Hợp tác nghiên cứu quy trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối người

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc màng ối hiện nay trên thế giới: Gần đây, bổ sung các phương thức trị liệu hiện nay như điều trị nội khoa, phẫu thuật, ghép tạng và các phương

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ

TẾ BÀO GỐC MÀNG ỐI Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

TS.BS Phạm Văn Trân GS.TS Hoàng Văn Lương Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội - 2012

3

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC CÁC HÌNH 8

DANH MỤC CÁC BẢNG 11

MỞ ĐẦU 12

Luận cứ, cách tiếp cận để đạt được mục tiêu 20

NỘI DUNG KHOA HỌC ĐÃ THỰC HIỆN 22

PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 22

1 Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa chọn và phân lập tế bào gốc 22

2 Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối 27

3 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào be ta tụy đảo 36

4 Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 40

5 Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm 45

6 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đánh giá sản phẩm sinh học tấm tế bào gốc màng ối: 49

PHẦN II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

1 Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa chọn và phân lập tế bào gốc 51

2 Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối 51

3 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào be ta tụy đảo 56

4 Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 57

4.1 Chuẩn bị các tấm màng ối đông khô 58

4.2 Sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 59

4

5 Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết

thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm 61

6 Các kỹ thuật khác 65

6.1 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 65

6.2 Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào 66

6.3 Kỹ thuật Western blot 67

6.4 Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 67

6.5 Đo sự tăng sinh của tế bào 68

PHẦN III: KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC 70

1 Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa chọn và phân lập tế bào gốc 70

1.1 Xác định cấu trúc biểu mô màng ối, màng nền và màng vô mạch trên tiêu bản nhuộm HE 70

1.2 Xác định quần thể tế bào biểu mô, tế bào gốc màng ối 71

2 Kết quả phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc màng ối 74

2.1 Phân lập 74

2.2 Nuôi cấy tăng sinh 75

2.3 Bảo quản và phục hồi thành công tế bào gốc màng ối 81

3 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào beta tụy đảo 85

3.1 Kết quả biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì (keratinocytes) 85

3.1.1 Kết quả nhuộm hóa miễn dịch tế bào 85

3.1.2 Kết quả RT-PCR 86

3.1.3 Kết quả western blot 87

3.2 Kết quả biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta 88

3.2.1 Biểu hiện của OCT-4 - dấu ấn của tế bào gốc 90 3.2.2 Biểu hiện của Insulin - Dấu ấn tế bào gốc biệt hóa thành tế bào beta 92

5

4 Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 95

4.1 Kết quả thu nhận màng ối tươi 95

4.2 Kết quả xử lý đông khô tấm màng ối 96

4.3 Kết quả thu được tấm màng ối đông khô sau xử lý bằng tia phóng xạ 97 4.4 Kết quả kiểm tra cấu trúc của màng ối đông khô 98

4.5 Lựa chọn giá đỡ phù hợp để nuôi cấy tế bào gốc màng ối 100

4.6 Đánh giá khả năng tồn tại và phát triển của tế bào gốc trên giá đỡ bằng hình thái, số lượng tế bào 101

5 Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm 102

5.1 Diễn biến lâm sàng thỏ thực nghiệm và vết thương được ghép tấm tế bào gốc màng ối 102

5.1.1 Diễn biến toàn thân 103

5.1.2 Thay đổi một số chỉ số máu ngoại vi của thỏ bị bỏng trong quá trình điều trị 104

5.2 Diễn biến tấm tế bào gốc màng ối trên vết thương, đánh giá khả năng tồn tại của tấm tế bào gốc màng ối 107

5.2.1 Tình trạng vết bỏng những ngày đầu sau bỏng 107

5.2.2 Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 109

5.2.3 Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 10-15 111

5.2.4 Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 16-24 113

5.2.5 Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 28 115

5.2.6 Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng sau điều trị ở các nhóm 118

5.4 Hình thái cấu trúc mô vùng vết thương che phủ bằng tấm tế bào gốc màng ối 120

5.5 Thay đổi vi khuẩn học tại vết thương ghép tấm tế bào gốc màng ối……… 127

5.5.1 Nhiễm khuẩn tại vết bỏng ngày thứ 3 sau điều trị 127

6

5.5.2 Nhiễm khuẩn tại vết bỏng ngày thứ 7 sau điều trị 128

5.5.3 Nhiễm khuẩn tại vết bỏng ngày thứ 14 sau điều trị 128

5.6 Tính an toàn của tấm tế bào gốc màng ối khi ghép trên vết bỏng thực nghiệm 129

5.6.1 Ảnh hưởng của điều trị che phủ tấm TBG màng ối vết thương bỏng trên chỉ tiêu hóa sinh chức năng gan, thận 129

5.6.2 Tính an toàn của tấm TBG màng ối đông khô 130

6 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đánh giá sản phẩm sinh học tấm tế bào gốc màng ối: 131

6.1 Yêu cầu chất lượng 131

6.1.1 Công thức: 131

6.1.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu: 132

6.1.3 Chất lượng thành phẩm 132

6.2 Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản 134

KẾT LUẬN 135

KIẾN NGHỊ 137

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH… ……….135

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 149

7

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

AFP Alpha Feto Proteine

BMP Bone Morphogenetic Protein

CK Cytokeratin

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s medium

FBS Fetal Bovine Serum: Huyết thanh bào thai bê

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

HAE Human Amniotic Epithelial Cells

HAM Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

HNF-4 Hepatocyte Nuclear Factor -4

ICAM Intercellular Adhesion Molecule-1, CD54

NCAM Neural Cell Adhesion Molecule

Nhuộm HE Phương pháp nhuộm Hematoxilyn/Eosin

NMSL Nước muối sinh lý

Oct Octamer-binding transcription factor-4

PBS Phosphate Buffered Salin

PCAM Platelet-endothelial cell adhesion molecule

PL Plastic

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SCF Stem Cell Factor

SGOT Serum Glutamat Oxaloacetat Transaminase

SGPT Serum Glutamat Pyruvat Transaminase

SMA Smooth Muscle Actin

SSEA-4 Stage-Specific Embryonic Antigen

TBG Tế bào gốc

VCAM Vascular cell adhesion molecule

8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ nhau thai và vị trí màng ối 22

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc màng ối 23

Hình 1.3 Đặc tính của tế bào gốc màng ối 32

Hình 1.4 Nhuộm hóa miễn dịch tế bào gốc màng ối 33

Hình 1.5 Hình thái và sự tăng sinh của tế bào gốc màng ối 34

Hình 1.6 Khả năng biệt hóa của tế bào gốc màng ối 36

Hình 2.1 Sơ đồ ly tâm với Percoll 53

Hình 2.2 Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối 56

Hình 2.3 Hệ thống máy làm đông khô các màng sinh học 58

Hình 2.4 Sơ đồ hệ thống xử lý màng ối đông khô bằng phóng xạ 59

Hình 3.1: Cấu trúc màng ối trên tiêu bản nhuộm HE 70

Hình 3.2: Nhuộm hóa mô miễn dịch màng ối 73

Hình 3.3 Hình ảnh tế bào chụp trực tiếp trên đĩa nuôi cấy qua kính hiển vi đối pha 76

Hình 3.4 Khả năng tăng sinh của tế bào gốc màng ối 77

Hình 3.5 Xác định đặc tính của tế bào gốc màng ối bằng kỹ thuật hóa miễn dịch huỳnh quang 80

