nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao việt nam (cervus nippon pseudaxis)

Nội dung: Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế bào đơn từ nhung hươu sao Nghiên cứu thu nhận v

Trang 1

I

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon Pseudaxis)

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Tiến Bằng

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 80.000.000

Kinh phí đã cấp: 72.000.000 theo TB số : 224 TB-SKHCN ngày 02/ 12 /2010 Mục tiêu:

Mục tiêu ngắn hạn: Nuôi cấy và nhân sinh khối in vitro thành công tế bào gốc nhung hươu sao

Mục tiêu dài hạn: Thu nhận những hoạt chất sinh học quý từ tế bào gốc nhung hươu sao nuôi

cấy in vitro và ứng dụng để tổng hợp thực phẩm chức năng

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký)

Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế

bào đơn từ nhung hươu sao

Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế

bào đơn từ nhung hươu sao Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên

Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên

Trang 2

 Sở khoa học thành phố Hồ Chí Minh, chương trình Vườn ươm sáng tạo Khoa học

và Công nghệ trẻ đã cấp kinh phí thực hiện đề tài

 Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ trẻ đã đứng ra chủ trì đề tài

 Các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Phòng thí nghiệm Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên TpHCM

 Trang tại chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Long Thành, Đồng Nai

Cuối cùng nhóm nghiên cứu xin gửi lời tri ân đến các thành viên hội đồng xét duyệt, phản biện và nghiệm thu đã đóng góp nhiều ý kiến tích cực và giúp đề tài thực hiện thành công

Tp Hồ Chí Minh, 04/06/2012

Chủ nhiệm đề tài

ThS Nguyễn Tiến Bằng

Trang 3

III

LỜI GIỚI THIỆU

Sự phát triển hằng năm của nhung hươu là trường hợp tái sinh duy nhất ở động vật hữu nhũ, một loài mà khả năng tái sinh lại các phần bị mất là rất hạn chế Ở một số loài hươu, tốc độ tái tạo nhung có thể đạt được 2cm/ngày Do vậy, sự tái sinh của nhung hươu thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học Các nhà nghiên cứu cho rằng đây có thể là một hiện tượng tế bào gốc Các tế bào nhung hươu có thể được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào nhung hươu tăng sinh mạnh và chiếm khoảng 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy Tiếp

đó, các tế bào nhung hươu được tiến hành cấy chuyền bằng Trypsin – EDTA 0,25% nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho sự phát triển của chúng Các tế bào nhung hươu thu nhận được thể hiện tính đa năng giống tế bào gốc Trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp, các tế bào nhung hươu có khả năng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ…

INTRODUCTION

The annual regeneration of deer velvets is a unique developmental event in mammals, which as a rule possess only a very limited capacity to regenerate lost appendages Some deer species, velvet regenerate rate achieves 2 cm/day Thus, velvet regeneration attract the scientists's attention very much Researchers said that velvet regeneration is a stem cell – based process The cells derived from dapple deer velvet have been collected and cultured with DMEM/F12 plus 10% FBS (fetal bovine serum) About 10th day, those cells strongly expand and cover with 70 – 80% Roux’s surface At that time, the cells derived from dapple deer velvet are subcultured by using trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development The cells derived from dapple deer velvet is multipotial like stem cells They could be differentiated to osteocytes in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate,

Trang 4

IV ascorbate, acid ascorbic; to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin

Trang 5

V

MỤC LỤC BÁO CÁO NGHIỆM THU I

Lời cảm ơn II Lời giới thiệu III Mục lục V Danh sách bảng VIII Danh sách hình IX

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Nhung hươu và ứng dụng của nó 1

1.1.1 Khái niệm 1

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của sừng hươu 1

1.1.3 Thành phần hóa học chính trong nhung hươu 2

1.1.4 Một số tác dụng dược lý của nhung hươu 3

1.1.4.1 Tác dụng đối với bệnh viêm xương khớp 3

1.1.4.2 Tác dụng đối với các bệnh thấp khớp 3

1.1.4.3 Tác dụng kích thích miễn dịch 4

1.1.4.4 Tác dụng làm giảm huyết áp 4

1.1.4.5 Tác dụng chống sốc 4

1.2 Khái quát về tế bào gốc 4

1.3 Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu và tiềm năng ứng dụng 5

1.3.1 Thế giới 5

Trang 6

VI

1.3.2 Việt Nam 10

1.4 Tính cấp thiết của đề tài 11

1.5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học thực tiễn 11

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu 13

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Tiến trình nghiên cứu 13

2.2 Dụng cụ và thiết bị 14

2.3 Hóa chất 15

2.4 Các phương pháp thực nghiệm 19

2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu 19

2.4.2 Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 20

2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn 21

2.4.4 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền 22

2.4.4.1 Quy trình cấy chuyền tế bào 22

2.4.4.2 Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam) 23

2.4.5 Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc 23

2.4.5.1 Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 23

2.4.5.2 Kiểm chứng khả năng biệt hóa 24

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu 28

3.2 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 29

3.3 Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào nhung hươu 31

Trang 7

VII

3.4 Kết quả cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu 35

3.5 Kết quả chứng minh tính gốc của các tế bào thu nhận được từ mẫu mô nhung hươu 42

3.5.1 Khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 42

3.5.2 Khả năng biệt hóa 42

3.5.2.1 Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo xương 42

3.5.2.2 Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 45

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

Trang 8

VIII

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài 14

2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 14

2.3 Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài 15

3.1 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi 29

3.2 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông

lạnh

30

3.4 Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào thu nhận từ nhung hươu 34

