Hợp tác nghiên cứu xây dựng qui trình tạo khối sâm Ngọc Linh làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phục vụ sức khoẻ cộng đồng

Khác với nuôi cấy mô, công nghệ SKTB thực vật không nuôi cấy tạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi vô tính các dòng tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm có thể sự dụng cho chiết tách các ho

HỌC VIỆN QUÂN Y

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH TẠO KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHỤC VỤ

PGS.TS Nguyễn Văn Minh

5 TS Lê Văn Đông

6 TS Nguyễn Văn Long

7 TS Vũ Bình Dương

8 BS Nguyễn Hoàng Ngân

9 ThS Đào Văn Đôn

III CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP NGHIÊN CỨU:

1 Trường Đại học Ajou – Hàn Quốc

2 Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

3 Viện Dược liệu

4 Trung tâm NCƯD Sinh – Y – Dược học – HVQY

5 Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Dược – HVQY

6 Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh lý – Bệnh viên 103 – HVQY

1.1.4 Yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất 5

1.1.6 Tình hình ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật cho các loài

3.1.1 Nuôi cấy tạo callus 663.1.2 Phương pháp duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch 693.1.3 Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng 733.1.4 Kết quả tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 78

3.1.8 Kết quả nghiên cứu bào chế cao đặc (5 :1) từ sâm Ngọc Linh sinh khối 92

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU CHUẨN

CƠ SỞ

94

3.2.2 Kết quả xác định thành phần hoạt chất chính của sâm Ngọc Linh sinh

khối

96

3.3 TÍNH AN TOÀN VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG CỦA SÂM NGỌC LINH

PHỤ LỤC

BC Bạch cầu CNT Chuột nhắt trắng CCT Chuột cống trắng DĐVN Dược điển Việt Nam

Hb Hemoglobin

HC Hồng cầu HST Huyết sắc tố HVQY Học viện Quân y

LD50 Liều chết 50% động vật thí nghiệm NMSL Nước muối sinh lý

MDA Acid Malonyl Dialdehyd POL Peroxid hóa lipid

SD Độ lệch chuẩn (standard deviation) SLVK Số lượng vi khuẩn

SKTB SKTB SGOT Serum glutamo-oxalo transaminase SGPT Serum glutamo-pyruvic transaminase SNL Sâm Ngọc Linh

TLCT Trọng lượng cơ thể TKTW Thần kinh trung ương TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

TC Tiểu cầu

VK Vi khuẩn

2.1 Ký hiệu và mức của biến đầu vào 292.2 Ký hiệu và mức yêu cầu của biến đầu ra 302.3 Chương trình pha động 362.4 Sơ đồ chuẩn bị các giếng đo xác định hoạt độ SOD 57

3.1 Kết quả tạo thành callus sau 35 ngày nuôi cấy 663.2 Khối lượng callus trong các môi trường khác nhau 673.3 Tốc độ tăng trưởng callus sâm theo thời gian 673.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự hình thành

callus

68

3.5 Đặc tính tế bào sau các lần cấy chuyển 693.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 713.7 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự sinh trưởng tế bào sâm 723.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ phòng nuôi cấy đến tốc độ phát triển tế

bào

73

3.9 Tốc độ phát triển tế bào sâm Ngọc Linh trên môi trường lỏng 743.10 Tốc độ phát triển tế bào sau các lần cấy chuyển 753.11 Ảnh hưởng của pH môi trường 763.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 773.13 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng 773.14 Kết quả nuôi cấy tế bào sâm theo thiết kế phần mềm 793.15 Ảnh hưởng của biến đầu vào với biến đầu ra 803.16 Kết quả nuôi cấy tế bào SNL trên môi trường tối ưu 83