Hình 3.6 Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 82

Hình 3.7 Hình ảnh tế bào gốc sau 24 giờ nuôi cấy 84

Hình 3.8 Hình ảnh nhuộm hóa miễn dịch OCT-4, vimentin, CK-14, CK-19 85

Hình 3.9: Biểu hiện ARNtt của CK-14 và CK-19 86

Hình 3.10 Kết quả Western blot OCT-4 và CK-14 87

Hình 3.11 Hình ảnh tế bào gốc màng ối người sau 7 ngày nuôi cấy 92

Hình 3.12: Biểu hiện ARNtt và protein của Insulin 93

Hình 3.13 Màng ối tươi được tách từ bánh rau 96

9

Hình 3.14 Các tấm màng ối thu được sau khi xử lý qua hệ thống làm đông khô 97Hình 3.15 Cấu trúc mô học của tấm màng ối 99Hình 3.16 Hình ảnh tế bào gốc nuôi cấy trên tấm màng ối đông khô được “làm ướt” 101Hình 3.17 Tốc độ tăng sinh của tế bào gốc màng ối 102Hình 3.18 Tổn thương bỏng thực nghiệm sau khi gây bỏng 108Hình 3.19 Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ nhất sau bỏng 109Hình 3.20 Tổn thương bỏng ngày thứ 3 sau bỏng trên thỏ được đắp bằng tấm tế bào gốc màng ối 110Hình 3.21 Tổn thương bỏng ngày thứ 3 sau bỏng trên thỏ được đắp bằng silverin 111Hình 3.22 Tổn thương bỏng ngày thứ 3 sau bỏng trên thỏ được đắp bằng nước muối sinh lý 111Hình 3.23 Vết bỏng ngày thứ 10 sau gây bỏng 113Hình 3.24 Vết bỏng được ghép tấm TBG quan sát ở ngày thứ 24 sau gây bỏng 113Hình 3.25 Vết bỏng được điều trị bằng silverin quan sát ở ngày thứ 24 sau gây bỏng 114Hình 3.26 Vết bỏng được rửa bằng NMSL quan sát ở ngày thứ 24 sau gây bỏng 115Hình 3.27 Vết bỏng được điều trị ghép tấm tế bào gốc quan sát ở ngày thứ 28 sau bỏng 116Hình 3.28 Vết bỏng được điều trị bằng Silverin quan sát ở ngày thứ 28 sau bỏng 117Hình 3.29 Vết bỏng được rửa bằng NMSL quan sát ở ngày thứ 28 sau bỏng 118

10

Hình 3.30 Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng ngày thứ 28 sau bỏng 119Hình 3.31 Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ

3 sau bỏng 122Hình 3.32 Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ

7 sau bỏng 124Hình 3.33 Hình ảnh mô học tại chỗ tổn thương bỏng ngày thứ 14 sau bỏng 127Hình 3.34 Hình ảnh mô học mô gan và mô thận 130

11

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Khả năng sử dụng giá đỡ trong công nghệ mô 44

Bảng 2.1: Trình tự của các cặp mồi (primers) sử dụng trong đề tài nghiên cứu 65

Bảng 3.1 Thời gian tác dụng của enzym phân cắt mô 75

Bảng 3.2 Thay đổi trọng lượng thỏ tại các thời điểm nghiên cứu 103

Bảng 3.3 Thay đổi thân nhiệt thỏ tại các thời điểm nghiên cứu, 104

Bảng 3.4 Thay đổi số lượng hồng cầu máu ngoại vi của thỏ bỏng tại các thời điểm nghiên cứu 104

Bảng 3.5 Thay đổi nồng độ hemoglobin trong máu ngoại vi của thỏ bỏng ở các nhóm nghiên cứu 105

Bảng 3.6 Thay đổi số lượng bạch cầu máu ngoại vi của thỏ bỏng tại các thời điểm nghiên cứu 106

Bảng 3.7 Tốc độ thu hẹp vết bỏng của thỏ ở các nhóm nghiên cứu 118

Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ ba sau điều trị 127

Bảng 3.9 Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ 7 sau điều trị 128

Bảng 3.10 Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ 14 sau điều trị 128

12

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc là tế bào nền móng của tất cả các tế bào, mô và cơ quan trong cơ thể, đây là những tế bào chưa biệt hoá nhưng có khả năng trở thành các tế bào chuyên biệt và có chức năng mới tương ứng [1] Dựa vào nguồn gốc, các tế bào gốc được phân chia thành 4 loại đó là: Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) và tế bào mầm phôi (Embryonic germ cells), tế bào gốc thai (Foetal stem cells), tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells/Somatic stem cells) [2] Dựa vào đặc tính hay mức độ biệt hoá, tế bào gốc được chia thành : Tế bào gốc toàn năng hay tế bào gốc thủy tổ (totipotent stem cells), tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells), tế bào gốc đa năng (multipotent stem cells), tế bào gốc đơn năng (mono/unipotential progenitor cells) [3]

Do tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng khác nhau nên đã mở ra triển vọng dùng tế bào gốc để tái tạo lại các mô, nghiên cứu phát triển thuốc cũng như ứng dụng vào điều trị trên lâm sàng Tiềm năng ứng dụng quan trọng nhất của tế bào gốc là trị liệu tế bào gốc (stem cell therapy) Từ tế bào gốc có thể tạo ra các loại tế bào mới, mô mới để bổ sung hoặc thay thế cho các tế bào và mô cơ quan bị tổn thương hay mất chức năng Cho tới nay biện pháp hữu hiệu nhất để điều trị những trường hợp này

là ghép mô, cơ quan - nhưng nhu cầu ghép mô và tạng lại cao hơn rất nhiều

so với nguồn cung cấp Từ một loại tế bào gốc có thể biệt hoá thành nhiều loại tế bào chuyên biệt để điều trị cho các bệnh có thoái hoá hoặc chấn thương mất tế bào như các bệnh Alzheimer [4], chấn thương tuỷ sống, đột quỵ não [5, 6], nhồi máu cơ tim [7, 8], tiểu đường tuỵ và các tổn thương mô

do bệnh tiểu đường [9] bỏng và nhiều bệnh khác [10, 11] Tuy nhiên nguồn

tế bào gốc có khó khăn về số lượng và qui trình thu thập tế bào

13

Màng ối là một sản phẩm thường bỏ đi trong quá trình sinh nở là một nguồn cung cấp tế bào gốc lý tưởng Sử dụng tế bào gốc màng ối không gặp phải những vấn đề về đạo đức, xã hội Các tế bào gốc phân lập từ màng ối có tính sinh miễn dịch thấp, không có khả năng ung thư hóa và có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [12] Từ tháng 1 năm 2010, chúng tôi

nghiên cứu đề tài nghị định thư hợp tác với Nhật bản “Hợp tác nghiên cứu

qui trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối người”

với mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể sau:

1 Mục tiêu chung

- Xây dựng thành công quy trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào giống tế bào biểu bì da và giống tế bào beta tụy đảo

- Chế tạo một số sản phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối và bước đầu ứng dụng trong điều trị thử nghiệm trên động vật

2 Mục tiêu cụ thể

2.1 Xây dựng qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc từ màng ối người

2.2 Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì

và tế bào beta tụy đảo

2.3 Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo một số chế phẩm sinh học từ màng ối người: tế bào gốc màng ối và tấm tế bào gốc màng ối

2.4 Nghiên cứu điều trị trên động vật thực nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối trong điều trị bỏng da

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc màng ối hiện nay trên thế giới:

Gần đây, bổ sung các phương thức trị liệu hiện nay như điều trị nội khoa, phẫu thuật, ghép tạng và các phương tiện hỗ trợ cơ học thì y học tái tạo

14

đang được tập trung vào những thay thế tiềm năng đối với ghép các mô/tạng phức tạp Y học tái tạo là một lĩnh vực mới dựa trên sử dụng các tế bào gốc

để thay thế các mô và cơ quan bị tổn thương

Các tế bào gốc màng ối đã được ứng dụng để điều trị hàng loạt bệnh lý

ở các cơ quan khác nhau như nhồi máu cơ tim, Parkinson [12-14]… Các nghiên cứu mới đây trên mô hình động vật và một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy có thể dùng tế bào gốc màng ối để tái tạo lại mô cơ bị tổn thương [12-14] Các nghiên cứu theo hướng này dựa vào tính “uyển chuyển” (plasticity) của tế bào gốc màng ối và mở ra triển vọng mới ứng dụng tế bào gốc màng ối trong điều trị

