các tỉnh thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 68

Bảng 3.2 Các a-xít a-min của protein Cap khác nhau giữa các genotype PCV2 69

Bảng 3.3 Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và a-xít a-min giữa các chủng PCV2 71

Bảng 3.4 Phần trăm tương đồng giữa các mẫu PCV2-Re (2h) với chủng bố mẹ giả định dựa trên ORF2 72

Bảng 3.5 Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A 79

Bảng 3.6 Hiệu giá của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 qua các lần tiếp đời trên tế bào PK15A 86

Bảng 3.7 Hiệu giá kháng thể trung hòa của phản ứng trung hòa chéo giữa huyết thanh heo với các genotype PCV2 phân lập 88

Bảng 3.8 Hệ số tương đồng kháng nguyên R giữa ba chủng PCV2 khảo sát 88

Bảng 3.9 Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 1 89

Bảng 3.10 Tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí nghiệm 1 90

Bảng 3.11 Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh và mô của heo ở thí nghiệm 1 91

Bảng 3.12 Số lượng bạch cầu của heo ở thí nghiệm 1 92

Bảng 3.13 Diễn biến kháng thể ch ống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 1 93

Bảng 3.14 Hiệu giá vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 theo thời gian vô hoạt ở các nồng độ BEI 97

Bảng 3.15 Hiệu giá vi-rút của ba chủng PCV2 phân lập giảm theo thời gian vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM 101

Bảng 3.16 Khối lượng ban đầu và tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí

nghiệm 2 103

Bảng 3.17 Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 2 105

Bảng 3.18 Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 3 108

Bảng 3.19 Tăng trọng bình quân hàng ngày của heo ở thí nghiệm 3 108

Bảng 3.20 Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 3 110

Bảng 3.21 Số lượng bạch cầu ở heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3 115

Bảng 3.22 Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy trực tràng trên heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3 116

Bảng 3.23 Hiệu giá vi-rút ở mô heo thí nghiệm 3, mổ khảo sát lúc 28 dpc 119

DANH M ỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử 6

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen PCV2 7

Hình 2.1 Tóm tắt nội dung nghiên cứu 44

Hình 2.2 Mô tả thiết kế thí nghiệm 1 52

Hình 2.3 Mô tả thiết kế thí nghiệm 2 57

Hình 2.4 Mô tả thiết kế thí nghiệm 3 58

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 dựa trên trình tự nucleotide ORF2 65

Hình 3.2 Phân tích các mẫu PCV2-Re (2h) bằng phần mềm RDP4 v.4.39 dựa trên ORF2 74

Hình 3.3 So sánh nucleotide giữa các mẫu PCV2-Re (2h) và chủng bố mẹ 77

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR 760 bp để phát hiện ADN-PCV2 80

Hình 3.5 Phản ứng IPMA phát hiện PCV2 phân lập trên môi trường tế bào PK15A 80

Hình 3.6 Heo 16 tuần tuổi có biểu hiện viêm da 81

Hình 3.7 Thai khô ở các giai đoạn khác nhau 81

Hình 3.8 Hình dạng tế bào tế bào PK15A nhiễm PCV2 84

Hình 3.9a Nang bạch huyết bình thường ở heo đối chứng 96

Hình 3.9b Suy giảm tế bào lym-phô và xuất hiện tế bào đa nhân khổng lồ ở nang bạch huyết 96

Hình 3.10a Phổi heo đối chứng 96

Hình 3.10b Viêm phổi kẽ 96

Hình 3.11 Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào 100

Hình 3.12 Nhuộm IPX xác định sự hiện diện của PCV2 trong tế bào PK15A 100

Hình 3.13 Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào 102

Hình 3.14 Các bệnh tích đại thể trên heo sau công cường độc 28 ngày 120

Hình 3.15 Các bệnh tích vi thể trên heo sau công cường độc 28 ngày 121

Biểu đồ 3.1 Phân bố theo thời gian của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt

NAVET-DongNai2/2009 83

Biểu đồ 3.5 Đường cong sinh trưởng của các chủng DongNai2/2009,

NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A 86

Biểu đồ 3.6 Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 1 94 Biểu đồ 3.7 Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút theo thời gian vô hoạt ở các nồng

độ BEI 98

Biểu đồ 3.8 Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút của các chủng PCV2 theo thời gian

vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM 102

Biểu đồ 3.9 Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 2 106

Biểu đồ 3.10 Diễn biến đáp ứng kháng thể chống PCV2 trên heo thí nghiệm 3 112 Biểu đồ 3.11 Tỉ lệ phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu

ngoáy trực tràng, hiệu giá kháng thể trung hòa chống PCV2 ở heo sau công cường độc 117

M Ở ĐẦU

Porcine circovirus type 2 (PCV2) liên quan đến một số bệnh trên heo, gọi chung

là các bệnh do circovirus trên heo (procine circovirus diseases – PCVD) (Segalés, 2012) Trong đó, đáng lưu ý nhất là hội chứng còi trên heo sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết và loại thải, tăng tiêu tốn thức ăn và giảm tăng trọng, vì thế gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi heo Ngoài ra, PCV2 còn gây ảnh hưởng bất lợi lên đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắc-xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo

(porcine reproductive respiratory syndrome) (Opriessnig và ctv, 2006a)

Trước khi có vắc-xin PCV2 thì việc phòng PCVD chủ yếu dựa vào các biện pháp quản lý, an toàn sinh học và kiểm soát yếu tố đồng nhiễm Đến nay, có khá nhiều nghiên cứu về vắc-xin PCV2, bao gồm cả loại vắc-xin dạng cổ điển và loại dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại; nhiều loại đã được thương mại hóa Các nghiên cứu thí nghiệm và thực địa đã chứng minh hiệu quả của việc phòng PMWS

bằng vắc-xin như cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỷ lệ chết, tỷ lệ loại thải, giảm lượng vi-rút bài thải cũng như giảm bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết (Kristensen và ctv, 2011; Fraile và ctv, 2012a; Seo và ctv, 2014b)

Hiện nay, vắc-xin PCV2 được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam Tuy nhiên, các loại vắc-xin PCV2 thương mại lưu hành tại

Việt Nam hiện hành đều là ngoại nhập, và đa số dựa trên genotype PCV2a Trong khi

đó, PCV2 lưu hành ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái tổ hợp (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2012, 2013; Phạm Hồng Quân và ctv, 2017) Ngoài ra, một số kết quả nghiên cứu cho thấy, genotype của PCV2 có thể ảnh hưởng đến hiệu quả phòng PMWS bằng vắc-xin (Takahagi và ctv, 2010; Opriessnig và ctv, 2013a) Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng PCV2 thuộc genotype lưu hành phổ biến ở Việt Nam là cần thiết, nhằm giúp chủ

động nguồn cung vắc-xin, góp phần kiểm soát hiệu quả bệnh PMWS, cũng như giảm giá thành chăn nuôi Để góp phần giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM

VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA” được tiến hành

M ục tiêu nghiên cứu

 Xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành tại một số tỉnh thành ở Việt Nam

 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa dựa trên chủng phân lập của đề tài

Nh ững đóng góp mới về khoa học và thực tiễn từ các kết quả nghiên cứu này

Nghiên cứu được sự lưu hành, đa dạng di truyền và tương đồng gen của các

chủng PCV2 phân lập ở heo tại Việt Nam

Phân lập được một số chủng PCV2 làm nguồn gen trong việc nghiên cứu chế

tạo vắc-xin và các ứng dụng công nghệ sinh học khác

Chế tạo thành công vắc-xin vô hoạt nhũ dầu bằng chủng PCV2b phân lập ngoài

thực địa phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa

Chương 1

T ỔNG QUAN 1.1 Gi ới thiệu về PCV2

1.1.1 Phân lo ại PCV2

Porcine circovirus (PCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae Dựa vào

kích thước virion và cấu trúc bộ gen của vi-rút, Ủy ban quốc tế về phân loại vi-rút (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) năm 2017 chia họ