Trang 9

IX

DANH MỤC HÌNH

1.1 Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu 6

1.2 Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của

cuống [25]

9

3.2 Mẫu mô nhung hươu được cắt thành những mảnh nhỏ 28

3.3 Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2 29

3.4 Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu (X100 30

3.5 Tế bào nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy (X40) 32

3.8 Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy (X40) 33

Trang 10

X

3.11 Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ (X100) 36

3.12 Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ (X40) 36

3.13 Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 (cấy chuyền

lần 1) (X40)

37

3.14 Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền (X40) 37

3.18 Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa

(X40)

43

3.19 Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày nuôi cấy trong môi

trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200)

44

trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200)

44

trường biệt hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc

nhuộm Alizarin Red S (X40)

45

3.22 Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ trong tế bào chất sau

15 ngày nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế

47

Trang 11

XI

bào tạo mỡ (X100)

trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X40)

47

3.24 Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất của tế bào nhung hươu

sau khi nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế

bào tạo mỡ (X200)

48

trường biệt hóa thành tế bào tạo mỡ dương tính với thuốc

nhuộm Oil Red O (X40)

48

3.26 Tế bào nhung hươu thu nhận bởi Berg và cs [4] hay bởi Rolf

và cs [25]

49

3.27 Tế bào nhung hươu do đề tài thu nhận (X200 và X40) 49

3.28 Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương của

đề tài (A) so với tế bào AP (B) của Berg và cs [4]

50

3.29 Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ của đề

tài (A, C) so với tế bào Stro – 1+ (B, D) của Rolf và cs [25]

51

3.30 Tế bào nhung hươu của đề tài (A, B) , tế bào AP (C) và tế

bào Stro – 1+ (D) sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ cho kết

quả dương tính với nhuộm Oil Red O

52

Trang 12

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhung hươu và ứng dụng của nó

1.1.1 Khái niệm

Nhung hươu là sừng non của con hươu Thông thường, sừng chỉ hình thành ở hươu đực Hằng năm, vào cuối mùa hạ, sừng cũ rụng đi; mùa xuân năm sau sừng mới

sẽ mọc lại Sừng hươu khi mới mọc rất mềm, mặt ngoài được bao phủ bởi một lớp lông

tơ màu nâu nhạt, trong chứa rất nhiều mạch máu Vì sừng non mềm và sờ mịn như nhung nên được gọi là nhung hươu

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của sừng hươu

Sừng hươu được thay thế hàng năm Nếu không bị cắt, nhung hươu sẽ tiếp tục phát triển tạo thành sừng; đến mùa xuân, cặp sừng này rụng đi và cặp nhung mới hình thành Nếu bị cắt, phần gốc của nhung hươu sẽ hình thành chiếc đế bằng sừng; vào mùa rụng sừng thì chiếc đế này rụng (hiện tượng đổ đế) Vào thời kì rụng sừng, các tế bào xung quanh gốc sừng phát triển mạnh, đẩy sừng cũ bật ra khỏi đế Sau khi sừng cũ rụng, quá trình hình thành nhung và tạo sừng mới sẽ bắt đầu Quá trình này được hoàn thành trong khoảng ba tháng rưỡi với hai thời kỳ: thời kỳ hình thành nhung và thời kỳ hình thành sừng Thời kỳ hình thành nhung diễn ra trong khoảng hai tháng, được chia thành ba giai đoạn:

Giai đoạn bong lớp váng trên bề mặt gốc sừng: sau khi đổ đế, trên bề mặt gốc sừng tạo thành lớp váng mỏng; sau 4 – 5 ngày, lớp váng này bong dần ra và nhung hươu bắt đầu nhú lên

Giai đoạn nhung có dạng hình quả đào: phần sừng non lồi dần lên là một khối mềm, mọng, có màu hồng, phình to dần và có hình quả đào (bướu thứ nhất), bên trên

có phủ lớp lông trắng xám rất mịn

Giai đoạn nhung có dạng hình yên ngựa: nhung hình quả đào bắt đầu phân nhánh lần thứ nhất tạo thành hai phần phát triển độc lập Phần trước phát triển thành

Trang 13

nhánh trán, phần sau là thân nhung Khi nhánh trán đã phát triển hoàn thiện, phía đầu thân nhung lại phình to lần nữa (bướu thứ hai) và chuẩn bị phân nhánh lần thứ hai Lúc này, nhung bắt đầu có dạng hình yên ngựa