Cấy ghép mô cần cung cấp một số lượng lớn mô người trưởng thành

Có thể phân lập tế bào gốc từ màng ối và biệt hóa tạo thành những mô chuyên biệt Như vậy từ một số lượng nhỏ tế bào có thể nuôi cấy tăng sinh

15

bào trong tổ chức giúp cho tế bào HAE hoặc HAM có thể tồn tại, di chuyển

và tăng sinh nhanh chóng trên môi trường mới che phủ bề mặt mô ở 37oC đồng thời khi giảm nhiệt độ đến 4°C, lớp phủ bề mặt của môi trường tan chảy làm tế bào HAE hoặc HAM có thể tách ra từ bề mặt [18, 19] Để hỗ trợ,

có tác giả sử dụng màng polyvinylidene difluoride (PVDF) [20, 21] Các tế bào trên tấm này có thể phục hồi được tăng sinh nhanh chóng trên bề mặt môi trường Trong hệ thống này, ngược lại với enzym thủy phân, chỉ có sự tương tác giữa protein bám dính và bề mặt vật liệu bị phá vỡ Các tế bào này như một tấm liên tục với màng protein và bám dính nguyên vẹn protein khi nhiệt độ giảm xuống Kỹ thuật mới về tạo tấm tế bào sẽ hữu ích trong kỹ thuật mô cũng như trong cấy ghép tế bào

Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào tuyến tụy (Pancreatic cells)

β-Đối với việc điều trị bệnh tiểu đường typ I hay cấy ghép tụy có thể kiểm soát đường máu và tiến tới ngăn chặn biến chứng Tuy nhiên, luôn bị giới hạn bởi không đủ nguyên liệu dùng cho cấy ghép Theo hướng khác, các tế bào tuyến tụy được tạo ra bằng biệt hóa các tế bào gốc phôi thai Các tế bào

ES chuột có thể biệt hóa thành tế bào sản xuất insulin, nhưng không thành tế bào tuyến tụy trưởng thành Kết quả của quá trình biệt hóa từ tế bào ES thành tế bào sản xuất insulin là việc tăng biểu hiện của các dấu ấn TGF β2, PDX-1 hoặc insulin [22, 23]

Để biệt hóa tế bào HAE thành tế bào sản xuất insulin môi trường nuôi cấy được bổ sung nicotinamide 10 mM trong vòng 4 tuần Khi kích thích với nicotinamide, tế bào HAE biểu hiện ARNtt insulin in vitro, và ở mức độ in vivo, nồng độ đường trong máu giảm về mức bình thường trên chuột gây tiểu đường thực nghiệm bằng streptozotocin [24]

Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì da (keratinocytes)

16

Da động vật có vú là một tổ chức đặc biệt bao gồm những quần thể tế bào gốc biểu bì Chúng có khả năng tăng sinh mạnh trước khi biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác của biểu bì đồng thời luôn tồn tại một nhóm tế bào có khả năng tăng sinh trên màng đáy

Rất nhiều các sản phẩm da nhân tạo được ứng dụng trong điều trị vết thương, vết bỏng nhưng nó vẫn không được đưa vào sử dụng thường quy vì giá thành cao, hiệu quả điều trị thấp và đặc biệt không chứa các thành phần phụ của da như nang lông, tuyến mồ hôi, tuyến bã Tế bào gốc dựa trên những phát hiện của Ernest A.McCulloch và James E Till [25], [26] là các tế bào có khả năng tự làm mới và có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau trong đó có tế bào biểu bì có thể giúp chế tạo da nhân tạo in vitro Nguồn tế bào gốc quan trọng được sử dụng trong y học tái tạo là các tế bào gốc phôi, tế bào gốc trưởng thành và gần đây là các tế bào gốc màng ối

Năm 1996, Bagutti và CS đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc phôi thành tế bào có biểu hiện marker của tế bào biểu bì [27] Trên cơ sở đó, một số tác giả đã thành công trong biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tổ chức giống biểu bì [28]

Khả năng biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì đem đến hy vọng sản xuất các tế bào giống tế bào gốc da đa tiềm năng khu trú ở trung bì, gốc lông và tuyến bã cho phép da tự làm mới lớp biểu mô phủ và các phần phụ của chúng [29-31] Những tế bào biểu bì có khả năng tự làm mới cao sẽ

có thể là nguốn tế bào phục vụ trong y học tái tạo đặc biệt trong lĩnh vực điều trị bỏng [32, 33]

Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào gan (Hepatocytes)

Để điều trị các bệnh gan nặng như viêm gan cấp tính và suy gan nặng một số tác giả thực hiện cấy ghép tế bào gan Tuy nhiên, vẫn có rất nhiều câu hỏi về cách tiếp cận này, đặc biệt là liên quan đến người cho tế bào Năm

17

2000, các tế bào gốc gan đã được tìm ra từ quá trình phát triển của gan chuột,

và tế bào gốc gan được đề xuất như là một nguồn tế bào cấy ghép Các tế bào không thuộc dòng tế bào gan có thể biệt hóa thành tế bào gan cũng đã được

đề xuất là tiềm năng có ích cho việc cấy ghép tế bào Các nguồn tế bào từ tủy xương cho thấy có thể biệt hóa thành tế bào gan cả ở in vivo và in vitro trên chuột, cũng như các tế bào gốc phôi chuột [34, 35] Ở người, tế bào gốc phôi thai, các tế bào nguồn gốc tủy xương, và các tế bào máu dây rốn đã được thể hiện là nguồn cho có thể cấy ghép [12] Tuy nhiên, khả năng biệt hóa của các

tế bào gốc tủy xương thành tế bào gan thấp nên việc ứng dụng có nhiều hạn chế

Các tế bào HAE biểu hiện albumin, α1-antitrypsin (α1-AT), cytokeratin

18, phosphoenolpyruvate cacboxykinaza và đặc biệt là cytochrome P450 Sau khi nuôi cấy HAE, tế bào bắt đầu xuất hiện α-fetoprotein (α-FP), transthyretin, tyrosine aminotransferase (TAT) và CYP-450 [12] Ngoài ra, albumin và glycogen được phát hiện bằng hóa miễn dịch ở hầu hết các tế bào HAE nuôi cấy cũng phù hợp với các nghiên trước cho rằng sản xuất albumin cũng đã được quan sát thấy trong một nửa các tế bào màng ối chuột Điều đó chứng tỏ rằng có thể dùng tế bào gốc màng ối để tái sinh gan

Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào sụn (Chondrocytes)

Cũng đã có nhiều công trình mô tả, phân tích tế bào gốc màng ối HAM và tiềm năng cho việc sửa chữa sụn [36-43] Tế bào HAM liên quan đến gen, bao gồm Sox-9, Sox-5, Sox-6, protein bone morphogenetic (BMP) -

2 và -4, cũng như thụ thể BMP Trong thí nghiệm in vitro, collagen loại II và aggrecan được biểu hiện sau khi cho chất cảm ứng của chondrogenesis với BMP-2 ở invitro, các tế bào HAM được cấy vào sụn mô của chuột với BMP-2 hoặc cấy ghép với giá đỡ collagen vào vị trí bị khuyết tật, tạo ra xương của chuột dựa vào thay đổi hình thái với sự lắng đọng của collagen

18

loại II Những kết quả này cho thấy, tế bào HAM có tiềm năng biệt hóa thành tế bào sụn trong in vitro và in vivo, có tiềm năng điều trị cho bệnh về sụn hoặc sụn bị tổn thương [36]

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc ở Việt nam

Năm 1995, Bệnh viện Huyết Học-Truyền Máu Thành phố Hồ Chí Minh lần đầu sử dụng tuỷ xương (thực chất là liệu pháp tế bào gốc tạo máu) để ghép điều trị cho 1 bệnh nhân 27 tuổi bị bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ (CML) [153] Tiếp đó, năm 1996 thực hiện ghép tế bào gốc máu ngoại vi tự thân để điều trị bệnh lý ác tính về máu Năm 2002 bệnh viện này tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn để điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho (ALL) [153] Sau đó Viện Huyết học truyền máu Trung ương cũng bắt đầu tiến hành nghiên cứu ghép tuỷ xương để điều trị bệnh suy tuỷ, một số bệnh lý máu ác tính Từ năm 2004, Trung tâm Huyết học và Truyền máu - Bệnh viện trung ương Huế cũng đã triển khai ghép tế bào gốc từ máu ngoại vi để điều trị bệnh Lơ-xe-mi cấp [155] Tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, năm 2004 đã tiến hành các ca ghép tế bào máu từ máu tự thân cho các bệnh nhân ung thư máu