Circoviridae thành 2 giống là Circovirus và Cyclovirus (Breitbart và ctv, 2017)

Porcine circovirus gồm 3 type là PCV1, PCV2 và PCV3 (Rosario và ctv, 2017; Lefkowitz và ctv, 2018)

Dựa vào kết quả phân tích bộ gen, các nhà nghiên cứu còn phân chia PCV2 thành các genotype Grau-Roma và ctv (2008) đã đề ra một định nghĩa cho các genotype PCV2, dựa trên các so sánh trình tự theo cặp (PAirwise Sequence Comparisions - PASC) để xác định mức độ biến đổi di truyền (p), giá trị này được

tính toán bằng cách chia số nucleotide khác nhau cho tổng số nucleotide so sánh giữa các bộ gen (Kumar và ctv, 2001) Kết quả là xây dựng một khoảng cách p và biểu đồ

tần số cho phép xác định các giá trị ngưỡng để phân biệt các genotype với nhau (Rogers và Harpending, 1992; Biagini và ctv, 1999) Có 2 cách để phân chia các genotype của PCV2: (1) dựa trên sự phân tích toàn bộ bộ gen PCV2 với giá trị ngưỡng

p = 0,02 (Grau-Roma và ctv 2008); (2) dựa trên mức độ biến đổi di truyền của ORF2 thì giá trị ngưỡng p = 0,035 (Segalés và ctv, 2008) Gần đây, Franzo và Segalés (2018)

đề xuất cách phân loại genotype PCV2 dựa trên 3 tiêu chí, đó là khoảng cách di truyền

(p-diastance) tối đa giữa các genotype (intra-genotype) là 13% (dựa trên trình tự ORF2), giá trị bootstrap ở các nút (node) > 70% và có ít nhất 15 trình tự chuỗi có sẵn

Các phân lập PCV2 được chia thành 8 genotype chính là PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d (trước đây còn gọi là mutant PCV2b, viết tắt là mPCV2b), PCV2e (Xiao và ctv, 2015; Davies và ctv, 2016), PCV2f (Bao và ctv, 2017), PCV2g và

PCV2h (Franzo và Segalés, 2018) Dựa vào kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại, Xiao và ctv (2015) phân PCV2d thành 2 subgenotype đó là PCV2d-1 và PCV2d-

2 Ngoài ra, còn có sự hiện diện của nhóm PCV2 tái tổ hợp (recombinant cluster) còn được gọi là các chủng trung gian (intermediate strains) trong thực địa (Cai và ctv, 2012; Xiao và ctv, 2015; Franzo và ctv, 2016) Nhóm tác giả Franzo và ctv (2016) đã phân tích 898 trình tự chuỗi nucleotide ở 32 quốc gia từ năm 1980 đến 2014 (dữ liệu thu thập từ GenBank) Kết quả cho thấy có đến 33% (304/898) trình tự chuỗi nucleotide được nhận dạng là tái tổ hợp Hầu hết các quốc gia ở khắp các châu lục đều có sự lưu hành của nhóm tái tổ hợp, trong đó có Việt Nam Đáng lưu ý, theo cách phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) một số chủng PCV2 trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp (recombinant cluster) nay được xếp vào genotype PCV2g và PCV2f Kết quả phân tích của Franzo và Segalés (2018) cho thấy có đến 45/75 chủng PCV2 của Việt Nam đăng ký trên GenBank (đến thời điểm ngày 5 tháng 7 năm 2018) được xếp vào PCV2h mà trước đây các chủng này được xếp vào nhóm tái tổ hợp Vì thế, trong

phần trình bày này các chủng trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp nhưng nay theo cách phân loại mới được xếp vào PCV2h sẽ được viết tắt là PCV2-Re (2h)

1 1.2 Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2

PCV có kích thước rất nhỏ, đường kính khoảng 17 ± 1,3 nm, không có vỏ bọc (Tischer và ctv, 1982) Virion hình cầu, đối xứng 20 mặt, với 60 phân tử protein capsid (Crowther và ctv, 2003), chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước khoảng 1,76 - 1,77 kb (Meehan và ctv, 1997; 1998)

PCV rất ổn định ở điều kiện khác nhau của môi trường, đề kháng rất cao với nhiệt độ và pH: ổn định ở pH = 3, nhiệt độ 560C và 700C trong 15 phút Các thí nghiệm in vitro cho thấy, PCV2 đề kháng với nhiệt độ khô, khả năng gây nhiễm của

PCV2 giảm tương ứng 0,75log và 1,25log sau khi xử lý nhiệt độ khô ở 800C trong vòng 72 giờ và 1200C trong vòng 30 phút (Welch và ctv, 2006) PCV2 bị bất hoạt ở nhiệt độ ướt 800C trong 15 phút (O'Dea và ctv, 2008) Ở pH = 2, trong vòng 30 phút, hiệu giá PCV2 giảm từ 5,5 log xuống còn 2,7 log (Kim và ctv, 2009c) Tính gây nhiễm của PCV2 giảm đáng kể ở pH = 11 và hầu như biến mất ở pH = 12 (Lyoo, 2009) Hiệu giá vi-rút cũng giảm bởi một số chất sát trùng gốc kiềm (ví dụ như

NaOH), các tác nhân oxy hóa (ví dụ như sodium hypochlorite) hoặc amonium bậc 4 (Royer và ctv, 2001; Martin và ctv, 2008) PCV2 đề kháng với chloroform, các chế

phẩm chứa cồn, iodine, formaldehyde và phức hợp chlohexidine

Hình 1.1 Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử (A) Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử (Allan và ctv, 2012) (B) Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện

tử lạnh (Cryo-electron microscopy) (Nguồn: King và ctv, 2012)

1 1.3 Đặc điểm nuôi cấy của PCV2

PCV2 là vi-rút phát triển chậm, một chu kỳ nhân lên của PCV2 trên tế bào PK15 mất khoảng 30 - 36 giờ (Cheung và Bolin, 2002; Meerts và ctv, 2005a) PCV2 nhân lên trong tế bào dòng thận heo PK15 và cũng nhân lên trong một số loại tế bào

tế bào sơ cấp như tế bào đơn nhân tim thai (fetal cardinomonocyte - FCM), đại thực bào phế nang heo (porcine alveolar marcophage - PAM), tế bào đơn nhân máu ngoại

vi (peripheral blood mononuclear cell - PBMC), tế bào tua (dendritic cell - DC) nhưng hiệu giá vi-rút đạt được rất thấp (Gilpin và ctv, 2003; Vincent và ctv, 2003; Meerts

và ctv, 2005a; Chang và ctv, 2006; Yu và ctv, 2007b) Kết quả nghiên cứu của Allan

và ctv (1994) về một số đặc tính sinh học của PCV cho thấy, PCV cũng có thể nhân lên trên các tế bào có nguồn gốc từ heo và tế bào Vero, các tế bào sơ cấp từ bò và cừu cũng nhạy cảm với PCV nhưng không thể tiếp đời PCV trên các tế bào này

ORF5, ORF7 và ORF10 nằm trên chuỗi dương cùng chiều kim đồng hồ, ngược lại các ORF2, 3, 4, 6, 8, 9 và 11 nằm trên chuỗi bổ sung và ngược chiều kim đồng hồ (Hamel

và ctv, 1998) Ở vùng trung gian lớn giữa ORF1 và ORF2 chứa gốc sao chép (Origin

of DNA replication - Ori), có một cấu trúc cuống - vòng (stem - loop), giúp PCV2 nhân lên theo cơ chế vòng tròn lăn Đến nay, chỉ xác định được 4 khung đọc mở mã hóa protein đó là ORF1, 2, 3 và 4 (Hình 1.2), riêng protein được mã hóa từ ORF5 cũng đã được nghiên cứu, tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu thêm để xác định vai trò cụ

thể của protein này (Lv và ctv, 2015)