Sau giai đoạn hình yên ngựa, thân nhung tiếp tục phát triển để phân nhánh lần thứ hai Cùng với quá trình này là sự hóa sừng dần của nhung theo chiều từ gốc đến ngọn, từ trong ra ngoài – thời kỳ hình thành sừng Thời kỳ này cũng gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn phân nhánh lần thứ hai: đỉnh thân nhung hình thành rãnh nhỏ và thân nhung phân nhánh lần thứ hai Khi nhánh thứ hai phát triển hoàn thiện, bướu thứ ba lại được hình thành trên thân nhung

Giai đoạn phân nhánh lần thứ ba: trên bướu thứ ba tạo thành rãnh nhỏ và tiếp tục phân nhánh giống như giai đoạn phân nhánh lần thứ hai để tạo thành cặp sừng ba nhánh

Giai đoạn bong lớp da ngoài sừng: sau khi cặp sừng hươu có dạng ba nhánh, lớp

da có lông tơ bao bọc xung quanh sừng thoái hóa dần Quá trình hóa sừng vẫn tiếp tục diễn ra Khi kết thúc quá trình hoá sừng, hươu bắt đầu cọ sừng vào cây, mô đất… làm bong lớp da bao bọc bên ngoài Cặp sừng mới này sẽ tồn tại cho đến mùa rụng sừng năm sau

1.1.3 Thành phần hóa học chính trong nhung hươu

Thông thường, thành phần hóa học của nhung hươu khô bao gồm 34% tro thô, 12% nước và 54% chất hữu cơ Thành phần này có sự thay đổi tùy thuộc vào từng loài hươu, độ tuổi của sừng, cũng như là vùng sừng (đỉnh, trên, giữa và gốc) được khảo sát Nhung hươu đang phát triển chứa nhiều loại tế bào khác nhau như nguyên bào sợi, nguyên bào sụn, tế bào sụn, tế bào xương Đỉnh của nhung hươu chứa các tế bào tiền thân trung mô Những tế bào này được chuyển đổi dần thành sụn Sau đó, sụn sẽ chuyển thành xương dưới tác động của testosterone Sự vôi hóa này diễn ra một cách tự nhiên trong suốt quá trình tạo sừng Ngoài ra, nhung hươu còn chứa những hợp chất có hoạt tính sinh học như collagen, glycosaminoglycan (GAG), polysacharide, các

Trang 14

hormon tăng trưởng (insulin – like growth factor – 1 & 2), prostaglandin Đây đều là những hợp chất quý, thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu

1.1.4 Một số tác dụng dược lý của nhung hươu

Nhung hươu đã được dân gian sử dụng từ rất lâu Trong Đông y, nhung hươu được coi là vị thuốc bổ dùng trong các trường hợp mệt nhọc, thần kinh suy nhược, mụn nhọt độc, làm điều hòa huyết mạch, chữa khớp xương bị sưng phù Khoảng những năm

40 của thế kỷ XX, các nhà nghiên cứu phương Tây cũng bắt đầu công cuộc tìm hiểu công dụng của nhung hươu Mặc dù các cơ chế sinh học của những công dụng này vẫn chưa được giải thích một cách rõ ràng, nhưng bước đầu có thể thấy rằng nhung hươu

có nhiều công dụng quý đối với sức khỏe con người

1.1.4.1 Tác dụng đối với bệnh viêm xương khớp

Viêm xương khớp là bệnh của mô sụn Bệnh xuất hiện cùng với các triệu chứng: hàm lượng proteoglycans giảm, sụn bị hư hại, nền sụn và xương bị thoái hóa Các peptide glycosaminoglycan có thể ngăn chặn sự mất sụn và xương thông qua việc bổ sung proteoglycan cho cơ thể Vì vậy, khi chỉ định liệu pháp điều trị cho bệnh xương khớp, glucosamine sulfate (GS) hay GAG khác – đặc biệt là chondroitin sulfate (CS) – được thêm vào bên cạnh các thuốc giảm đau và tác nhân kháng viêm Tuy chưa xác định được cơ chế nhưng nhung hươu – một sản phẩm có chứa cả GS và CS – sẽ là một giải pháp thích hợp cho bệnh viêm xương khớp

1.1.4.2 Tác dụng đối với các bệnh thấp khớp

Ở bệnh thấp khớp, màng hoạt dịch của nhiều khớp xương bị viêm, nguyên bào sợi trong màng hoạt dịch tràn ra làm hư hại cả sụn và xương Ngoài ra, các tế bào T hỗ trợ cũng làm tăng đáp ứng viêm Tế bào T hỗ trợ bị ức chế bởi interleukin (IL) 4, IL –

b, và nhân tố tăng trưởng biến đổi beta (TGF – beta) Nhưng khi có mặt của kháng nguyên phù hợp, tế bào T hỗ trợ lại tăng tiết và tích lũy các nhân tố ức chế Như là một kháng nguyên, collagen type II thành công trong việc kháng lại bệnh viêm khớp dạng

Trang 15

thấp Vì thế, nhung hươu – một nguồn collagen type II quan trọng – có thể được sử dụng để điều trị bệnh thấp khớp