Năm 2007, Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội

108 tiến hành ghép tế bào gốc từ tủy xương điều trị tổn thương xương khó lành hoặc khớp giả [156, 157] Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh tiến hành các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc, biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn [158, 159] Năm 2009, Ngân hàng tế bào gốc dây rốn đầu tiên của Việt Nam được thành lập để lưu trữ các tế bào gốc từ mẫu mô dây rốn Hiện tại ở Việt Nam đang có một số ngân hàng tế bào gốc được thành lập Đó là ngân hàng tế bào gốc của các đơn vị Công ty cổ phần Mekophar; Học viện quân y; Viện Huyết học - Truyền máu thành phố Hồ Chí Minh

Viện bỏng quốc gia, Học viện Quân y trong nhiều năm đã nghiên cứu

19

trị liệu tế bào trong điều trị vết thương, vết bỏng, các tấm da nuôi cấy đã được chế tạp và sự dụng trong điều trị đạt kết quả tốt Viện bỏng quốc gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào biểu bì để điều trị vết thương, vết bỏng

Bên cạnh các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu được triển khai

ở các cơ sở nêu trên, các nghiên cứu tế bào gốc phôi chuột nhắt và tế bào gốc phôi gà cũng đã được tiến hành tại hai trường Đại học khoa học tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà nội và Thành phố Hồ Chí Minh Một dự án nghiên cứu tế bào gốc phôi người và tế bào gốc từ người trưởng thành cũng

đã được thông qua và bắt đầu triển khai tại Trường Đại học y Hà Nội và các đơn vị phối hợp Tuy nhiên các dự án và nghiên cứu kể trên chưa đề cập đến việc lập ngân hàng bảo quản lâu dài và sử dụng tế bào gốc màng ối

Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép tế bào gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp Nhu cầu điều trị các khuyết hổng mô và suy chức năng tế bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là con số lớn hơn Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế Đó là nguồn tế bào gốc còn hạn chế (mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp dụng

tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn chưa đạt hiệu quả cao Thêm nữa, các hướng nghiên cứu về tế bào gốc ở trong nước còn chưa đa dạng, chưa quan tâm nhiều đến những hướng tạo sinh tế bào gốc từ nguồn các tế bào khác

Ngày 4 tháng 6 năm 2009, Học viện quân y và đại học Toyama – Nhật bản đã ký kết văn bản thỏa thuận hợp tác nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc màng ối trong y học Theo văn bản này, phía Nhật sẽ chuyển giao kỹ thuật công nghệ đồng thời hỗ trợ một phần kinh phí để nghiên cứu Số còn lại do chính phủ Việt nam chi trả Vì vậy đề tài này đã giúp chúng tôi tận dụng

20

được sự hợp tác quốc tế để tạo ra sản phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối

Từ đó góp phần đào tạo đội ngũ nghiên cứu viên lành nghề và góp phần phát triển nền khoa học nước nhà

Luận cứ, cách tiếp cận để đạt được mục tiêu

Y học tái tạo là một lĩnh vực mới dựa trên sử dụng các tế gốc để thay thế hay cải thiện chức năng của mô, tái lập lại mô bị phá hủy với khả năng biệt hóa và tăng sinh cao [12] Một yếu tố quan trọng là tiềm năng thay thế các tạng, mô phức tạp Gần đây, tế bào từ màng ối được công bố là các tế bào đa tiềm năng đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Màng ối có những đặc điểm ưu việt: tế bào phân lập có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau; tính sinh miễn dịch yếu và không đòi hỏi phải lấy từ phôi người để phân lập [36, 38, 44] Vì vậy tránh được những tranh cãi liên quan đến sử dụng tế bào gốc phôi thai người Hơn nữa, Trường Đại học Toyama

đã phát triển được tấm tế bào có nguồn gốc từ màng ối sử dụng polymer nền tảng là protein đàn hồi phản ứng với nhiệt độ, không gây độc [13, 45-48] Nhóm nghiên cứu do giáo sư Nikaido đứng đầu cũng đã tạo ra tấm màng ối đông khô “hyper- dry-amnion” Tấm màng ối này có rất nhiều ưu điểm và đã bắt đầu sử dụng trên người mang lại kết quả tốt [13, 45-48] Công trình này

đã được cấp patent của Nhật và Mỹ cho phép dùng trên người từ năm 2006

Trên cơ sở đó, đề tài này nhằm mục tiêu chuyển giao các kỹ thuật mới

từ phía Nhật trong lĩnh vực phân lập, bảo quản, nuôi cấy tăng sinh cũng như hiệu quả điều trị của tấm tế bào gốc màng ối Vấn đề then chốt quyết định sự thành công của đề tài là chúng tôi đã hoàn toàn làm chủ được từng giai đoạn của quy trình công nghệ đặc biệt giai đoạn nghiên cứu cơ bản thuộc các chuyên ngành y học cơ sở Dựa trên điều kiện về cơ sở vật chất và con người, chúng tôi thiết kế, triển khai đề tài theo các bước sau:

Kết hợp với phía bạn, tổ chức tập huấn về kỹ thuật trước khi triển khai

Đánh giá tác dụng điều trị của tấm tế bào gốc màng ối trên động vật thực nghiệm

Để thực hiện được toàn bộ quy trình công nghệ đề ra, nhóm nghiên cứu đã làm chủ được hoàn toàn các kỹ thuật cần thiết Thêm vào đó là sự giúp đỡ tạo điều kiện tối đa của các cơ quan chức năng bộ Khoa học - Công nghệ, bộ Quốc phòng, Học viện quân y Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng có được sự tư vấn, trợ giúp nhiệt tình vô tư của các nhà khoa học, các chuyên gia Việt nam và Nhật bản Điều này làm cho đề tài có được những kết quả có

ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

NỘI DUNG KHOA HỌC ĐÃ THỰC HIỆN

Đề tài bao gồm 6 nội dung khoa học công nghệ chính đã được thực hiện như sau

bì và nội bì)

Hình 1.1 Sơ đồ nhau thai và vị trí màng ối

Khoang ối, từ một khoang nhỏ nằm ở mặt lưng phôi (mặt ngoại bì) đến cuối tháng thứ nhất khi phôi đã khép mình trở thành một khoang ngày càng lớn chứa đựng toàn bộ phôi Trong khoang ối, phôi tắm mình trong nước ối

22

Màng ối được cấu tạo bởi 2 lớp: ngoại bì màng ối được lót ngoài bởi trung bì màng ối, một phần của lá thành trung bì ngoài phôi Khi phôi tiếp tục lớn lên, khoang ối ngày càng to ra, nước ối ngày càng được tạo ra nhiều, màng ối ngày càng giãn rộng ra tiến sát tới màng đệm Phần lá thành trung bì ngoài phôi phủ ngoại bì màng ối tới sát nhập vào màng đệm Vì vậy, khoang ngoài phôi ngày càng hẹp lại và cuối cùng biến mất

Màng ối được cấu tạo bởi 3 màng chính: màng biểu mô đơn (single epithelial layer), màng nền dày (basement membrane) và màng vô mạch (avascular mesenchyme) [44] Không có thần kinh, mạch máu hay bạch huyết trong màng ối (Hình 1.2.) Nó nằm ngay sát khoang ối (amniotic cavity) và các tế bào lá phôi (trophoblast cell) Nó có thể dễ dàng phân tách khỏi màng đệm (chorion) nằm ngay dưới đó Màng ối được nuôi dưỡng bởi dinh dưỡng và oxy từ dịch ối bao xung quanh và mạch máu của thai