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen PCV2 ORF1 (màu đỏ) mã hóa protein Rep và Rep’ ORF2 (màu xanh dương) mã hóa protein Cap ORF3 (màu xanh lá cây) mã hóa protein ORF3 ORF4 (màu vàng) mã hóa protein ORF4 Gốc sao chép (Ori) nằm ở vùng trung gian giữa các điểm bắt đầu của 2 khung đọc ORF1 và ORF2 H1, H2, H3

và H4 là các hexanucleotide (Faurez và ctv, 2009)

ORF1 còn được gọi là gen Rep, dài 945 nucleotide, nằm trên chuỗi dương và

theo chiều kim đồng hồ, là vùng rất bảo tồn của giống Circovirus, mã hóa protein không

cấu trúc là enzyme Rep (helicase) chứa 314 aa và Rep’ (nickase) chứa 178 aa Đây là hai protein rất cần thiết cho sự nhân lên của ADN-PCV trong tế bào ký chủ (Mankerts

và Hillenbrand, 2001; Cheung, 2003) Protein Rep đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với PCV2 Do bởi Rep là protein cần thiết cho

sự nhân lên của PCV2, các đáp ứng miễn dịch chống lại protein này có lẽ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chế ngự sự nhân lên của PCV2 và ngăn chặn tiến trình chuyển từ trạng thái nhiễm PCV2 sang PMWS trên heo (Fort và ctv, 2010)

ORF2 còn gọi là gen Cap, nằm trên chuỗi bổ sung và theo chiều ngược chiều kim đồng hồ, dài từ 702 đến 708 nucleotide, mã hóa protein cấu trúc duy nhất Cap (capsid) chứa 233-235 aa (Mankertz và ctv, 2000; Nawagitgul và ctv, 2000; Guo và ctv, 2010), là protein sinh miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào đối

với PCV2 (Mahé và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003; Fort và ctv, 2010), có chức năng rất quan trọng trong việc giúp vi-rút bám và xâm nhập vào tế bào ký chủ (Khayat

và ctv, 2011) Sự biến đổi di truyền xảy ra ở protein Cap có thể có ảnh hưởng rất lớn

đến độc lực của PCV2 in vivo cũng như khả năng nhân lên của vi-rút in vitro (Fenaux

và ctv, 2004b) Vì thế, hầu hết các nghiên cứu về PCV2 như chẩn đoán, phân tích di truyền, miễn dịch và vắc-xin đều tập trung vào ORF2 và protein Cap

ORF3 ở vị trí hoàn toàn trùng lắp với ORF1, nó nằm trên chuỗi bổ sung và ngược chiều kim đồng hồ, dài 315 nucleotide mã hóa protein chứa 104 aa (Hamel và ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998; Morozov và ctv, 1998) Protein ORF3 của PCV2 có

liên quan đến sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào nuôi cấy in vitro và tác động lên sự sinh bệnh của vi-rút in vivo (Liu và ctv, 2006)

ORF4 ở vị trí hoàn toàn trùng lắp và cùng chiều với ORF3, dài 180 nucleotide,

mã hóa chuỗi protein chứa 59 aa, protein này không cần thiết cho sự nhân lên của PCV2, nhưng đóng vai trò trong việc ngăn chặn hoạt động caspase và điều hòa lym-phô T CD4+ and CD8+ trong suốt quá trình nhiễm PCV2 (He và ctv, 2013)

1.2 Các b ệnh do circovirus trên heo

1.2.1 Tên g ọi

Hội chứng còi trên heo sau cai sữa (post weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) được mô tả đầu tiên vào năm 1991 ở Canada như là một bệnh lẻ tẻ

Biểu hiện đặc trưng của hội chứng này là giảm tăng trọng một cách nhanh chóng, suy hô hấp và da tái nhợt ở heo sau cai sữa (Clark, 1996; Harding, 1996) Sau đó, có nhiều bằng

chứng chứng minh, ngoài PMWS, PCV2 còn liên quan đến một số bệnh khác trên heo như bệnh rối loạn sinh sản (West và ctv, 1999), hội chứng viêm da và bệnh lý thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome - PDNS) (Rosell và ctv, 2000), bệnh hô

hấp phức hợp trên heo (porcine respiratory disease complex – PRDC) (Thacker và Thacker, 2000), bệnh viêm phổi hoại tử và tăng sinh (proliferative and necrotising pneumonia – PNP) (Allan và Ellis, 2000), bệnh viêm ruột (Jensen và ctv, 2006)

Năm 2002, Allan và ctv (2000) đã đề xuất thuật ngữ “các bệnh do circovirus trên

heo” (porcine circovirus diseases - PCVD), tên gọi này được sử dụng phổ biến ở châu

Âu Tương tự, năm 2006, Hiệp hội các nhà Thú y Mỹ (American Association of Swine Veterinarians - AASV) đã đưa ra thuật ngữ “các bệnh liên quan circovirus trên heo”

(porcine circovirus associated diseases - PCVAD) (http://www.aasv.org) để chỉ tất cả các bệnh liên quan đến PCV2 xảy ra trên heo Harding (2007) cho rằng, cần có một tên

gọi thống nhất cho hội chứng này vì đây là một bệnh toàn cầu có cùng tác nhân gây bệnh, cùng sinh bệnh học và cùng biểu hiện bệnh Để thống nhất trong cách gọi tên, Segalés (2012) sử dụng thuật ngữ “các bệnh do circovirus trên heo” (PCVD) để chỉ tất cả các

bệnh đã đề cặp ở trên, bao gồm cả trường hợp nhiễm PCV2 tiềm ẩn

Cho đến nay, các nghiên cứu chứng minh mối liên quan giữa nhiễm PCV2 và

sự phát triển thành bệnh chỉ thành công đối với PMWS (Allan và ctv, 1999; Bolin và ctv, 2001) và đối với rối loạn sinh sản (Sanchez và ctv, 2001; Mateusen và ctv, 2007) Các mối liên hệ giữa PCV2 và các tình trạng bệnh khác chỉ dựa trên nghiên cứu hồi

cứu và hoặc dựa vào các ca lâm sàng (Segalés và ctv, 2005a; Segalés, 2012)

1.2.2.2 Loài c ảm thụ, lứa tuổi, tỷ lệ mắc bệnh

- Loài c ảm thụ: heo là ký chủ tự nhiên của cả PCV1 và PCV2 (Segalés và

Domingo, 2002) Heo rừng có thể mắc PMWS (Ellis và ctv, 2003; Schulze và ctv, 2004; Lipej và ctv, 2007) nhưng tầm quan trọng về mặt dịch tễ của việc nhiễm PCV2 trên các loài này thì không rõ (Vicente và ctv, 2004)

Mặc dù các nghiên cứu đầu tiên cho thấy PCV có thể nhiễm trên người, bò và chuột (Tischer và ctv, 1995; Nayar và ctv, 1999), các khảo sát huyết thanh học trên bò,

dê, ngựa, chó, mèo, chuột và người cho thấy không có bằng chứng về việc nhiễm PCV trên các loài này (Allan và ctv, 2000; Ellis và ctv, 2001) Gây nhiễm thí nghiệm PCV2 trên cừu và thỏ cho thấy không có sự chuyển đổi huyết thanh cũng như phát triển bệnh tích (Allan và ctv, 2000; Quintana và ctv, 2002)