1.1.4.4 Tác dụng làm giảm huyết áp

Theo những nghiên cứu đã công bố, các sản phẩm nhung hươu có tác dụng làm giảm huyết áp Tuy nhiên, mỗi sản phẩm lại có tác động khác nhau phụ thuộc vào quy trình chế tạo ra sản phẩm đó Nhưng nhìn chung, các nhà nghiên cứu đều đồng ý rằng chính phức hợp cholin là tác nhân làm giảm huyết áp

1.1.4.5 Tác dụng chống sốc

Theo kết quả nghiên cứu của Kang, sau khi bị đặt ở nhiệt độ khắc nghiệt và bị sốc điện, chuột được cho ăn nhung hươu có thời gian hồi phục nhanh hơn so với con đối chứng Sự thoái biến của tuyến ức và chứng phì đại của tuyến thượng thận do tác động của stress cũng được ngăn chặn nếu các đối tượng thí nghiệm được cho ăn nhung hươu Ngoài ra, nhung hươu còn có nhiều tác dụng về mặt sinh lý như kháng loét, kháng nhiễm độc, giảm hàm lượng cholesterol, điều trị các bệnh viêm gan và thận, gia tăng quá trình sản sinh hồng cầu, giảm sự phát triển của khối u, tăng tỉ lệ sống sót của đối tượng ung thư, chống lại sự lão hóa…

1.2 Khái quát về tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa của cơ thể Những tế bào này có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng riêng biệt

Trang 16

Khác với các loại tế bào khác của cơ thể, tất cả các tế bào gốc nói chung đều có hai đặc điểm:

 Tự làm mới (self – renewal): có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân bào mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa

 Tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): có khả năng biệt hóa thành bất

kỳ loại tế bào trưởng thành nào

Tuy nhiên, trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với tế bào gốc toàn năng hoặc vạn năng Các tế bào gốc đa năng hay tế bào tiền thân chỉ có thể giới hạn biệt hóa thành một số loại tế bào trưởng thành nhất định

Một số động vật bậc thấp có thể tái sinh một phần cơ thể bị mất thông qua sự khử biệt hóa các tế bào đã chuyên hóa thành các tế bào tiền thân Những tế bào vừa được khử biệt hóa này sẽ tăng sinh và hình thành các tế bào chuyên hóa mới của cơ quan tái sinh Tuy nhiên, hầu hết các hoạt động sửa chữa mô ở động vật có vú được thực hiện là

do sự biệt hóa của tế bào gốc thành các tế bào chức năng chứ không phải do sự khử biệt hóa Do đó, động vật có vú chỉ có thể sửa chữa những tổn thương nhỏ xảy ra cục

bộ ở mô hay cơ quan, không thể tái sinh những phần lớn cơ thể bị mất

1.3 Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu và tiềm năng ứng dụng

1.3.1 Thế giới

Bên cạnh các hoạt chất quý, nhung hươu còn được các nhà khoa học chú ý do hiện tượng tái sinh đặc biệt của chúng – hiện tượng tái sinh duy nhất xuất hiện ở động vật có vú Ở một số loài hươu, nhung có thể phát triển thêm 2 cm mỗi ngày Do vậy, nhiều nhà nghiên cứu cho rằng đây là một quá trình được điều hòa bởi tế bào gốc Tuy nhiên, cơ chế của nó vẫn chưa được hiểu rõ Các nghiên cứu về tế bào gốc nhung hươu bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào được thu nhận từ vùng mô đang tăng sinh, khảo sát tác động của các nhân tố tăng trưởng lên sự phát triển của các tế bào này trong điều

kiện in vitro Bên cạnh đó, các nghiên cứu mô học của nhung hươu được tiến hành để

từ đó tìm ra và đánh dấu những vùng chứa các tế bào có vai trò điều hòa quá trình tăng

Trang 17

sinh Tiếp theo, các tế bào tiềm năng sẽ được thu nhận và tiến hành đánh giá tính gốc Cuối cùng là việc khảo sát vai trò của tế bào gốc trong sự tăng sinh cũng như tái sinh của nhung hươu Việc xác định được cơ chế của sự tái sinh sẽ mang lại một ý nghĩa hết sức to lớn cho lĩnh vực y học phục hồi nói chung Khởi đầu cho các nghiên cứu này, năm 1994, hai nhóm nghiên cứu do Sadighi M và do Price J.S đứng đầu đã chứng minh rằng IGF – I và IGF – II có tác động định hướng đến sự phát triển các tế bào

nhung hươu nuôi cấy in vitro Trong khi đó, các nhân tố này cũng thể hiện chức năng điều khiển sự phát triển in vivo của nhung hươu Năm 2001, Allen S.P và cộng sự tìm

thấy vai trò của retinoic acid đối với sự biệt hóa tế bào để hình thành xương trong quá trình tái sinh của sừng hươu [1] Các tác giả này cho rằng có ba receptor (α, β, γ) cho

cả RAR (retinoic acid receptor) và RXR (retinoid X receptor) được biểu hiện ở các phần khác nhau trong quá trình phát triển của nhung, như trong sụn và phần đã hóa xương Năm 2003, khi nghiên cứu hoạt động phân bào trong nhung hươu đang phát triển, Matich J và các cộng sự thấy rằng hoạt động phân bào của các tế bào mỡ và xương thường diễn ra ở vùng ngoại vi hơn là trung tâm của lõi xương Trong khi đó, sự phát triển của biểu bì hầu như chỉ xảy ra ở phần đỉnh Và để phục vụ cho những nghiên cứu này, Li C và Suttie J.M đã đưa ra các phương pháp thu nhận mô nhung hươu [20] Theo đó, mô nhung hươu được chia làm ba phần chính: thân, mầm và trung tâm phát triển Mỗi phần trên được thu nhận theo một cách khác nhau