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc màng ối [49]

23

24

Màng ối đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thai nhi và chuyển dạ Trong khởi điểm và duy trì co thắt tử cung, prostaglandin đóng vai trò cốt yếu Biểu mô màng ối không chỉ là một trong những nguồn cung cấp prostaglandin, đặc biệt là prostaglandin E2 [49], mà nó còn tạo ra các enzym sinh tổng hợp prostaglandin (prostaglandin-biosynthesis enzyme) ví

dụ như phospholipase, prostaglandin synthase, và cyclooxygenase Hơn nữa, các enzyme này được điều hòa bởi human chorionic gonadotropin (hCG), các thụ cảm thể của chúng cũng tìm thấy trong màng biểu mô màng ối Biểu

mô màng ối có mức độ hoạt động chuyển hóa cao trong quá trình thai nghén

và nó có chức năng điều hòa pH của dịch màng ối, giữ nó ở trạng thái hằng định là khoảng 7,1

Laminin là thành phần chính của màng nền tế bào gốc màng ối tham gia vào quá trình biệt hóa tế bào, duy trì hình dạng và hoạt động tế bào, duy trì kiểu cấu trúc mô đồng thời thúc đẩy sự tồn tại của các mô thông qua các thụ cảm thể của tế bào như integrin và dystroglycan [50] Vì vậy, xác định đặc điểm các chuỗi dưới đơn vị của laminin ở màng ối người là rất quan trọng Laminin có nhiều đồng dạng khác nhau bao gồm các chuỗi α-, β-, và γ- mà mỗi chuỗi này có nhiều dạng chuỗi dưới đơn vị : α1– 5, β1 – 3, γ1 – 3 [49] Laminin được tạo ra và bài tiết từ ngay biểu mô nằm trên màng nền vì vậy biểu hiện gen của các chuỗi dưới đơn vị laminin trong các tế bào biểu mô màng ối (human amniotic epithelial cells - HAE) được phát hiện bằng phản ứng reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Phân tích về mặt mô học, màng ối gồm hai lớp biểu mô đơn và trung mô Lớp biểu mô đơn là một lớp tế bào biểu mô đơn hình trụ, một phần tự do và một phần tiếp xúc với màng đáy Nằm dưới màng đáy là lớp trung mô màng ối gồm các mô liên kết được tạo bởi các tế bào giống nguyên bào sợi

Màng ối trên bề mặt bánh rau rất dày Bề mặt vùng này được bao phủ biểu mô ba tầng gồm 3 – 4 hàng tế bào Đây cũng là vùng có nhiều tế bào

Chức năng màng ối: Nhờ nước ối chứa bên trong, màng ối và khoang

ối đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng

Chức năng cơ học: Che chở cho phôi thai, chống những sốc phát sinh

từ môi trường bên ngoài; cho phép thai được cử động tự do và làm cho thai không dính vào màng ối

Chức năng giữ cân bằng lượng nước trong phôi thai: nước ối có quan

hệ trực tiếp với sự giữ cân bằng lượng nước trong phôi thai Khi thai chứa quá nhiều nước, lượng nước thừa được đào thải vào khoang ối, khi phôi thai mất nước nó sẽ hấp thụ nước ối Nước ối sẽ có tác dụng chống khô ráo cho thai: phôi thai tắm mình trong nước ối nên không bị khô

Cung cấp các chất dinh dưỡng: Các chất dinh dưỡng và oxy được cung

cấp bằng cách khuếch tán từ các lớp sâu của thành tử cung hoặc thông qua dịch ối từ thai nhi Một số nghiên cứu đã chứng tỏ sự hiện diện của protein vận chuyển glucose 1 và 3 chủ yếu ở bề mặt đỉnh của các tế bào biểu mô màng ối [51]

Tổng hợp lipid nội ối: Các nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây cho thấy

có quá trình sinh tổng hợp lipid nội ối, chứ không phải có nguồn gốc từ những giọt lipid thoái hóa được tìm thấy trong màng ối Các chất béo có nguồn gốc từ tuần hoàn mẹ và đi vào nước ối sau khi thay đổi cấu trúc hóa học

26

Dự trữ glycogen: Sự hiện diện glycogen trong biểu mô màng ối ở giai

đoạn sớm thai kỳ có thể cung cấp một nguồn năng lượng là cần thiết bổ sung cho các bào quan như ty thể và lưới nội chất và hoạt động ẩm bào (pinocytotic) hạn chế của các tế bào HAE

Sinh tổng hợp prostaglandin: Màng ối là một nguồn cung cấp

prostaglandin E2 (PGE2) duy nhất [52, 53], đóng vai trò quan trọng trong việc khởi xướng và duy trì các cơn co thắt tử cung Màng ối đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh đẻ, bởi vì vị trí giải phẫu đặc biệt, với mối quan hệ chặt chẽ cơ tử cung, nước ối và cổ tử cung Enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin đã được tìm thấy trong màng ối của con người và bao gồm Phospholipases, enzym tổng hợp prostaglandin, và enzym tổng hợp endoperoxidase prostaglandin (cyclooxygenase) [52-55]

Tổng hợp leukotriene: Màng ối cũng tổng hợp ra leukotrienes, một

nhóm cytokine có nguồn gốc từ acid arachidonic [56] Các cytokine này ngoài chức năng là trung gian của phản ứng miễn dịch và giãn mạch còn có ảnh hưởng đến co bóp tử cung

Điều hòa pH: Biểu mô màng ối tham gia quá trình thủy phân carbonic,

trong quá trình chuyển hóa bicarbonate/CO2 [57], điều này cho thấy rằng biểu mô màng ối cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa

độ pH của nước ối [58, 59]

Chuyển hóa steroid: Hoạt động thủy phân 17 ß-hydroxysteroid

dehydrogenase cũng biểu hiện ở biểu mô màng ối của con người từ 7 đến 20 tuần của thai kỳ, điều này cho thấy rằng những tế bào có khả năng biến đổi steroid [60-64] So sánh màng ối ở giai đoạn đầu với giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ cũng cho thấy có sự biến đổi phức tạp ở lớp biểu mô màng ối: các liên kết ở khoảng gian bào trở nên phức tạp hơn với các liên kết giữa các

27

thể liên kết với các vi nhung mao cho phép tăng lượng nước trao đổi giữa mẹ

và dịch ối

2 Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối

Mới đây, ngoài các biện pháp điều trị hiện tại như điều trị nội khoa, phẫu thuật, ghép tạng, thiết bị hỗ trợ cơ học, y học tái tạo mở ra một tiềm năng mới trong điều trị bệnh Cơ sở của y học tái tạo là sử dụng các tế bào gốc tạo ra các sản phẩm thay thế sinh học và cải thiện chức năng mô, cơ quan Ba yếu tố cần thiết trong lĩnh vực này là: Tế bào gốc, với khả năng có thể tự làm mới, khả năng biệt hóa; giá đỡ và các yếu tố sinh trưởng, biệt hóa Hiện nay, tế bào gốc phân lập từ mô trưởng thành hoặc từ phôi vẫn là nguồn tế bào chủ yếu cho y học tái tạo Tuy nhiên cả hai nguồn tế bào này đều có rất nhiều những hạn chế Tế bào gốc từ mô trưởng thành của người bệnh tuy không đặt ra vấn đề thải ghép nhưng rất khó phân lập và nuôi cấy tăng sinh Số lượng tế bào ít, không đủ cho mỗi lần cấy ghép Ngược lại, tế bào gốc phôi tăng sinh rất mạnh trong môi trường nuôi cấy và dễ dàng biệt hóa thành các tế bào của mô trưởng thành nhưng cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ vì rất dễ có khả năng sinh ung thư và khi ghép đồng loài sẽ dễ dàng

bị thải ghép theo cơ chế giống như ghép mô và cơ quan trưởng thành Hơn nữa việc sử dụng tế bào gốc phôi luôn đặt ra tranh cãi về vấn đề đạo đức Do vậy việc nghiên cứu để tìm ra nguồn tế bào mới thay thế tế bào gốc trưởng thành và tế bào gốc phôi là hết sức cần thiết