- L ứa tuổi mắc bệnh: tất cả các lứa tuổi heo đều nhiễm PCV2 PMWS thường

ảnh hưởng trên heo từ 5 đến 18 tuần tuổi, phần lớn các ca PMWS xảy ra trên heo từ

6 đến 10 tuần tuổi, viêm ruột do PCV2 thường thấy trên heo từ 8 đến 16 tuần tuổi, PDNS ảnh hưởng trên heo các lứa tuổi gồm heo sau cai sữa, heo choai và heo lớn (Drolet và ctv, 1999)

- T ỉ lệ nhiễm: Trước khi vắc-xin PCV2 được thương mại hóa, các khảo sát

huyết thanh học cho thấy sự nhiễm PCV2 lan rộng khắp toàn cầu, với tỉ lệ dương tính huyết thanh lên đến 100% tùy thuộc vào lứa tuổi, quy mô đàn Tỉ lệ bệnh trên đàn

mắc PMWS thường dao động từ 4-30% (đôi khi lên đến 50 - 60%) và tỉ lệ chết từ 4 - 20% (Segalés và Domingo, 2002) Tỉ lệ nhiễm PDNS rất thấp chỉ khoảng dưới 1% (Segalés và ctv, 1998)

Theo thống kê của Madson (2018), sau khi áp dụng việc tiêm vắc-xin PCV2 rộng rãi, gần như 100% ở Mỹ, tỉ lệ các ca mắc PCVD giảm từ 14% vào năm 2006

xuống còn khoảng 2 - 6% vào các năm từ 2008 - 2017

1.2.2.3 Ch ất chứa vi-rút

Trên heo nhiễm PCV2, các chất tiết (mũi, mắt, phế quản), phân, nước bọt, nước tiểu, sữa, tinh dịch và hạch hạnh nhân đều có chứa vi-rút (Krakowka và ctv, 2000; Shibata và ctv, 2003; 2006; Segalés và ctv, 2005b; Ha và ctv, 2009; Park và ctv, 2009) Kết quả gây nhiễm PCV2 thí nghiệm trên heo CD/CD (cesarean-derived

colostrum-deprived – heo con được sinh mổ và không bú sữa đầu) của Okuda và ctv (2003) cho thấy, PCV2 hiện diện trong huyết thanh, dịch ngoáy mũi, và trực tràng, cũng như ở hầu hết các mô lym-phô như nốt bạch huyết, lách, hạch hạnh nhân và các

tổ chức khác như tim, phổi, gan và ruột non của heo được gây nhiễm Có sự hiện diện

của PCV2 trong thai sẩy hoặc heo mới sinh trên nái sẩy thai và sinh non do bị nhiễm PCV2 trong thời gian mang thai (Park và ctv, 2005) Ngoài ra, PCV2 cũng hiện diện

với lượng khá lớn trong bệnh tích cơ tim viêm của thai sẩy hoặc thai gỗ trong trường

hợp nái có vấn đề về sinh sản (Brunborg và ctv, 2007)

1 2.2.4 Đường truyền lây

PCV2 truyền ngang chủ yếu qua đường mũi miệng Đây chính là cơ sở để gây nhiễm PCV2 thí nghiệm trên heo bằng đường mũi (intranasal) (Allan và ctv, 1999; Balasch và ctv, 1999; Krakowka và ctv, 2000; Rovira và ctv, 2002) Khả năng truyền ngang của PCV2 được chứng minh bằng cách nhốt lẫn giữa heo không nhiễm và heo nhiễm (Albina và ctv, 2001; Bolin và ctv, 2001) PCV2 truyền lây qua tiếp xúc trực

tiếp giữa các heo được nuôi chung với nhau mạnh hơn là giữa các heo được nuôi ở các ô chuồng khác nhau (Andraud và ctv, 2008) PCV2 còn có thể lây nhiễm cho heo qua đường miệng khi cho heo ăn các mô chưa được nấu chín từ các heo bị vi-rút huyết (Opriessnig và ctv, 2009b) Ngoài ra, PCV2 còn lây gián tiếp giữa các heo được nuôi

ở các ô chuồng gần kề nhau (Kristensen và ctv, 2009)

PCV2 có thể truyền dọc qua nhau thai, gây nhiễm cho bào thai (Ha và ctv, 2009; Park và ctv, 2009) Khi sử dụng tinh dịch có nhiễm PCV2 gieo tinh cho heo nái tơ, có gây ra biểu hiện rối loạn sinh sản và thai bị nhiễm PCV2 (Madson và ctv, 2009) Tuy nhiên, vẫn chưa xác định được lượng PCV2 nhiễm tự nhiên trong tinh dịch bao nhiêu là đủ để gây nhiễm cho nái và thai

1 2.3 Cơ chế sinh bệnh

Các nghiên cứu cho thấy rằng, tế bào lym-phô và đại thực bào cũng như các tế bào biểu mô và tế bào nội mạc là các tế bào đích để PCV2 nhân lên (Hamberg và ctv, 2007; Pérez-Martín và ctv, 2007; Yu và ctv, 2007a; Rodríguez-Cariño và ctv, 2010) Nghiên cứu siêu cấu trúc trên môi trường tế bào và các nốt bạch huyết lấy từ heo mắc PMWS cho thấy, ty thể có lẽ đóng vai trò quan trọng trong việc nhân lên của PCV2

(Rodríguez-Carĩno và ctv, 2010; 2011) Trong các thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo, hiện tượng vi-rút huyết được phát hiện đầu tiên khoảng 7 ngày sau gây nhiễm PCV2,

hiệu giá vi-rút tăng và đạt mức cao nhất vào ngày 14 đến ngày 21 sau gây nhiễm (Rovira

và ctv, 2002; Resendes và ctv, 2004; Opriessnig và ctv, 2008b) PCV2 tập trung cao nhất

ở các mô lym-phô Bên cạnh đó, PCV2 còn hiện diện ở các tế bào biểu mô thận và đường

hô hấp, các tế bào nội mạc, tế bào lym-phô, tế bào ruột, gan, tế bào cơ trơn, tụy (McNeilly

và ctv, 1999; Rosell và ctv, 1999; Shibahara và ctv, 2000; Sanchez và ctv, 2004)

Các bằng chứng thực địa cho thấy PCVD là bệnh đa yếu tố, không phải tất cả heo nhiễm PCV2 đều có biểu hiện lâm sàng PMWS Có 4 yếu tố chính ảnh hưởng đến tiến trình biểu hiện PMWS gồm: vi-rút, ký chủ, các yếu tố đồng nhiễm và tình trạng

miễn dịch (1) Vi-rút: các nghiên cứu cho thấy PCV2a, PCV2b và PCVd đều có khả năng gây PMWS (Guo và ctv, 2012, Opriessnig và ctv, 2014c) Sự khác biệt về độc lực giữa các genotype PCV2 vẫn là vấn đề đang tranh cãi và cần được nghiên cứu thêm (2) Ký chủ: các ghi nhận thực tế và thí nghiệm cho rằng các dòng heo (genetic lines)

có thể nhạy cảm khác nhau đối với PMWS (3) Các yếu tố đồng nhiễm: các nghiên cứu

đã chứng minh rằng, PCV2 chính là tác nhân chủ yếu và cần thiết trong sinh bệnh học

của PMWS (Ellis và ctv, 1999; Bolin và ctv, 2001; Ladekjær-Mikkelsen và ctv, 2002) Tuy nhiên, các thí nghiệm tái gây PMWS hiệu quả và chắc chắn hơn khi gây nhiễm kết

hợp giữa PCV2 với các tác nhân gây bệnh khác trên heo Thực tế cho thấy, trong hầu

hết các ca bệnh PMWS đều có sự đồng nhiễm với các tác nhân vi-rút, vi khuẩn gây bệnh khác trên heo, chính sự đồng nhiễm này làm cho tình trạng bệnh cũng như dấu

hiệu lâm sàng bệnh trầm trọng hơn Các tác nhân đồng nhiễm làm gia tăng nguy cơ phát PMWS phổ biến nhất là PRRSV (Allan và ctv, 2000; Pogranichniy và ctv, 2002), porcine parvovivus (Allan và ctv, 1999; Kennedy và ctv, 2000; Opriessnig và ctv,