Hình 1.1 Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu

Trang 18

(S – da – skin, P – màng sụn – perichondrium, B – xương xốp – spongy bone, C – sụn chưa bị khoáng hóa – non – mineralised cartilage, MC – sụn đang bị khoáng)

Năm 2006, Clark D.E và cộng sự nghiên cứu sự hình thành mạch trong quá trình phát triển của nhung hươu Với tốc độ tăng trưởng có thể đạt tới 2 cm mỗi ngày, việc phát triển cùng lúc của các mạch trong thời gian này là một điều hết sức thú vị Dựa vào hình thái của các mạch được quan sát, các tác giả này cho rằng, sự hình thành mạch là do sự kéo dài của các mạch đã có sẵn hay sự đâm chồi để phát sinh các bó mạch nhỏ

Tiếp theo, các nghiên cứu về mặt mô học của nhung hươu đã được tiến hành Năm 2003, Kierdorf U và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu mô học của sự hình thành xương trong sự phục hồi của cuống xương và giai đoạn sớm của sự tái sinh [15] Theo đó, thành phần xương của phần phụ sọ tái sinh của hươu có nguồn gốc từ màng xương cuống Dựa vào sự khám phá trên các hệ xương khác, họ cho rằng tế bào gốc – các tế bào có liên quan đến sự biệt hóa tạo xương và sụn – có mặt ở vùng màng xương cuống này Và những nghiên cứu của các nhóm tác giả khác như nhóm Li C và Suttie J.M., nhóm Kierdorf U và Kierdorf H., nhóm Li C.… cũng cho kết quả tương tự Kế

đó, năm 2007, Kierdorf U và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về sự tái sinh của sừng hươu [16] Theo các tác giả này, sự thay thế theo chu kỳ của sừng hươu là một hiện tượng tái sinh khác thường ở động vật có vú, loài không có khả năng tái sinh lại những phần cơ thể đã mất Trước đây, sự tái sinh của sừng hươu được cho là một quá trình tái sinh các

bộ phận bị mất giống với sự tái sinh các chi ở lưỡng cư - sự phản biệt hóa Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây lại cho thấy không giống như sự tái sinh các phần đã mất ở lưỡng cư, sự tái sinh ở sừng hươu liên quan đến sự biệt hóa tế bào Nghiên cứu này cho rằng sự tái sinh sừng hươu là một hiện tượng dựa vào tế bào gốc, và phụ thuộc vào sự hoạt động theo chu kỳ của các tế bào gốc nằm trong màng xương của cuống Cũng trong năm 2007, Berg D.K và cộng sự đã tiến hành nhân bản hươu đỏ từ tế bào gốc nhung hươu và các tế bào con cháu của chúng Dòng tế bào cho được phân lập từ màng xương cuống, các tế bào này (antlerogenic periosteum – AP) là chưa biệt hóa hay đã

Trang 19

được cảm ứng bằng hóa chất thành tế bào tạo xương hay tạo mỡ Và họ thấy rằng, không có sự khác biệt của phôi khi dùng các loại tế bào khác nhau để chuyển nhân [4] Cuối cùng, năm 2008, Rolf H.J và cộng sự tại trường Đại học Goettingen (Goettingen, Đức) đã đưa ra những bằng chứng quan trọng về sự tồn tại của các tế bào gốc nhung hươu [25] Theo đó, họ tìm thấy sự hiện diện của các tế bào dương tính với marker tế bào gốc trung mô STRO – 1 trong các vùng khác nhau của sừng tái sinh và nguyên phát cũng như trong cuống của sừng hươu Phân tích FACS chứng minh nuôi cấy tế bào sơ cấp từ màng xương cuống hươu đực thu được quần thể tế bào dương tính với STRO – 1, CD271, CD133 Kết quả nghiên cứu mà nhóm Rolf H.J và cộng sự thu được hoàn toàn phù hợp với giả thuyết sự tái sinh sừng được xây dựng từ các tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân trung mô nằm ở lớp trong màng xương của sừng Các tác giả này cho rằng ổ tế bào gốc nằm ở lớp trong màng xương của sừng và sự tái sinh sừng phụ thuộc vào sự hoạt động có tính chu kỳ của các tế bào gốc đó Trong cuống sừng, các tế bào STRO – 1+ cũng luôn nằm cạnh các sợi mô cơ (mô cơ xương trán) Trong quá trình tái sinh sừng, các tế bào STRO – 1+ được tìm thấy trong nội mô mạch và màng xương, trong mô dưới da của cuống và cả trong vùng sụn Bên cạnh đó, nhuộm hóa mô miễn dịch cũng thấy các tế bào dương tính với marker tế bào gốc CD271 cũng nằm ở các vị trí tương tự trong sừng đang tái sinh CD271, thụ thể nhân tố tăng trưởng thần kinh ái lực yếu (LNGFR), là marker chung trong phân lập tế bào gốc trung mô trực tiếp từ dịch tủy xương Đến nay, chức năng của LNGFR trong tế bào tiền thân trung mô vẫn chưa được làm rõ, nhưng nó có thể đóng vai trò đặc trưng hình thái trong quá trình phát triển của khoang tủy xương người và các cơ quan khác Nhuộm kép STRO – 1 và CD271 cho thấy các tế bào trong màng xương sừng hươu có thể dương tính với cả hai marker