Tế bào gốc màng ối là các tế bào gốc đa tiềm năng [48] Những tế bào này có thể biệt hóa thành 3 lớp tế bào mầm, chúng có tính sinh miễn dịch thấp và có khả năng chống viêm Sử dụng tế bào gốc màng ối không đặt ra vấn đề tranh cãi về đạo đức do không phải sử dụng phôi người Màng ối đã từng được sử dụng giống như một tấm băng sinh học trong điều trị bỏng,

+ Thu hoạch màng ối không gây ảnh hưởng gì đến sức khoẻ của cả mẹ

và con

+ Tế bào gốc từ màng ối còn rất trẻ nên khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được trực tiếp hoặc sau tăng sinh in vitro là rất lớn

+ Dễ thu hoạch, xử lý tế bào gốc

+ Việc thu hoạch và cất giữ tế bào gốc màng ối không vi phạm đạo đức + Có thể lưu trữ lâu dài để sử dụng điều trị cho chính người có màng ối hoặc người thân trong gia đình hoặc người khác không có quan hệ huyết thống

Quy trình phân lập tế bào gốc màng ối:

Quy trình phân lập tế bào gốc màng ối dựa theo quy trình của các tác giả đã đăng tải trên tạp chí quốc tế Phần lớn các tác giả đều sử dụng các enzym phân cắt mô có phối hợp với các biện pháp cơ học để phân lập Theo Toda A và CS (2007) [44], cắt màng ối thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng 1cm2, sau đó cho các mảnh màng ối vào dung dịch đệm phosphate-buffered saline (PBS) có chứa 0.03% hyaluronidase (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) và 0.025% deoxyribonuclease I (DNase I, Sigma-Aldrich

29

Co.) Sau đó cho mảnh màng ối vào dung dịch 0.25% trypsin (Sigma-Aldrich Co., Steinheim, Germany) trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Sigma, Irvine, UK) ủ ở nhiệt độ 37°C trong bể ấm nước

có trang bị máy lắc 100 lần/30phút Sau đó loại bỏ môi trường và tiếp tục cho trypsin trong môi trường DMEM lắc nhẹ 400-600 lần/30 phút Hỗn dịch

tế bào thu được nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh bào thai bê, 1% dung dịch kháng sinh chống nấm và chống vi khuẩn (antibiotic-antifungal solution -Gibco BRL) nuôi cấy trên đĩa (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) với mật độ 3.0 × 104 tế bào/cm2 Ủ đĩa nuôi cấy trong tủ nuôi cấy 37°C, 5% CO2 Số lượng tế bào thu được từ mỗi màng ối khoảng từ 8 × 106 đến 50 × 106 tế bào [44]

Tế bào gốc trung mô màng ối thu được sau khi đã lấy được hết tế bào gốc biểu mô Mảnh mô màng ối được cho vào môi trường DMEM có chứa collagenase (0.75 mg/ml) (Wako, Osaka) và DNase I (0.075 mg/ml) ủ ở nhiệt độ 37°C lắc nhẹ 600 lần trong 60 phút Tế bào thu được được lọc qua màng lọc và ly tâm Số lượng tế bào gốc trung mô thu được khoảng 1 ×

106/màng ối Một số tác giả còn đưa ra con số tính toán tỷ lệ tế bào biểu mô/tế bào trung mô là 4,3:1 ở màng ối của sản phụ đẻ thiếu tháng (23– 36 tuần) và 7,8:1 ở sản phụ đẻ đủ tháng [44]

Sở dĩ sử dụng trypsin trong quá trình phân lập vì trypsin là enzym protease có khả năng phân giải protein ngoại bào tương tự như collagenase Ngoài ra các enzym này hầu như không có tác dụng trên màng tế bào do cấu trúc đặc biệt của màng tế bào Việc phân lập tế bào gốc màng ối của các tác giả cũng không hoàn toàn giống nhau Có thể phân chia các phương pháp này theo hai nhóm: Nhóm thứ nhất, phân lập tế bào gốc biểu mô riêng theo quy trình nghiêm ngặt về thời gian ủ với enzym Sau khi màng ối giải phóng hết các tế bào biểu mô thì mới tiếp tục phân lập tế bào trung mô Nhóm thứ hai, cho phân rã toàn bộ màng ối, sau đó dùng Ficoll hoặc Percoll hoặc

30

Nicodenz để tách các phân lớp tế bào theo tỷ trọng Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp phân lập tế bào gốc màng ối theo nhóm thứ hai

Định danh và đặc điềm của tế bào gốc màng ối:

Trước đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh cả tế bào HAE (Human Amniotic Epithelial cells) và tế bào HAM (Human Amniotic Mesenchymal cells) biểu hiện nhiều marker tế bào gốc như octamer-binding transcription factor 4 (OCT-4), GATA-4, hepatocyte nuclear factor-3β (HNF-3β)… Những yếu tố này cho thấy không chỉ tế bào HAE mà còn cả tế bào HAM cũng là tế bào gốc đa tiềm năng

Tế bào gốc màng ối không chỉ biểu hiện dấu ấn của tế bào biểu bì như CA125 mà còn biểu hiện các dấu ấn của tế bào biểu mô nói chung như cytokeratin, vimentin [65-67] Tế bào gốc màng ối cũng dương tính với CD44 và desmin Vimentin dương tính với trên 97.5% trong tổng số tế bào

tế bào gốc màng ối nuôi cấy, trong khi chỉ 3.6% tổng số tế bào HAM biểu hiện dương tính với CK19+/vimentin+ Như vậy, tế bào gốc màng ối đồng thời biểu hiện cả marker của tế bào gốc trung mô và các tế bào gốc biểu mô [65] Điều này chỉ ra rằng tế bào gốc màng ối không hoàn toàn là tế bào gốc biểu mô và ngược lại chúng cũng không hoàn toàn là tế bào gốc trung mô Trong quá trình phát triển phôi, có sự chuyển dạng tế bào gốc trung mô-biểu

mô (epithelial-mesenchymal transition-EMT) trên màng ối [65] Trên cơ sở

đó, trong nghiên cứu này chúng tôi đã không đặt ra vấn đề phân lập tế bào gốc trung mô và tế bào gốc biểu mô Đặc tính của tế bào gốc màng ối được thể hiện trên hình 1.3 và 1.4

Tế bào gốc màng ối ở giai đoạn sớm biểu hiện các dấu ấn của tế bào gốc phôi như OCT-4, Rex-1, và SCF [68], và dấu ấn của tế bào nội bì phôi như BMP4, α- fetoprotein (FP), GATA-4, và HNF-4α, dấu ấn ngoại bì phôi

31

như Nestin và NCAM, dấu ấn trung bì phôi như Vimentin và CCK-18, dấu

ấn kháng nguyên hòa hợp tổ chức như HLA ABC và HLA DR [65, 68-70] Tuy nhiên tế bào gốc màng ối không biểu hiện dấu ấn đặc hiệu của trung bì phôi như brachyury, dấu ấn nội bì phôi BMP-2, dấu ấn ngoại bì FGF-5 và PAX-6 (Hình 1.3 A) [44, 68, 69] Tế bào gốc màng ối biểu hiện α-FP, HLA ABC, và HLA DR ở giai đoạn sớm nhưng không biểu hiện các dấu ấn này ở giai đoạn muộn Khi nghiên cứu hoạt tính telomerase của tế bào gốc màng ối

ở p3 băng TRAP được quan sát thấy (Hình 1.3 B)

Tế bào gốc màng ối biểu hiện dấu ấn của tế bào gốc TRA-1 -60,

SSEA-3, và SSEA-4 nhưng lại không biểu hiện VCAM-1, yếu tố von Willebrand, PECAM-1, và HLA DR (Hình 1.4.) [69, 71]