3.18 Kết quả lựa chọn nồng độ acid jasmonic 85

3.22 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor 15 lit 883.23 Hàm lượng 1-NAA tồn dư và hoạt chất trong SNL sinh khối 893.24 Hàm lượng 1-NAA tồn dư và hoạt chất trong SNL sinh khối 893.25 Kết quả phân tích chất tồn dư 1-NAA và hoạt chất trong các

mẻ nuôi cấy SNL sinh khối

91

3.26 Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ 1-NAA 943.27 Nồng độ 1-NAA trong mẫu SNL sinh khối 953.28 Hàm lượng saponin toàn phần trong sinh khối sâm 983.29 Sự phụ thuộc của diện tích píc và nồng độ các ginsenosid 993.30 Hàm lượng Rb1, Rg1 và Rd trong mẫu sâm sinh khối 1003.31 Hàm lượng saponin toàn phần trong SNL tự nhiên 1033.32 Hàm lượng Rb1, Rg1 và Rd trong mẫu sâm sinh khối 1043.33 Chương trình pha động định lượng Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd 1073.34 Kết quả xác định độ ẩm trong SNL sinh khối 1103.35 Kết quả xác định tro toàn phần có trong SNL sinh khối 1103.36 Chương trình pha động định lượng các ginsenosid 1133.37 Hàm lượng Rb1, Rg1 và Rd trong mẫu sâm sinh khối 1163.38 Kết quả đo độ nhiễm khuẩn của cao đặc sâm SNL sinh khối 1173.39 Chương trình pha động định lượng các ginsenosid trong cao

đặc SNL sinh khối

120

3.40 Độc tính cấp SNL sinh khối theo đường uống 1223.41 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với TLCT thỏ 1233.42 Điện tim của thỏ ở đạo trình DII (n = 8) 1243.43 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với số lượng HC thỏ 1253.44 Ảnh hưởng SNL sinh khối đối với HST thỏ 1263.45 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với số lượng BC thỏ 1273.46 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với số lượng TC thỏ 1283.47 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với hoạt độ SGOT của thỏ 129

3.50 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với ure máu thỏ 1323.51 Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan thỏ 1333.52 KÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ m« bÖnh häc cña thËn thá 1343.53 KÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ m« bÖnh häc cña l¸ch thá 1343.54 Thời gian bơi của chuột thí nghiệm 1373.55 Thời gian bám rotarod của chuột sau 60 phút thử thuốc 1383.56 Thời gian bám rotarod của chuột sau 2 tuần thử thuốc 1393.57 Sức cơ chân chuột ở các lô nghiên cứu 1403.58 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đến trọng lượng chuột 1403.59 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện tìm thức ăn trong mê lộ

của các lô chuột nghiên cứu (n = 8)

142

3.60 Tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện tìm thức ăn trong mê lộ của

chuột nhắt trắng các lô nghiên cứu (n=8)

3.77 Khối l−ợng u hạt ở các lô nghiên cứu 1623.78 Ngưỡng đau bàn chõn chuột bị gõy viờm cấp 163

DANH MỤC CÁC HèNH

1.1 Qui trỡnh tạo sinh khối tế bào thực vật 61.2 Đường cong phỏt triển của tế bào thực vật 121.3 Sõm Ngọc Linh (Panax vietnamenesis) 171.4 Cấu trỳc húa học cỏc saponin chớnh trong sõm Ngọc Linh 192.1 Thiết bị Rota-Rod Cat No 47600, Ugo Basile 432.2 Grip strength meter, Cat No 47106, Ugo Basile 44

2.5 Bảng đục lỗ Hole Board Cat No 6650, Ugo Basile 482.6 Máy đo phản xạ tự động có điều kiện Automatic Reflex

Conditioner Cat No 7530, Ugo Basile 492.7 Hỡnh 2.7 Plethysmometer Cat No.7140, Ugo Basile 632.8 Paw Pressure Analgesy Meter Cat No 37215 , Ugo Basile 65

3.2 Callus SNL sau cỏc lần cấy chuyển trờn mụi trường thạch 703.3 Tế bàoSNL trờn mụi trường thạch (A); trong mụi trường lỏng (B) 743.4 Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu thử 5 ng/ml (b) 963.5 Sắc ký đồ của mẫu SNL tự nhiờn (a) và SNL sinh khối (b) 973.6 Sắc ký đồ HPLC của cỏc ginsenosid chuẩn (a) và SNL sinh khối (b) 97

3.10 Sắc ký đồ của mẫu SNL tự nhiên (b) và cao đặc SNL sinh khối (a) 1153.11 Sắc ký đồ HPLC của ginsenosid chuẩn (a) và cao đặc SNL sinh khối