Trang 20

Hình 1.2 Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của cuống [25] (a) mẫu cuống (hình (b) và (c)) được cố định bằng Methylmetacrylate, nhuộm HE, E (biểu mô), D (chân bì), SC (mô bề mặt dưới da – dấu hoa thị), Mf (phần mô cơ xương trán), Fa (mô bị xé mỏng trong suốt quá trình mô học), CP (lớp trong màng xương), B (xương cuống); (b) cuống trái và nhung nguyên phát của con đực hoang dại một năm tuổi (Dama dama), sừng được cắt dưới khúc lồi để thu nhận cuống; (c) mặt cắt của

Trang 21

cuống ở trong hình (b), hình chữ nhật trắng đánh dấu vùng chỉ ra trong hình (a); đối với các hình d – m: kháng thể STRO – 1 kết hợp với kháng thể thứ cấp chuột IgM gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, nhuộm nhân với Hoechst 33342; (d, e) các tế bào STRO – 1+ trong lớp lưới của chân bì, định vị trong các sợi collagen dày; (d) chỉ tế bào STRO – 1+ phát huỳnh quang, (f) kiểm soát âm, tương tự như trong (e), các đốm xanh nhỏ là hồng cầu được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang; (g) các tế bào STRO – 1+ liên kết với thành mạch trong mô dưới da; (h) kiểm soát âm giống trong (g); (i – k) các

tế bào STRO – 1+ giữa các sợi của mô cơ trán; (i) nhuộm huỳnh quang kết hợp với kháng thể thứ cấp; (j) chỉ tế bào STRO – 1+ phát huỳnh quang, giống trong (i); (k) kiểm soát âm tương tự trong (i); (l) các tế bào STRO – 1+ trong lớp trong màng xương; (m) kiểm soát âm, tương tự trong (l)

1.3.2 Việt Nam

Ở Việt Nam, nhung hươu đã được sử dụng từ lâu, chủ yếu dưới dạng lát khô hoặc cao chiết theo kinh nghiệm dân gian Gần đây, một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của nhung hươu đã được thực hiện

Năm 1993, Đái Duy Ban và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần các acid amin tự do trong nhung hươu nuôi bán tự nhiên ở Ba Vì Thông qua việc sử dụng các phương pháp sắc ký và điện di, các tác giả đã bước đầu xác định nhung hươu chứa hơn

17 loại acid amin và có tất cả các loại acid amin thiết yếu

Năm 1996, Phó Đức Thuần và các cộng sự chứng minh nhung hươu dạng lát khô

có tác dụng tốt đến hoạt động tim và não của động vật thí nghiệm

Năm 2000, tác giả Quan Vân Hùng đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng bổ huyết của nhung nai trên bệnh nhân ung thư Theo nghiên cứu, tình trạng thiếu máu được cải thiện trên đại đa số bệnh nhân có sử dụng nhung nai, kết quả này phù hợp với kinh nghiệm của y học cổ truyền khi sử dụng nhung nai giải quyết tình trạng thiếu máu

do suy tủy xương Các hoạt chất sinh học trong nhung nai đã kích thích tủy xương bị suy yếu vì nhiễm độc hóa chất tái hoạt động để sản xuất hồng cầu một cách nhanh chóng Hầu hết bệnh nhân có sử dụng nhung nai cảm thấy khỏe hơn, các rối loạn chức

Trang 22

năng liên quan đến thiếu máu và việc ăn ngủ được cải thiện, đặc biệt là chưa phát hiện tác dụng phụ

Mặc dù ở nước ta nhung hươu đã được sử dụng từ lâu đời, và đây là nguồn tài nguyên quý hiếm, nhưng cho đến nay việc nghiên cứu chuyên sâu tế bào nhung hươu đặc biệt là tế bào gốc nhung hươu để hiểu rõ hơn về nhung hươu nhằm nâng cao khả năng ứng dụng còn khả mới mẻ và chưa được quan tâm đúng mức