A

B

Hình 1.3 Đặc tính của tế bào gốc màng ối

A, Biểu hiện tính gốc của tế bào gốc màng ối; B, Hoạt tính của Telomerase

32

Hình 1.4 Nhuộm hóa miễn dịch tế bào gốc màng ối

Tế bào gốc màng ối dương tính mạnh với kháng thể kháng collagen type-I, -II, -III, -IV, -XII, Fibronectin, SSEA-3, -4, α-SMA, Vimentin, desmin, CK-18, HLA ABC, HCAM, và FSP Tuy nhiên chúng dương tính yếu với kháng thể kháng ICAM-1 và âm tính hoàn toàn với TRA-1-60, vWF,

33

PECAM-1, HLA DR, và VCAM-1 Nhuộm nhân tế bào bằng haematoxylin

Độ phóng đại: 200 lần

Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc màng ối:

Tế bào gốc màng ối có hình thái tương tự như nguyên bào sợi (fibroblast) (Hình 1.5 A) có thể nuôi cấy trong môi trường nhân tạo và thoái hóa sau khoảng 14 lần cấy chuyển Khi nuôi cấy, tế bào gốc màng ối trải qua khoảng 36.9 lần tự nhân đôi và cho khoảng 2.2 x 1019 tế bào (Hình 1.5 B)

TỐC ĐỘ TĂNG SINH CỦA

Erythropoietin (EPO) và EPO-receptor (EPO-R) biểu hiện ở tế bào HAE EPO kích thích biệt hóa, tăng sinh và khả năng sống của các tế bào tiền nguyên hồng cầu thông qua việc gắn với EPO-R và sự sản xuất EPO có tác dụng điều hòa nồng độ oxy trong máu Tuy nhiên việc sản xuất EPO ở tế bào HAE không bị kích thích bởi thiếu oxy Ogawa khẳng định rằng sự tổng hợp EPO ở tế bào HAE-SV40, tế bào được gây bất tử bởi việc gắn nhiễm với SV-40 (Simian Virus 40), được kích thích bởi progesterone, nhưng không bởi 17β-estradiol [74] Progesterone, có tác dụng giống như yếu tố điều hòa phiên mã (transcriptional regulator), qua vai trò trung gian của hai dạng khác nhau của progesterone receptor (PR): PR-A và PR-B PR-A là dạng được cắt bỏ đầu N tận của PR-B Ở tế bào gốc màng ối người, PR-B là yếu

tố kích hoạt phiên mã (transcriptional activator) của gen progesterone, trong khi PR-A là chất ức chế phiên mã của PR-B [74] PR-B dương tính với cả tế bào HAE và HAE-SV40 trong kỹ thuật Western blot, chỉ ra rằng sự tổng hợp EPO cso thể được điều hòa bởi progesterone không chỉ ở tế bào HAE-

SV40 mà còn ở cả tế bào HAE [74] Tuy vậy, chức năng của EPO với tế bào gốc màng ối vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ

3 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào

be ta tụy đảo

Xét đến khả năng biệt hóa, người ta mong đợi tế bào gốc màng ối có thể duy trì đặc tính đa tiềm năng trong quá trình nuôi cấy Trong quá trình phát triển phôi, khối tế bào màng trong của blastocyst tăng sinh tạo ra epiblast (phôi bắt nguồn từ tế bào này) và hypoblast (túi noãn bắt nguồn từ tế bào này) Tế bào epiblast (embryonic ectoderm) và tế bào biểu mô màng ối ngoại bì (amniotic epithelial layer-amniotic ectoderm) được hình thành vào khoảng ngày thứ 8 sau thụ tinh, trong khi đó, các tế bào trung mô (amniotic mesenchyme) được tạo ra từ lá trung bì phôi nguyên thủy

Khi nuôi cấy trong môi trường định hướng biệt hóa, tế bào gốc màng ối

có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau như tế bào mỡ, tế bào xương,

tế bào sụn, tế bào thần kinh và được xác định lần lượt bằng cách nhuộm Oil Red O, von Kossa, alcian blue, anti-Neu N và anti-Gal C (Hình 1.6)

Hình 1.6 Khả năng biệt hóa của tế bào gốc màng ối

36

37

a, Nhuộm tế bào mỡ bằng dầu đỏ O; b, Nhuộm tế bào xương bằng von Kossa; c, Nhuộm tế bào sụn bằng Alcian blue; d, Nhuộm tế bào thần kinh bằng Neu N; e, Nhuộm tế bào thần kinh bằng Gal C Vạch trắng trên hình tương đương với kích thước 100 µm

Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì:

Da người và động vật có vú bao gồm hai lớp biểu bì và trung bì trong

đó chủ yếu là tế bào biểu bì chiếm tới 95% tế bào của da Chính vì vậy nội dung của đề tài biệt hóa tế bào gốc thành tế bào da chính là biệt hóa tế bào gốc thành tế bào biểu bì

Tế bào biểu bì hay còn gọi là tế bào sừng, tế bào đáy, tế bào keratin…

Tế bào biểu bì không chỉ có ở da mà còn có mặt ở rất nhiều tổ chức khác như giác mạc, kết mạc, bộ phận sinh dục, tế bào niêm mạc miệng… Ngoài chức năng cấu trúc, tế bào biểu bì có vai trò quan trọng trong chức năng bảo vệ cơ thể, ngăn cách giữa cơ thể với môi trường bên ngoài Tế bào biểu bì tạo thành lớp bảo vệ dày đặc chống mất nước, giữ nhiệt cho cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của độc tố, vi khuẩn Tế bào biểu bì cũng có vai trò kích thích cơ thể tiết ra cytokin khi có chấn thương đồng thời hoạt hóa tế bào Langerhans của da Tế bào Langerhans giữ vai trò trình diện kháng nguyên khi có nhiễm khuẩn, khởi động quá trình đáp ứng miễn dịch mắc phải

Da là tổ chức biểu mô phân tầng mà ở đó tế bào gốc biểu bì khu trú ở tầng thấp nhất trên màng đáy Chúng có khả năng tăng sinh mạnh trước khi biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác của biểu bì chuyển tiếp đẩy dần lên bề mặt da Các tế bào biệt hóa sản xuất các protein quan trọng cho sự toàn vẹn của lớp ngoài cùng của da trong đó có lớp sừng Các tế bào biểu bì trong các lớp sừng là các tế bào biểu mô hình vảy, khô, chết và không còn nhân Một khi tế bào biểu bì biệt hóa đến lớp sừng, chúng được keratin hóa hay còn gọi

là sừng hóa, tạo ra lớp rắn, chắc bên ngoài của da

38

Protein chính được tìm thấy trong tế bào biểu bì là keratin Những protein này hình thành bộ khung xương (cytoskeleton) của tế bào biểu bì da Biểu hiện keratin thay đổi khi các tế bào gốc biểu bì biệt hóa thành các lớp tế bào khác nhau của da Càng biệt hóa thành tế bào lên lớp trên thì tế bào biểu hiện keratin càng mạnh Đó là cơ sở lý thuyết quan trọng để đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào gốc thành tế bào sừng

Cảm ứng biệt hóa thành keratinocyte hiệu quả nhất đã được thu được khi tế bào gốc được nuôi cấy trên màng ối đông khô có nguồn gốc từ các nguyên bào sợi bình thường của người (HNF) và tế bào NIH-3T3, cả hai đều

có nguồn gốc trung mô [75, 76] Trong mô hình nghiên cứu này, chúng tôi

sử dụng vitamin C và BMP-4 để hướng các tế bào gốc màng ối biệt hóa thành tế bào biểu bì, tế bào biểu hiện CK-14 sau 7 ngày nuôi cấy Đặc biệt khi thêm vào môi trường BMP-4, quá trình biệt hóa tăng lên rõ rệt

BMP-4 thuộc nhóm transforming growth factor-ß (TGF- ß ) đã được chứng minh trong thực nghiệm và khả năng định hướng biết hóa tế bào gốc phôi thành biểu bì Một khi đã biệt hóa, các tế bào biểu bì nhô cao, xung quanh có các tế bào chưa biệt hóa Một số tác giả đã thành công trong biệt hóa tế bào tế bào biểu bì thành tổ chức giống biểu bì [77] Cytokeratin CK-