2004b), Mycoplasma hyopneumoniae (Opriessnig và ctv, 2004a) (4) Tình trạng miễn

dịch: nghiên cứu các yếu tố nguy cơ làm gia tăng PMWS ở mức độ cá thể cho thấy, nguy cơ mắc PMWS cao ở những heo có hàm lượng kháng thể chống PCV2 lúc 7 tuần

tuổi thấp (sau đó không có sự chuyển đổi huyết thanh) và heo con sinh ra từ nái âm tính với kháng thể chống PCV2 (Rose và ctv, 2005)

Có hiện tượng ức chế miễn dịch (immunosuppression) ở heo mắc PMWS Bằng chứng nổi bật về sự ức chế miễn dịch ở heo mắc PMWS đó là sự suy kiệt (depletion) bạch cầu và thay thế mô bào (Opriessnig và ctv, 2007; Segalés, 2012) Các nghiên cứu cho thấy có sự suy giảm số lượng các tế bào tua, lym-phô B, các tế bào NK, lym-phô T (CD4+, CD8+) cùng với sự gia tăng số lượng các tế bào đơn nhân

và tế bào hạt trong máu heo nhiễm PCV2 (Ramamoorthy và Meng, 2009; Darwich

và ctv, 2002; Darwich và Mateu, 2012) Ngoài ra, heo mắc PMWS được cho là do thiếu hụt miễn dịch mắc phải (acquired immunodeficiency) (Darwich và Matue, 2012) Nguyên nhân có thể là do khả năng điều khiển miễn dịch của PCV2 (Vincent

và ctv, 2005; 2007; Kekarainen và ctv, 2010; Balmelli và ctv, 2011)

1 2.4 Đáp ứng miễn dịch chống PCV2

1 2.4.1 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Các t ế bào: PCV2 nhiễm và tồn tại dai dẳng trong đại thực bào và tế bào tua, và

có lẽ PCV2 sử dụng các tế bào này như công cụ để lan truyền vi-rút khắp các mô phô, và tại nơi đây chúng sẽ điều khiển chức năng của các loại tế bào miễn dịch Tế bào giết tự nhiên (natural killer cell – NK) và tế bào T gây độc là 2 loại tế bào chủ yếu để tiêu

lym-diệt các tế bào bị nhiễm PCV2 Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Nielsen và ctv (2003) cho thấy có sự suy giảm tế bào NK ở heo gây nhiễm PCV2 có biểu hiện PMWS

Các cytokine: PCV2 ngăn trở chức năng của các tế bào tiết interferon tự nhiên (natural interferon procucing cell - NIPC) hay còn gọi là các tế bào tua dòng bào tương (plasmacytoid dendritic dells - pDC) tiết interferon (IFN) type I Đây là loại cytokine quan trọng nhất trong kiểm soát nhiễm vi-rút Theo báo cáo của Vincent và ctv (2007), PCV2 ức chế các tế bào pDC sản sinh IFN-α in vitro trong đáp ứng với

các chất kích thích thụ thể giống Toll TLR7 hoặc TLR9 (Toll-like receptor) Trong

đó, dạng ADN sợi đôi (dạng sao chép - replicative form) của PCV2 có khả năng ức

chế các tế bào pDC tiết IFN-α (Balmelli và ctv, 2011) Theo Baumann và ctv (2013), PCV2 vừa có khả năng ức chế, vừa có khả năng kích thích các tế bào pDC tiết IFN type I ADN sợi đơn của vi-rút kích thích các tế bào pDC khi có sự hiện diện của IFN-γ Ngược lại, dạng ADN sợi đôi của vi-rút có khả năng ức chế đáp ứng các tế bào pDC, ngay cả khi có sự hiện diện của các cytokine có tác dụng kích thích đáp

ứng các tế bào pDC Bên cạnh đó, PCV2 thúc đẩy tiết IL-10 Các nghiên cứu về cytokine trong các mô và PBMC của heo mắc PMWS cho thấy có sự gia tăng hàm lượng IL-10 với sự gia tăng quá mức ARN thông tin mã hóa IL-10 ở tuyến ức của heo mắc PMWS tự nhiên (Darwich và ctv, 2003b) Ngoài ra, khi kích thích PBMC

lấy từ heo mắc PMWS bằng PCV2 có thể làm gia tăng hàm lượng IL-10 (Dawich và ctv, 2003a) Doster và ctv (2010) ghi nhận sự gia tăng biểu hiện IL-10 ở hạch dưới hàm, lách và hạch hạnh nhân ở các heo nhiễm PCV2 Sự biểu hiện IL-10 này xảy ra

chủ yếu ở vùng tập trung nhiều tế bào lym-phô T và hiếm khi ở vùng lym-phô B và

đại thực bào Các nghiên cứu ex vivo cũng cho thấy có sự gia tăng hàm lượng IL-10

trong huyết thanh của heo có biểu hiện PMWS (Hasslung và ctv, 2005; Stevenson và ctv, 2006) Ngược lại, kết quả nghiên cứu của Darwich và ctv (2008) cho thấy, đối

với heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn thì chỉ có đáp ứng IL-10 thoáng qua (transient) xảy ra trong pha vi-rút huyết Từ kết quả của các nghiên cứu trên cho thấy vai trò quan trọng

của IL-10 trong sinh bệnh học PCVD

1 2.4.2 Đáp ứng miễn dịch thu được

PCV2 kích thích sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Protein capsid của PCV2 kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trung hòa và miễn dịch bảo hộ (Pogranichniy và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003) Theo Fort và ctv (2010), cả

protein Cap và Rep đều tham gia trong đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào

- Đáp ứng miễn dịch thu được chủ động

Đáp ứng miễn dịch dịch thể: Trong các thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo,

dù có biểu hiện lâm sàng bệnh hay không, cũng có sự chuyển đổi huyết thanh xảy ra vào lúc 10 đến 28 ngày sau khi gây nhiễm (Balasch và ctv, 1999; Pogranichnyy và ctv, 2000) Tuy nhiên, một vài nghiên cứu cho thấy, những heo bị gây nhiễm với PCV2 có biểu hiện PMWS thì sự chuyển đổi huyết thanh muộn hơn so với heo không

biểu hiện PMWS (Bolin và ctv, 2001; Rovira và ctv, 2002; Okuda và ctv, 2003) Hiệu giá kháng thể tổng cộng (total antibody – TA) trên heo có biểu hiện PMWS thấp hơn

so với heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn ở thời điểm 21 ngày sau gây nhiễm (Meerts và ctv, 2006) Trên heo thí nghiệm nhiễm vi-rút tiềm ẩn, kháng thể trung hòa chống PCV2 (neutralising antibody - NA) xuất hiện lúc 15 ngày sau gây nhiễm trở đi (Meerts và

ctv, 2006; Fort và ctv, 2007) Kháng thể trung hòa chống PCV2 không có, hoặc có với lượng rất thấp (chỉ ở thời điểm 7 đến 14 ngày sau gây nhiễm) trên các heo gây nhiễm thí nghiệm có biểu hiện PMWS (Meerts và ctv, 2006) Fort và ctv (2007) cho

rằng, đáp ứng miễn dịch dịch thể yếu trên heo mắc PMWS, đặc biệt là những heo này thiếu khả năng đáp ứng kháng thể trung hòa chống PCV2 Trong điều kiện thực địa,

sự chuyển đổi kháng thể tổng cộng chống PCV2 xảy ra ở cả heo mắc PMWS và heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn (Rodriguez-Arrioja và ctv, 2002; Grau-Roma và ctv, 2009) Tuy nhiên, trên heo mắc PMWS có đáp ứng kháng thể yếu hơn so với các heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn (Meerts và ctv, 2006; Fort và ctv, 2007; Grau-Roma và ctv, 2009)

Đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào: Sự phát triển của các tế bào tiết interferon gama (interferon  secreting cell, viết tắt là IFN--SC) là điểm mấu chốt trong việc phát triển đáp ứng miễn dịch thu được qua trung gian tế bào chống PCV2 (Fort và ctv, 2009a; Steiner và ctv, 2009) IFN--SC đặc hiệu PCV2 được tìm thấy trên nhóm heo nhiễm kết hợp PCV2/PPV vào thời điểm 7 ngày sau gây nhiễm, trong khi đó mãi đến 21 ngày sau gây nhiễm mới phát hiện được IFN--SC đặc hiệu PCV2 ở nhóm heo được gây nhiễm với PCV2 (Steiner và ctv, 2009) Kết quả nghiên cứu của Fort

và ctv (2009a) cho thấy, IFN--SC đặc hiệu PCV2 được phát hiện vào giữa ngày 14

và ngày 21 sau gây nhiễm trên cả nhóm heo CD/CD gây nhiễm với PCV2 và nhóm được gây nhiễm kết hợp PCV2/LPS (lipopolysaccharides) Fort và ctv (2010) cho

rằng, cả protein Cap và Rep của PCV2 đều tham gia trong đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào

- Mi ễn dịch thu được thụ động

Kháng thể thụ động: Một số nghiên cứu đã xác định được vai trò quan trọng

của kháng thể mẹ truyền trong việc bảo vệ heo con chống lại PCV2 cũng như PMWS (Calsamiglia và ctv, 2007; McKeown và ctv, 2005; Ostanello và ctv, 2005) Sự bảo

vệ này có lẽ liên quan đến hoạt tính trung hòa của kháng thể mẹ truyền (Meerts và ctv, 2006; Fort và ctv, 2007; Fort và ctv, 2008) Thực tế cho thấy, PMWS thường không xảy ra trên heo nhỏ hơn 4 tuần tuổi, đồng thời cả kháng thể tổng cộng và kháng thể trung hòa chống PCV2 đều được phát hiện trên heo ở lứa tuổi này (Rodriguez-Arrioja và ctv, 2002; Larochelle và ctv, 2003; Sibila và ctv, 2004; Ostanello và ctv,

2005; Meerts và ctv, 2006; Calsamiglia và ctv, 2007) Rodriguez-Arrioja và ctv (2002) đã chứng minh rằng, kháng thể thụ động chống PCV2 giảm trong suốt giai đoạn bú sữa và giai đoạn đầu sau cai sữa, giảm đến mức âm tính hoặc gần như âm tính lúc 7 tuần tuổi và sau đó có sự chuyển đổi kháng thể chủ động trong quần thể bắt đầu vào khoảng 12 tuần tuổi Một điều đáng lưu ý, hiệu giá kháng thể thụ động chống PCV2 trên heo con sinh ra từ nái được tiêm vắc-xin PCV2 cao hơn và tốc độ giảm

chậm hơn so với heo con sinh ra từ nái không được tiêm vắc-xin (Kurmann và ctv, 2011; Fraile và ctv, 2015) Ngoài ra, hiệu giá kháng thể thụ động trên heo mắc PMWS

thấp hơn so với heo khỏe mạnh (Grau-Roma và ctv; 2009) Theo Fort và ctv (2009b), hiệu giá kháng thể thụ động IPMA > 10,6log2 (hoặc NA > 8log 2) có thể giúp bảo vệ heo chống lại tình trạng nhiễm PCV2 huyết khi công cường độc PCV2 bằng đường mũi miệng với liều gây nhiễm 105TCID50/ heo, ngược lại nếu hiệu giá IPMA thấp hơn 5,5log2 hoặc NA thấp hơn 3,9log 2 thì heo nhạy cảm với PCV2 hơn

Miễn dịch trung gian tế bào truyền qua sữa đầu: Theo Goubier và ctv (2008), trong sữa đầu của heo nái SPF (specific pathogen free) tiêm vắc-xin PCV2 có chứa IFN--SC đặc hiệu PCV2 Oh và ctv (2012) đã nghiên cứu sự truyền các tế bào lym-phô đặc hiệu PCV2 thụ động qua sữa đầu cũng như khả năng bảo hộ của miễn dịch thụ động qua trung gian tế bào cho heo con sinh ra từ nái được tiêm phòng vắc-xin PCV2 Kết quả cho thấy, sau khi bú sữa đầu, heo con sinh ra từ nái được tiêm vắc-xin có số lượng IFN--SC đặc hiệu PCV2 cao hơn đáng kể, có sự gia tăng đáp ứng quá mẫn

muộn đặc hiệu PCV2 (PCV2-specific delayed type hypersebsitivity) và đáp ứng tăng sinh PBMC mạnh hơn so với heo con sinh ra từ nái không được tiêm vắc-xin Miễn

dịch qua trung gian tế bào truyền qua sữa đầu đóng vai trò quan trọng trong việc bảo

vệ heo con sơ sinh trong thí nghiệm công cường độc heo con lúc 3 tuần tuổi Tuy nhiên, cần phải nghiên cứu thêm để xác định khoảng thời gian miễn dịch qua trung gian tế bào thụ động có khả năng bảo vệ heo con chống lại PCV2

Không Giảm bạch cầu với viêm u hạt

ở mô lym-phô nhẹ hoặc không

Sẩy thai hoặc

thai hóa gỗ - Thai hóa g- Gan của bào thai sưng lớn và ỗ hoặc bị phù

sung huyết

- Tim thai triển dưỡng với nhiều vùng bị mất màu

- Viêm cơ tim thai không nung

mủ đến hoại tử hoặc sợi hóa

- Gan thai sung huyết

- Phổi thai viêm nhẹ

- Màng nhày ruột dày

- Hạch màng treo ruột sưng lớn

khó thở Phđốm nâu ổi không xẹp và có nhiều - Viêm phbị viêm loét, hoại tử từ trung ổi kẻ u hạt, phế quản

bình đến nghiêm trọng, xơ hóa

- Thận sưng lớn, bề mặt vỏ thận

có hạt mịn, bể thận thủy thũng

- Đôi khi lách nhồi huyết

- Viêm mạch máu hoại tử có hệ

thống

- Viêm cầu thận hoại tử sơ hóa

với viêm thận kẻ không mủ

- Giảm bạch cầu từ không đến trung bình với viêm u hạt ở các

mô lym-phô

1.2.6 Các bi ện pháp phòng và kiểm soát PMWS

Trước khi có vắc-xin PCV2 các biện pháp phòng PMWS chủ yếu dựa vào phương pháp quản lý, kiểm soát yếu tố đồng nhiễm, cải thiện phẩm chất giống, dinh dưỡng và liệu pháp huyết thanh Theo Madec và ctv (2001), muốn kiểm soát PMWS

cần thực hiện “bốn quy tắc vàng” đó là: (1) hạn chế tiếp xúc giữa các đối tượng heo thông qua giảm một phần mật độ đàn nuôi; (2) heo bị stress là cơ hội để bệnh bộc phát (nếu hệ thống miễn dịch suy yếu, PCV2 sẽ gây bệnh); (3) nhu cầu dinh dưỡng phù hợp theo lứa tuổi heo; (4) đảm bảo các điều kiện vệ sinh và an toàn sinh học Năm 2004, vắc-xin thương mại phòng PMWS đầu tiên xuất hiện trên thế giới Đến nay, vắc-xin PCV2 được chứng minh là có hiệu quả trong việc phòng PMWS trên heo, giúp giảm tỉ lệ chết và cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày

1.3 Các nghiên c ứu về di truyền của PCV2

1.3.1 Các nghiên c ứu về biến đổi di truyền của PCV2 trên thế giới

Kết quả phân tích sự tiến hóa của PCV2 theo Firth và ctv (2009) cho thấy, cả

2 genotype PCV2 (PCV2a và PCV2b) có khả năng đã xuất hiện từ một tổ tiên chung khoảng 100 năm trước đây và tiến hóa độc lập kể từ thời điểm đó, mặc dù cùng lưu hành trong cùng các loài ký chủ và các vùng địa lý Phân tích phát sinh loài giữa các genotype PCV2 cho thấy, sự phân nhánh khởi đầu là PCV2c sau đó đến sự phân nhánh của PCV2a, PCV2b và PCV2d, sự phân nhánh của PCV2a xảy ra trước so với PCV2b (Dupont và ctv, 2008; Guo và ctv, 2010; Cortey và ctv, 2011; Ge và ctv, 2012) Cũng theo kết quả phân tích của Firth và ctv (2009), tốc độ thay thế nucleotide

của PCV2 khoảng 1,2 x 10-3 sự thay thế/vị trí/năm (substitutions/site/year) Theo ghi

nhận của Pérez và ctv (2011), từ phân tích các PCV2 thu thập ở Cuba từ năm 2005 –

2009, tốc độ thay thế nucleotide của PCV2 từ 3,1 x 10-3 đến 6,6 x 10-3 sự thay thế/vị trí/năm Tốc độ này được ghi nhận là cao nhất đối với một vi-rút ADN sợi đơn Tốc

độ tiến hóa cao như vậy có thể cho phép PCV2 duy trì khả năng tiến hóa tương đương với các vi-rút ARN sợi đơn và cao hơn so với các vi-rút ADN sợi đôi

Các nghiên cứu cho thấy có sự biến đổi toàn cầu về genotype của PCV2 từ PCV2a sang PCV2b và sự xuất hiện vượt trội của PCV2b từ sau năm 2003 (Olvera và ctv, 2007; Dupont và ctv, 2008) Genotype PCV2a và PCV2b tương đồng khoảng 95%

về trình tự nucleotide (Olvera và ctv, 2007) Sự khác nhau cơ bản giữa PCV2a và PCVb chủ yếu là ở ORF2 Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và peptide giữa 2 genotype này khoảng 90% Genotype PCV2a và PCV2b đã được tái phân lập từ các ca PMWS trên toàn thế giới Kết quả phân tích trình tự gen của các phân lập PCV2 cho

thấy, từ năm 1997 đến năm 2006 sự biến đổi genotype của PCV2 không xảy ra ở Hàn

Quốc, Nhật Bản hoặc Úc (Dupont và ctv, 2008) Sau đó, từ năm 2005 – 2007, PCV2b

trở thành genotype vượt trội ở Hàn Quốc (Kim và ctv, 2009a), ở Nhật Bản cả PCV2a

và PCV2b đều được phát hiện trong các phân lập giữa năm 2006 và 2007 (Takahagi

và ctv, 2008) Olvera và ctv (2007) phân tích 148 chuỗi trình tự nucleotide bộ gen của PCV2 có trên cơ sở dữ liệu của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) đến tháng

9 năm 2005, tác giả ghi nhận PCV2b là genotype chủ yếu công bố sau năm 2003 (87/94), trong khi đó genotype công bố trước năm 2003 chủ yếu là PCV2a (33/53) Câu hỏi đặt ra là tại sao lại có sự biến đổi trên quy mô toàn cầu từ PCV2a sang PCV2b? Đến nay vẫn là một câu hỏi chưa có câu trả lời rõ ràng chính xác Tuy nhiên,

dựa trên các dữ liệu có sẳn cho thấy, sự gia tăng thương mại trên toàn thế giới về heo

và các sản phẩm có nguồn gốc từ heo; stress, mật độ nuôi, áp lực của các bệnh khác như PRRS; khả năng lây truyền qua nhiều đường khác nhau cũng như sức đề kháng mạnh mẽ và đặc biệt là tốc độ thay thế nucleotide cao của PCV2, có lẽ đóng vai trò quan trọng trong việc thay thế genotype của PCV2 (PCV2b thay thế cho PCV2a) trên quy mô toàn cầu

PCV2c được ghi nhận đầu tiên ở Đan Mạch từ các mẫu huyết thanh heo lưu

trữ vào những năm 1980 – 1990 Vào thời điểm này, PMWS lại không hiện diện hoặc

ít nhất là không phát hiện thấy (Dupont và ctv, 2008) Franzo và ctv (2015) đã phát hiện được một phân lập PCV2 thuộc genotype 2c trên heo hoang dã (feral pig) thu

thập từ năm 2010 ở Brazil

Genotype PCV2d, còn được gọi là biến chủng PCV2b – mPCV2b, được mô

tả đầu tiên ở Trung Quốc (Wang và ctv, 2009; Guo và ctv, 2010) Sau đó được mô tả

ở một số nước như Mỹ (Xiao và ctv, 2012), Việt Nam (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013) và Hàn Quốc (Seo và ctv, 2014a) Một điều đáng lưu ý là mPCV2b lại được phát hiện ở các ca tiêm vắc-xin PCV2 thất bại ở Mỹ (Xiao và ctv, 2012; Opriessnig

và ctv, 2013b) và Hàn Quốc (Seo và ctv, 2014a) Có khá nhiều tranh cãi liên quan đến PCV2d về cách phân chia genotype cũng như về tên gọi Tuy nhiên, theo kết quả phân tích của Xiao và ctv (2015) thì PCV2d đáp ứng đủ điều kiện để được công nhận

là một genotype độc lập Theo nhóm tác giả này, PCV2d có thể đã xuất hiện ở Thụy

Sĩ từ năm 1998 với phân lập S98-30512 (mã số GenBank JX512855) Căn cứ vào kết

quả phân tích cây phát sinh chủng loại theo phương pháp gần giống tối đa likelihood, ML) và nối kết liền kề (neighbour-joining, NJ), genotype PCV2d được chia thành 2 subgenotype đó là PCV2d-1 và PCV2d-2 Đồng thời, có sự phổ biến vượt trội của PCV2d-2 so với PCV2d-1, và có thể PCV2d-1 là tổ tiên của PCV2d-2 (Xiao và ctv, 2015) Kết quả nghiên cứu của Xiao và ctv (2016) cho thấy, PCV2d đặc

(maximum-biệt là PCV2d-2 ngày càng phổ biến và trở thành genotype lưu hành vượt trội ở Mỹ

Nghiên cứu của Davies và ctv (2016) cho thấy sự xuất hiện genotype PCV2 mới với tên gọi là PCV2e PCV2e có bộ gen dài 1777 nt, với ORF2 dài 717 nt mã hóa protein dài 238 aa ORF2 của PCV2e dài hơn 15 nt so với ORF2 của PCV2a và PCV2b và dài hơn 12 nt so với ORF2 của PCV2d và PCV2c, và tương đồng khoảng 85% so với các ORF2 của các genotype trên Kết quả phân tích hồi cứu của Davies

và ctv (2016) chỉ ra rằng PCV2e xuất hiện đầu tiên ở Mỹ vào năm 2006 Đến nay, có khá ít thông tin về sự phân bố, tỉ lệ lưu hành cũng như tầm quan trọng của PCV2e