1.4 Tính cấp thiết của đề tài

Khi chất lượng cuộc sống được nâng cao, nhu cầu về dinh dưỡng của con người cũng thay đổi Ngày nay, con người mong muốn thực phẩm không chỉ đảm bảo đủ calo, ngon, sạch, mà còn phải chứa các hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khỏe và sắc đẹp Bên cạnh đó, thực phẩm cũng được yêu cầu phải mang lại cho người sử dụng khả năng miễn dịch cao, chống sự lão hóa, tăng tuổi thọ, giúp phòng ngừa được một số bệnh, kể cả ung thư Vì vậy, thực phẩm chức năng – loại thực phẩm bổ sung các hoạt chất có tác dụng như là những vị thuốc quý, giúp con người bồi bổ sức khỏe, phòng ngừa bệnh tật – ngày càng được quan tâm và sử dụng rộng rãi

Nhung hươu là một vị thuốc quý, đã được dân gian sử dụng từ rất lâu đời Các hoạt chất thu nhận từ nhung hươu cho thấy một tiềm năng to lớn trong việc cải thiện và bồi bổ sức khỏe Vì vậy, nhung hươu được xem như là một nguyên liệu đầy hứa hẹn

dùng để chế biến thực phẩm chức năng Tuy nhiên, những nghiên cứu in vitro về thành

phần và công dụng của nhung hươu vẫn chưa được thực hiện nhiều Ở Việt Nam, đây

là một lĩnh vực hoàn toàn mới Vì vậy, sự thành công của đề tài đặc biệt rất có ý nghĩa trong lĩnh vực thực phẩm chức năng

1.5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học thực tiễn

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, nhung hươu chứa một loạt những hoạt chất sinh học quý như: proteoglycan, parathyroid hormone – related peptide (PTHrP), glycosaminoglycan, collagen, hormone tăng trưởng, nhân tố tăng trưởng, chất chống oxi hóa… Đặc biệt, năm 2008, Hans J Rolf và cộng sự tại trường đại học Goettingen (Đức) đã thu nhận thành công các tế bào giống tế bào gốc từ nhung

Trang 23

hươu Điều này mở ra một tiềm năng ứng dụng mới, đó là: có thể thu nhận, nuôi cấy và tạo ra số lượng lớn các tế bào gốc nhung hươu trong phòng thí nghiệm để thu nhận các hoạt chất sinh học quý thay cho phương thức nuôi hươu truyền thống như hiện nay Việc này sẽ giúp tiết kiệm được rất nhiều tiền của, thời gian và bảo vệ môi trường sống

Bên cạnh đó, các nghiên cứu mới đây còn chứng minh quá trình tái sinh hằng năm của nhung hươu - một loài động vật hữu nhũ - có thể phụ thuộc vào sự hoạt động tuần hoàn của các tế bào gốc trung mô nằm trong màng xương cuống Kết quả này cũng cho thấy sự tái sinh các mô và nhiều phần phụ khác trong động vật hữu nhũ là một quá trình dựa trên tế bào gốc Do đó, việc nghiên cứu tế bào nhung hươu sẽ mang lại một ý nghĩa to lớn trong lĩnh vực y học phục hồi

Trang 24

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu mô nhung hươu sao (lộc nhung) thu nhận từ Trại chăn nuôi hươu sao Trường Thịnh, Xã Phước Tân, Huyện Long Thành, Tỉnh Đồng Nai (hình 2.2) Sau đó, mẫu mô được chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để xử lý sơ bộ

2.1.2 Tiến trình nghiên cứu

Mô nhung hươu tươi

Đông lạnh

Xác định tính gốc của tế bào nhung hươu

1 Thu nhận tế bào đơn

2 Nuôi sơ cấp

3 Cấy chuyền tăng sinh

Phân tích dựa trên kiểu hình

Phân tích dựa trên khả năng tăng sinh

Phân tích dựa trên khả năng biệt hóa

Trang 25

Hình 2.1 Sơ đồ mô tả các nội dung nghiên cứu

Hình 2.2 Mẫu mô nhung hươu sao

2.2 Dụng cụ và thiết bị

Bảng 2.1 Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã thiết bị

Trang 26

Bể ổn nhiệt Memmert WB10

2.3 Hóa chất

Bảng 2.3 Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài

3 – isobutyl – 1 – methylxanthine (IBMX) Sigma I5879

Trang 27

Dexamethasone Sigma D8893

Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium/Ham’s Nutrient Mixture F12

Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14185 – 052

L – ascorbic acid 2 – phosphate (AsAP) Sigma 49752

Công thức pha trộn các hóa chất sử dụng trong đề tài:

 Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline)

Trang 29

 Môi trường biệt hóa mỡ

100 ml môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và bổ sung thêm:

3 – isobutyl – 1 – methylxanthine 0,5 µM

 Môi trường biệt hóa xương

100 ml môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và bổ sung thêm:

Trộn đều, chuẩn pH 4,1 – 4,3 với NH4Cl 10%

 Công thức pha thuốc nhuộm Oil Red Solution

Trang 30

 Môi trường đông lạnh

2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu

Nhung hươu được thu nhận tại Trại chăn nuôi hươu Trường Thịnh, Đồng Nai Sau khi bị cắt rời khỏi cơ thể con vật, nhung hươu được đặt vào hộp thu mẫu

