slide Thiết kế khung bê tông cốt thép nhà dân dụng

slide Thiết kế khung bê tông cốt thép nhà dân dụng tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn...

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -PHẠM THỊ NHÀN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC

PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI

GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

Người hướng dẫn khoa học: ThS NGUYỄN PHÚ HÙNG

THÁI NGUYÊN - 2010

NỘI DUNG BÁO CÁO

1 Mở đầu

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3 Kết quả và thảo luận

4 Kết luận và kiến nghị

MỞ ĐẦU

Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu Một trong những nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn

E.coli.

Việc xác định nhanh các nhóm E.coli bằng các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định E.coli gây tiêu chảy Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu nhất.

 Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của E.coli gây tiêu chảy ở người”.

 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện các gen độc lực của 5

nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, làm

tiền đề cho việc tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán

các nhóm E.coli gây tiêu chảy.

MỞ ĐẦU

NỘI

DUNG

NGHIÊN

CỨU

Tách DNA tổng số từ khuẩn lạc

E.coli

Khuếch đại các gen độc lực đặc

trưng của 5 nhóm E.coli

MỞ ĐẦU

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng E.coli chuẩn Quốc tế do Phòng

Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1, EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối chứng không có gen độc lực).

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Các

chủng

E.coli

chuẩn

Quốc tế

Các

chủng

E.coli

chuẩn

Quốc tế

Nuôi cấy qua đêm trên môi trường MPA đặc, thu khuẩn lạc

Nuôi cấy qua đêm trên môi trường MPA đặc, thu khuẩn lạc

Tách DNA trực tiếp

từ khuẩn lạc

Tách DNA trực tiếp

từ khuẩn lạc

Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR

Khuếch đại gen

bằng phản ứng PCR

Hình 2.1 Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu

Bảng 2.1 Các trình tự mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR

Gen

độc lực Cặp mồi (primer) Trình tự primer (5’ → 3’)

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

vt2 VT2 - FVT2 - R TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGTACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA 298

vt1 VT1 - FVT1 - R GAAGAGTCCGTGGGATTACGAGCGATGCAGCTATTAATAA 130

elt LT - FLT - R TCTCTATGTGCATACGGAGCCCATACTGATTGCCGCAAT 322

eae eae - Feae - R CACACGAATAAACTGACTAAAATGAAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT 376

IpaH IpaH - FIpaH - R GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTACGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCC 620

EAST1 EA - FEA - R CAATGTATAGAAATCCGCTGTTCTGGCGAAAGACTGTATCAT 630

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Các

0C

520C

720C

1 phút

1 phút

Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi

3 720C 10 phút 1 Tổng hợp chuỗi

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ KHUẨN LẠC

DNA được tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc E.coli bằng

phương pháp của Cebula và cộng sự (1995) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm.

Ưu điểm: - Tổng thời gian tách DNA là 25 phút.

- Không phải tiêu tốn nhiều hóa chất.

- Lượng DNA thu được là rất nhỏ, nên có thể sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho các phản ứng PCR (3 µl/1 phản ứng) mà không cần tiến hành pha loãng

2 KHUẾCH ĐẠI CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA CÁC NHÓM E.COLI

2.1 Gen độc lực eae

603 bp

270 bp

376 bp

872 bp

Hình 3.1 Kết quả khuếch đại gen eae

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1;

4 EAEC; 5 EHEC2; 6 EIEC; 7 EC

2.2 Gen độc lực vt1

M 1 2 3 4 5 6 7

130 bp

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EHEC1; 2 EC; 3

EAEC;

4 EPEC; 5 EHEC2; 6 EIEC; 7 ETEC

2.3. Gen độc lực vt2

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EHEC1; 2 EHEC2; 3

EPEC;

4 ETEC; 5 EIEC; 6 EAEC; 7 EC

298 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

2.4 Gen độc lực elt

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 EHEC1;

3 EHEC2; 4 ETEC; 5 EAEA; 6 EIEC; 7 EC

322 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

2.5 Gen độc lực IpaH

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2

EIEC;

3 EHEC1; 4 EHEC2; 5 ETEC; 6 EAEC; 7 EC

M 1 2 3 4 5 6 7

2.6 Gen độc lực EAST1

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 EHEC1;

3 EHEC2;4 EIEC; 5 ETEC, 6 EAEC; 7 EC

630 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

Bảng 3.1 Kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli

EPEC EHEC1 EHEC2 EAEC EIEC ETEC EC

-Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm của nhóm EHEC

+ : Dương tính - : Âm tính

Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli

Gen Nhóm

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

2 KIẾN NGHỊ

Tiếp tục phát triển nghiên cứu và phát triển thành kĩ thuật mutiplex PCR

để có thể chẩn đoán nhanh tác nhân gây tiêu chảy là E.coli ở người.

1 KẾT LUẬN

Đã tách chiết được DNA tổng số của các nhóm vi khuẩn E.coli bằng

phương pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc, tiết kiệm được nhiều thời gian và hoá chất nghiên cứu

Khuếch đại thành công các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli là:

eae, vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1

Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo của chúng

tôi để tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán tác nhân gây bệnh là E.coli.