Các genotype khác: từ kết quả hồi cứu của Bao và ctv (2017), PCV2 còn được phân chia thêm một genotype mới, PCV2f Ngoài Trung Quốc, PCV2f còn được phát hiện ở Croatia, Ấn Độ và Indonesia PCV2f có chiều dài ORF2 là 705 nt Khoảng cách di truyền giữa PCV2f và các genotype PCV2 khác dao động từ 0,047 – 0,172 đối với ORF2 và từ 0,031 đến 0,08 khi so sánh toàn bộ gen Điều này cho thấy PCV2f

đủ điều kiện để phân thành genotype mới theo như định nghĩa của Grau-Roma và ctv (2008) và Segalés và ctv (2008) Ngoài ra, còn có các genotype PCV2g và PCV2h Trong đó, có một số chủng trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp, theo cách phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) được xếp vào PCV2g và PCV2h

S ự tái tổ hợp giữa các genotype PCV2

PCV2 tiếp tục tiến hóa thông qua đột biến điểm và tái tổ hợp ORF2 được xem

có tốc độ đột biến cao nhất trong số các gen của PCV2, dẫn đến một vài biến đổi tính

kháng nguyên của protein Cap tương ứng (Olvera và ctv, 2007; Hesse và ctv, 2008; Wang và ctv, 2009) Điều kiện tiên quyết để xảy ra sự tái tổ hợp là sự đồng nhiễm nhiều hơn một chủng vi-rút trong cùng một tế bào hoặc một ký chủ Thực tế cho thấy có sự nhiễm đồng thời cả PCV2a và PCV2b từ các mẫu thu thập được ở các heo mắc PCVD (Horlen và ctv, 2007; Hesse và ctv, 2008) Phân tích của Hesse và ctv (2008) đã mô tả

một chủng PCV2 (chủng phân lập 0737A) sở hữu gen ORF1 từ PCV2a và ORF2 từ PCV2b Tiếp theo đó, nhiều tác giả cũng báo cáo về sự phổ biến của vi-rút thể ghép PCV2a/b xảy ra trên heo ở Mỹ (Cheung, 2009 [36]), Hàn Quốc (Kim và ctv, 2009a) và Trung quốc (Cai và ctv, 2012)

Điều khá thú vị là việc tái tổ hợp giữa các chủng PCV2 không chỉ xảy ra trong

tự nhiên, mà có thể tạo ra chủng vi-rút tái tổ hợp in vitro từ 2 chủng bố mẹ khác nhau,

bằng cách cho nhiễm cùng lúc 2 chủng PCV2 khác nhau trên môi trường tế bào PK15 (Lefebvre và ctv, 2009) Về vị trí tái tổ hợp (recombinant breakpoint), Ma và ctv (2007) ước đoán rằng, vị trí tái tổ hợp định vị ở giữa vùng gốc sao chép (Ori) và gen Rep của PCV2 Tương tự, Kim và ctv (2009a) cho rằng, vị trí tái tổ hợp xảy ra ở gen Rep, còn theo kết quả nghiên cứu của các tác giả khác lại cho rằng sự tái tổ hợp tự nhiên xảy ra bên trong gen Cap của PCV2 (Cheung, 2009; Lefebvre và ctv, 2009; Cai và ctv, 2012)

1.3.2 Các nghiên c ứu về biến đổi di truyền của PCV2 ở Việt Nam

Các ca nghi ngờ PMWS trên heo được báo cáo đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2004 có liên quan đến việc gia tăng tình trạng còi trên các đàn heo sau cai sữa (Lâm Thị Thu Hương và ctv, 2005) Nghiên cứu hồi cứu cho thấy PCV2 xuất hiện ở

miền Nam Việt Nam từ năm 2000 hoặc sớm hơn (Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv, 2006) Phân tích trình tự nucleotide bộ gen của 4 phân lập PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam giữa năm 2002 và 2007 (vietnam1 (2002), vietnam2 (2006) và vietnam3 (2004) và vietnam5 (2007)), kết quả 3 phân lập thu thập vào năm 2002,

2004 và 2006 thuộc về cùng một nhánh và có mức độ tương đồng trình tự nucleotide rất cao từ 99,66% đến 99,83%, trong khi đó phân lập thu thập năm 2007 được xếp vào nhánh khác so với 3 phân lập trên và có mức độ tương đồng từ 96,15% đến 96,42% so với cả 3 phân lập này Điều này cho thấy, ba phân lập vienam1, vietnam2

và vietnam3 có thể chung nguồn gốc và chúng khác biệt so với phân lập vietnam5

(Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv, 2008) Một nghiên cứu khác phân tích trình tự một phần đoạn ORF2 của PCV2 của 2 chủng PCV2 thu nhận tại thành phố Hồ Chí Minh

và 11 chủng thu nhận từ tỉnh Đồng Nai trong năm 2010 của Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2013), kết quả có 5 chủng PCV2 (1 chủng thu nhận từ thành phố Hồ Chí Minh và 4

chủng thu nhận từ Đồng Nai) thuộc genotype PCV2b các chủng còn lại đều thuộc genotype PCV2d

Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2013) phân tích trình tự bộ gen và protein Cap của 30

chủng PCV2 được thu nhận từ năm 2008 đến 2011 từ các tỉnh ở Việt Nam, kết quả có

8 chủng thuộc genotype PCV2b và các chủng còn lại thuộc nhóm tái tổ hợp giữa PCV2a

và PCV2b Cũng theo tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2012), ứng dụng kỹ thuật nested PCR khảo sát trên 583 mẫu bệnh phẩm thu thập từ năm 2011 đến 2012 từ đàn heo nuôi

tại 4 tỉnh: Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Giang và Hải Dương, kết quả cho thấy tất cả các chủng PCV2 lưu hành ở đàn heo thuộc 4 tỉnh trên đều thuộc genotype PCV2b Gần đây nhất là nghiên cứu Phạm Hồng Quân và ctv (2017) ghi nhận ở Việt Nam lưu hành đồng thời PCV2b, nhóm tái tổ hợp và PCV2d

Nhìn chung, các nghiên cứu về di truyền PCV2 trên thế giới và ở Việt Nam ghi nhận PCV2 lưu hành phổ biến hiện nay thuộc genotype PCV2b và PCV2d

1.4 Các nghiên c ứu về vắc-xin PCV2

1.4.1 Các lo ại vắc-xin PCV2

1.4.1.1 V ắc-xin cổ điển

Các nghiên cứu đầu tiên nhằm cố gắng tìm ra vắc-xin phòng bệnh PMWS là

loại vắc-xin vô hoạt thông thường Pogranichnyy và ctv (2004) đã thử nghiệm tính

an toàn và hiệu lực của 2 loại vắc-xin vô hoạt (vi-rút được vô hoạt bằng UV hoặc BEI) trên heo CD/CD, theo mô hình đồng nhiễm với PRRSV và chất kích thích miễn

dịch (keyhole limpet hemocyanin - KLH) kết hợp với chất bổ trợ Freund không hoàn

chỉnh Kết quả cho thấy, việc tiêm vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu giúp cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày cũng như làm giảm tỉ lệ chết Cũng nghiên cứu vắc-xin

vô hoạt phòng bệnh PMWS trên heo con, Yang và ctv (2012) đã thử nghiệm vắc-xin PCV2 dựa trên chủng WuHan (mã số GenBank: FJ598044) thuộc genotype PCV2b,

vô hoạt bằng formalin phối trộn với chất bổ trợ dầu (oil-adjuvant) trên heo con 28