14 và CK10 lần lượt biểu hiện đồng thời với collagen IV, VII, laminin1,

-5, integrin α6β4, fibronectin và nidogen [75] Nidogen là dấu ấn được sản xuất bởi nguyên bào sợi của da trong gia đoạn sớm của sự hình thành da khi phát triển phôi [77] Sự có mặt của nidogen chứng tỏ trong nhóm tế bào biệt hóa có nguyên bào sợi (fibroblast) Laminin-1 bình thường chỉ có ở fibroblast [77] Kết quả chỉ ra rằng tế bào gốc màng ối có thể biệt hóa thành

tế bào biểu bì da in vitro trong đó BMP-4 và các yếu tố trung bì giữ vai trò đặc biệt quan trọng Dựa vào những cơ sở lý thuyết trên đây, chúng tôi nuôi cấy tế bào gốc màng ối trong môi trường có bổ sung vitamin C, BMP-4,

39

huyết thanh bào thai bê và các yếu tố sinh trưởng khác Đánh giá biệt hóa bằng các dấu ấn của tế bào biểu bì như cytokeratin 14 và cytokeratin 19

Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào beta tụy đảo:

Để điều trị tiểu đường type I, việc ghép tụy một phần hay toàn phần đã được thực hiện Tuy nhiên, nguồn cho tụy ghép có hạn Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được khả năng sử dụng nguồn tế bào gốc phôi hoặc tế bào gốc trưởng thành để biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo để phục vụ cho cấy ghép Nhiều tác giả đã thành công biệt hóa từ tế bào phôi (Nestin dương tính) thành tế bào sản xuất insulin nhưng không tạo thành tế bào beta trưởng thành hoàn toàn [78, 79] Tế bào sản xuất insulin được kích thích bởi TGF β2 hoặc pdx-1, những yếu tố quan trọng trong sự phát triển của tụy Nguồn gốc của các tế bào beta tụy đảo vẫn còn nhiều tranh cãi Các tế bào beta có thể có nguồn gốc từ các tế bào gốc đa tiềm năng hoặc cũng có thể có nguồn gốc từ các tế bào đã biệt hóa tồn tại trong tụy qua quá trình giải biệt hóa (de/trans-differentiation) Có tác giả cho rằng tế bào beta có nguồn gốc từ các tế bào gốc (stem cells) khu trú ở biểu mô ống tụy, ở tiểu đảo langerhan [78, 80, 81] Đã chứng minh rằng glucagon like peptide 1-(1-37) (GLP) làm tăng sản xuất insulin của tế bào biểu mô đường tiêu hóa ở cả in vivo và in vitro [79, 82, 83] Chúng tôi cũng đã chứng minh được khả năng biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo của tế bào gốc màng ối bằng cách nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 10mM nicotinamide

In vitro, sau khi kích thích với nicotinamide, tế bào gốc màng ối biểu hiện ARNtt của insulin In vivo, HAE có khả năng làm giảm đường máu ở chuột gây tiểu đường bằng mô hình streptozotocin sau một vài lần ghép tế bào Tuy nhiên, trong nghiên cứu này có tới 20% chuột tiểu đường được điều trị khỏi bằng ghép tế bào gốc màng ối bị tái phát sau 6 tháng Điều này có thể phụ thuộc vào thời gian tồn tại của các tiểu đảo tế bào ghép Vấn đề là

40

làm thế nào để kéo dài thời gian tồn tại của các nhóm tế bào này Các nhà nghiên cứu cũng đã thành công trong việc sử dụng các tế bào bất tử HAE chuyển nạp sản xuất insulin để ghép điều trị tiểu đường thực nghiệm [79, 83]

Quá trình biệt hóa tế bào HAE thành tế bào tiết insulin dưới tác dụng kích thích của glucose cũng là một trong những vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu Đối với điều trị của bệnh tiểu đường, việc ghép tế bào β có nguồn gốc từ màng ối cần thiết phải chứng minh được các yếu tố kích thích biệt hóa sau ghép đặc biệt ở giai đoạn cuối thành tế bào beta hoàn toàn trưởng thành Mặc dù cơ chế điều chỉnh sự biệt hóa vẫn chưa sáng tỏ, nhưng vai trò của một số yếu tố đã được chứng minh như Maf, HB9, hoặc snail Dựa trên những phát hiện này, hiệu quả của cấy ghép các tế bào HAE cho điều trị bệnh tiểu đường có thể được cải thiện

Từ những cơ sở lý thuyết trên đây, trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi tiến hành nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta tụy đảo theo phuơng pháp nuôi cấy tế bào gốc màng ối trong môi trường cơ bản có

bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, nicotinamide và các yếu tố sinh trưởng khác Đánh giá kết quả biệt hóa bằng cách định lượng biểu hiện của dấu ấn insulin ở cả mức độ ARN thông tin và mức độ protein

4 Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối

Màng ối được coi như một giá đỡ sinh học cho công nghệ mô (tissue engineering)

Một điều kiện tiên quyết cho việc lựa chọn một giá đỡ là tính phù hợp

về mặt sinh học của nó Phù hợp sinh học là sự thích hợp với tổ chức sống, không độc, không gây ung thư hoặc không kích thích sinh miễn dịch trong

mô sống [84] Giá đỡ không bị phá hủy bởi quá trình viêm nên có thể phản ứng thích hợp của vật chủ [85-87] Ngoài ra, giá đỡ cần có tính chất cơ học phù hợp với mô bao gồm tính thấm, tính ổn định, độ đàn hồi, tính linh hoạt

41

và dễ dàng lấy bỏ khi cần [87] Giá đỡ cũng cần cho phép tế bào bám dính và khả năng thấm qua dễ dàng các chất như các yếu tố sinh trưởng và các vật liệu di truyền [88]

Sự bám dính của tế bào trên giá đỡ bị ảnh huởng bởi thành phần của giá

đỡ tương tự như chất gian bào (extracellular matrix - ECM) Sự hiện diện hay vắng mặt của một số phân tử của giá đỡ như collagen, laminin, fibronectin và vitronectin có ảnh hưởng rất lớn về độ bám dính và tăng trưởng của các tế bào Giá đỡ cho phép các tế bào bám dính, di chuyển và biệt hóa thông qua sự tương tác của nó với với các thụ thể trên bề mặt tế bào Các thụ thể này là các integrin [89] Integrin là thụ thể xuyên màng có một miền ngoại bào, gắn với ECM và một miền trong tế bào liên kết với khung xương của tế bào (Cytoskeleton) Sau khi gắn, các thụ thể integrin được tuyển dụng vào chức năng riêng biệt được gọi là "đầu mối dính" [90] Ở những khu vực này, các integrin giao tiếp với nhiều phân tử cụ thể về cấu trúc và tín hiệu Một số protein như talin, fillamin, paxillin hoặc vinculin, hoạt động như mối liên kết giữa các thụ thể integrin và actin của khung xương tế bào Sau đó, cytoskeleton liên kết với màng hạt nhân, màng của các bào quan của tế bào cũng như với các enzym khác nhau Vì vậy, integrin ảnh hưởng đến nhiều quá trình quan trọng trong và ngoài tế bào như các quá trình tăng sinh, biệt hóa hoặc chết theo chương trình (apoptosis) [90] Bản chất kép của phân tử bám dính là hoạt động cơ học và tín hiệu, cho biết rằng chúng hoạt động như các cảm biến môi trường ECM (cảm biến thay đổi cơ học và sinh hóa trong ECM), điều chỉnh cytoskeleton và trung tâm dẫn truyền tín hiệu [90, 91] Vì vậy, một giá đỡ với các thành phần ECM thích hợp sẽ là một môi trường ngoại bào lý tưởng cho TE

Màng ối là một giá đỡ với mô hình cấu trúc tương tự như chất gian bào trong tổ chức, cơ quan Tế bào biểu mô màng ối tiết ra các thành phân ngoại bào collagen type III và IV và các glycoprotein khác như (laminins, nidogen,