 Khối nhung được bảo quản lạnh trong đá gel và nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm

 Tại phòng thí nghiệm, phần ngọn – vùng tăng trưởng tạo sụn – của nhung được thu nhận (hình 2.3) và khử trùng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo

Hình 2.3 Phần ngọn của nhung hươu

Trang 31

2.4.2 Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu

Phần ngọn nhung hươu thu nhận ở mục 2.4.1 được đông lạnh một phần theo quy trình ở hình 2.4, phần còn lại sẽ dùng để tách tế bào đơn theo quy trình ở hình 2.5 Mẫu

mô nhung hươu đông lạnh sẽ được giải đông và tiến hành thu nhận tế bào đơn để nuôi cấy giống như thao tác đối với mẫu mô nhung hươu tươi

Phần ngọn nhung hươu

Cắt thành miếng nhỏ có kích thước 2 – 4 mm2

Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)

Bổ sung môi trường đông lạnh (Môi trường DMEM/F12 có bổ sung 30% FBS và 10%

DMSO)

Cho hỗn hợp vào cryotube

Đông lạnh mẫu ở -80 oC

Hình 2.4 Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu

Miếng nhỏ nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2

Trang 32

Ủ mẫu với Trysin – EDTA 0,25% trong 15 phút ở 37 oC

Mẫu được phân tách với collagen loại I 0,25% trong vòng 2

giờ (vortex mẫu sau mỗi 20 phút)

Lọc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ 70 µm

Ly tâm dịch lọc (3.000 vòng/ phút, 10 phút)

Huyền phù cặn tế bào trong môi trường DMEM/F12 10% FBS

Hình 2.5 Quy trình thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu

2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn nhung hươu thu nhận được ở mục 2.4.2 sẽ được tiến hành nuôi cấy theo quy trình ở hình 2.6

Trang 33

Đếm số lượng tế bào, đưa về mật độ 2.105 tế bào/ml

Hình 2.6 Quy trình nuôi cấy tế bào đơn 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền

2.4.4.1 Quy trình cấy chuyền tế bào

Khi mật độ tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, quy trình cấy chuyền (hình 2.7) được thực hiện để cung cấp không gian cũng như chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng của tế bào

Tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy

Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ

Tráng bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch HBSS hai lần

Cho dung dịch Trypsin – EDTA 0,25% vào , ủ ở 37 oC, 5% CO2

Cho dịch huyền phù vào flask T25, nuôi ở 37 oC, 5% CO2

Theo dõi sự phát triển của tế bào, thay môi trường sau mỗi 48 giờ

Trang 34

Bổ sung môi trường DMEM/F12 10% FBS, huyền phù tế bào

Ly tâm dịch tế bào huyền phù (3.000 vòng/phút, 10 phút)

Loại bỏ dịch nổi, thêm môi trường DMEM/F12 10% FBS và

huyền phù

Đếm tế bào và điều chỉnh về mật độ 1.104 – 1.106 tế bào/ml

Chuyển huyền phù tế bào vào flask T25, nuôi ở 37 oC, 5% CO2

Theo dõi sự phát triển của tế bào, thay môi trường sau mỗi 48 giờ

Hình 2.7 Quy trình cấy chuyền tế bào

2.4.4.2 Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam)

Phần mềm xCELLLigence hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự thay đổi trạng thái sinh lý tế bào thông qua các tín hiệu điện được đo bởi các vi mạch cảm ứng khảm ở đáy một đĩa nuôi 96 giếng Các tín hiệu này sẽ được chuyển qua một máy tính

để phân tích và đánh giá kết quả

2.4.5 Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc

2.4.5.1 Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới

Trang 35

Tế bào nhung hươu được nuôi cấy dài hạn để kiểm tra số lần phân bào mà các tế bào này có thể thực hiện được trong suốt thời gian nuôi cấy

2.4.5.2 Kiểm chứng khả năng biệt hóa

 Quy trình biệt hóa tế bào: Theo nghiên cứu của Lee O.K và cộng sự (2004),

các tế bào gốc trung mô có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào xương, sụn, mỡ… nếu chúng được cảm ứng trong các môi trường nuôi thích hợp (theo quy trình ở hình 2.8) Thông thường, kết quả biệt hóa sẽ được đánh giá sau 21 ngày nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa tương ứng

Mẫu tế bào nuôi

Loại môi trường cũ

Rửa tế bào bằng HBSS

Bổ sung môi trường biệt hóa, nuôi ở 37 oC, 5% CO2

Nhuộm tế bào và kiểm tra kết quả biệt hóa

Hình 2.8 Quy trình biệt hóa tế bào

 Biệt hóa thành tế bào tạo xương

Sự tiếp xúc một thời gian dài của các tế bào gốc trung mô với một hỗn hợp môi trường nuôi có bổ sung dexamethasone, L – ascorbic acid 2 – phosphate và β – glycerol phosphate cho kết quả là sự tích tụ của calcium trong tế bào chất và chất nền

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	3,21 MB