3.12 Hình ảnh gan thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 1353.13 Hình ảnh mô bệnh học thận thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 1353.14 Hình ảnh lách thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 1353.15 H×nh ¶nh đại thể cña gan ë c¸c l« chuét nghiªn cøu 1573.16 Hình ảnh mô bệnh học gan chuột nghiên cứu (HE, 100X) 158

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

3.1 Ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến tốc độ phát triển của tế bào 803.2 Ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến lượng saponin trong tế

3.3 Sự thay đổi hàm lượng 1-NAA và hoạt chất ginsenosid qua các lần rửa 893.4 Tương quan nồng độ 1-NAA và diện tích píc 953.5 Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Rg1, Rb1 và Rd 99

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

3.1 Sơ đồ quy trình thu hoạch SNL sinh khối 903.2 Quy trình chiết xuất siêu âm cao SNL sinh khối 923.3 Sơ đồ xử lý dịch chiết và hoàn thiện cao SNL sinh khối 93

Trải qua nhiều năm phối hợp nghiên cứu cả ở trong nước và ngoài nước, Sâm Ngọc Linh đã được xác định tương đối toàn diện về thành phần hoá học

và dược học Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự, Sâm Ngọc Linh có 52 hoạt chất saponin được, trong đó có 26 loại saponin mới không có ở các loài sâm khác cùng chi Sâm Ngọc Linh có nhiều tác dụng dược lý: tác dụng bổ dưỡng, tăng lực, cải thiện trí nhớ, cải thiện năng lực tâm thần kinh, tăng cường hưng phấn vỏ đại não, cải thiện tính linh hoạt của hoạt động thần kinh, kích thích miễn dịch, chống stress và chống trầm cảm, chống stress oxy hóa và lão hóa, bảo vệ gan, tác dụng chống viêm, điều hòa huyết áp, hạ lipid máu, dự phòng

xơ vữa động mạch, thu nhỏ ổ loét dạ dày tá tràng, tăng cường chức năng sinh dục,

Sâm Ngọc Linh là cây thuốc có giá trị, nên đã bị khai thác kiệt quệ Kết quả các đợt điều tra của Viện Dược liệu ở vùng núi Ngọc Linh, thuộc tỉnh Quảng Nam và Kon Tum, trong những năm gần đây không phát hiện lại được mẫu sâm nào Thực tế này có thể khẳng định, Sâm Ngọc Linh về cơ bản đã bị cạn kiệt trong tự nhiên Chúng chỉ còn lại trong các vườn bảo tồn, vườn giống hoặc mới được trồng thêm tại chỗ ở vùng núi Ngọc Linh Các dự án bảo tồn

và phát triển cây Sâm Ngọc Linh đã được triển khai thực hiện ở các tỉnh Kontum, Quảng Nam Tuy nhiên, công tác bảo tồn, lưu giữ phát triển nguồn gen Sâm Ngọc Linh gặp rất khó khăn Do không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu, một số Xí nghiệp Dược phẩm phải ngừng sản xuất 3 chế phẩm từ Sâm Ngọc Linh là tinh sâm nước, tinh sâm viên, viên ngậm

Trên thế giới, công nghệ sinh khối tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng dãi, tạo ra những sản phẩm có giá trị cao, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp, vừa tạo ra nguyên liệu vừa giúp phát triển và bảo tồn nguồn gen quí hiếm Chính vì vậy, sinh khối tế bào thực vật đang ngày càng được quan tâm,

đầu tư phát triển Đặc biệt, công nghệ này đã được sử dụng tạo khối tế bào nhân sâm Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc để bào chế các sản phẩm bổ duưng, phòng chống các bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm, Hàn Quốc có khoảng trên

70 sản phẩm về nhân sâm bán trên thị trường, trong số đó, rất nhiều là sản phẩm của sinh khối tế bào nhân sâm

Đứng trước tình hình trên, bên cạnh việc đầu tư tổ chức quy hoạch, trồng

và bảo tồn Sâm Ngọc Linh, một vấn đề cấp thiết đặt ra, cần phải phát triển công nghệ sinh khối tế bào Sâm Ngọc Linh tạo nguồn hoạt chất ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc, mỹ phẩm, Đây là một hướng đi cấp bách và phù hợp với xu hướng phát triển công nghệ sinh khối tế bào thực vật của nhiều nước trên thế giới để sản xuất hoạt chất nguồn gốc thực vật

Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện Quân y đang hợp tác với Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Sinh học, Trường Đại học Tổng hợp Ajou, Hàn Quốc đang triển khai nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào Sâm Ngọc Linh Trong quá trình tiến hành đề tài này, việc đánh giá tác dụng dược lý của Sâm Ngọc Linh sinh khối có so sánh với Sâm Ngọc Linh tự nhiên là nhiệm vụ quan trọng

Ch−¬ng 1 TỔNG QUAN 1.1 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1.1 Khái niệm

Sinh khối tế bào (SKTB) thực vật là kỹ thuật nuôi cấy, duy trì, tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn mà không thâm canh gieo trồng Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ nguyên Nghiên cứu đầu tiên về công nghệ SKTB thực vật được thực hiện vào những năm 20 của thế kỷ XX khi các nhà khoa học đã thành công trong

việc nhân giống vô tính cây Lan (orchid) Tuy nhiên, chỉ tới năm 1962 hai

nhà khoa học Murashige và Skoog tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy thì công nghệ sinh khối mới thật sự mang lại ý nghĩa kinh tế [67] Từ năm

1990 đến nay đã có nhiều sản phẩm nghiên cứu thành công đã áp dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm phục vụ ngành công nghiêp dược phẩm và

thực phẩm như: sản xuất paclitaxel - taxol từ tế bào cây thủy tùng (Taxus sp), sản xuất chất kháng khuẩn Shikonin từ rễ cây Lithospermum erythrorhizon, sản xuất chất làm thơm Vani từ nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia và rất

nhiều các công trình nghiên cứu khác đang được nghiên cứu sản xuất quy mô công nghiệp [67]

Lý thuyết của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng (totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật Các tế bào này khi được đưa vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, chúng có thể phát triển thành một một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dòng tế bào đó Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo ra cây từ đỉnh sinh trưởng được tách ra, cây sau đó nhân nhanh tạo ra nhiều mầm cây con, từ đó có thế kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây, sau đó biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo trồi, tạo rễ và cuối cùng cũng phát triển thành một cây mới hoàn chỉnh [36],[ 51]

Khác với nuôi cấy mô, công nghệ SKTB thực vật không nuôi cấy tạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi vô tính các dòng tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm có thể sự dụng cho chiết tách các hoạt chất Quá trình này cũng bắt đầu

từ việc tạo ra callus từ những tế bào, mô khác nhau của thực vật, sau đó chúng được làm giảm hoặc mất tính biệt hóa [36] và được thuần hóa trên môi trường

dinh dưỡng nhất định, cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống các bình nuôi cấy lớn (các Bioreactor) Trong qúa trình đó đặc tính của tế bào được giữ nguyên như ban đầu, các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với

tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên Trong đó có việc tổng hợp và tích lũy hoạt chất [41]

1.1.2 Ưu và nhược điểm của công nghệ SKTB thực vật

và chất lượng sản phẩm Ngoài ra, còn loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất

- Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ SKTB rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trên môi trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian Tuy nhiên sau khi đã lựa chọn được điệu kiện, môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất 1 mẻ sinh khối thường khoảng

từ 15 – 50 ngày Như vậy nó đã rút ngắn rất nhiều về thời gian so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất Theo Guilk và cs (2006) [45] trong nghiên cứu xây dựng quy trình sinh khối dừa cạn

(Catharanthus roseus) sản xuất alkaloid nhân Indole thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày Trong khi sản xuất sinh khối sâm Hàn Quốc (Panax ginseng C.Mayer.) theo Wu JY và cs (1999) [78] cần thời gian thích hợp cho 1 chu kỳ nuôi cấy trên môi trường lỏng là 14 – 15 ngày

- Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ SKTB thực vật rất

ổn định Do các yếu tố như: nhiệt độ, pH; nồng độ oxy hòa tan, thành phần môi trường, điều kiện chiếu sáng…đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho

tế bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định Vì vậy, sản phẩm thu được

có chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP

- Một trong những ưu điểm nổi bật của công nghệ SKTB thực vật là có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp tạo các hoạt chất cao hơn so với nuôi

trồng ngoài tự nhiên Vì vậy sản phẩm thu được có hàm lượng hoạt chất cao hơn so với nuôi trồng tự nhiên, nên nó rất phù hợp với các dược liệu chứa hoạt chất có hàm lượng thấp hoặc các chất rất khó tổng hợp hóa học được như: taxol, vinblastin, vincristin, shikonin, reserpin…Các kỹ thuật phổ biến

để tăng tích lũy hoạt chất là: dùng các chất kích thích tăng hoạt chất (elicitor); hoặc các tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất (precursor); dùng kĩ thuật nuôi cấy 2 pha (two phase culture); sử dụng nghiệm pháp gen kích hoạt… [48, 41] Các nghiên cứu về SKTB thông đỏ (Taxus sp) cho thấy khi sử

dụng các biện pháp kích thích làm tăng hoạt chất, thì sản phẩm thu được đều

có hàm lượng hoạt chất cao hơn trong cây tự nhiên từ 10 – 15 lần Schulte và

cs (1987) đã thông báo sự tạo thành anthraquinone trong các nuôi cấy tế bào

các chi Asperula, Galium, Rubia và Sherardia (được tối ưu các điều kiện) cao hơn trong cây tự nhiên từ 4-6 lần Đặc biệt hàm lượng anthraquinone cao nhất ở loài Rubia fruticosa lên tới 20% trọng lượng khô cao gấp 20 lần [7 ].

- Đối với các dược liệu qú y hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá thành sản xuất sẽ thấp hơn Lí do là trong thời gian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí nguyên liệu cho nuôi cấy thấp

- Chi phí đầu tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng đối với từng loại tế bào Tuy nhiên, hiện nay ở Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc các nhà khoa học đã thiết kế được các hệ thống Bioreactor từ 10.000 – 50.000 lít dùng cho sản xuất các sản phẩm bằng công nghệ SKTB thực vật

1.1.3 Quy trình lý thuyết tạo sinh khối tế bào thực vật

Quá trình tạo SKTB thực vật thường được tiến hành theo năm giai đoạn

kế tiếp nhau [36],[51] (hình 1.1)

Hình 1.1 Qui trình tạo sinh khối tế bào thực vật

A - Nuôi cấy tạo callus; B - Duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch;

C - Nuôi cấy trong môi trường lỏng; D - Khuếch đại qui mô nuôi cấy;

E - Thu hoạch sinh khối

Giai đoạn 1: Tạo callus

Callus là dòng tế bào đầu, chưa biệt hóa tạo ra trong phòng thí nghiệm, tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây Callus được hình thành từ các mô, các tế bào được tách ra từ cơ thể thực vật nhờ tác động của chất điều tiết sinh trưởng Trong giai đoạn này ngoài thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thì kĩ thuật vô khuẩn được xem là yếu

tố quan trọng nhất Lựa chọn chất sát khuẩn, phương pháp tiệt khuẩn đúng sẽ giúp cho tế bào phát triển tốt mà không bị nhiễm nấm cũng như vi khuẩn

Giai đoạn 2: Duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch mềm

Việc duy trì nuôi cấy trên môi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào thích nghi hoàn toàn với điều kiện sống mới (tách ly toàn toàn ra khỏi cơ thể mẹ), ngoài ra làm cho tế bào có hình thái mềm, xốp có đủ sức sống và đặc biệt làm mất khả năng biệt hoá thành các cơ quan bộ phận khác Điều này tạo thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang môi trường nuôi cấy lỏng

Giai đoạn 3: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng

Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm lượng hoạt chất của sinh khối Trong giai đoạn này phải khảo sát đầy đủ các yếu

tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhằm mục đích cho sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối cao nhất

Giai đoạn 4: Khuyếch đại quy mô nuôi cấy (scale-up)

Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để tăng khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) thể tích khác nhau tùy theo quy mô Ở giai đoạn này các yếu tố về điều kiện sản xuất như loại bioreactor, kiểu cánh khuấy, phân áp oxy hòa tan là những yếu tố cần phải khảo sát Hiện nay, sản xuất taxol và shikonin người ta đã sử dụng các bioreactor 10000 và 50000 lít

Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào

Thu hoạch SKTB là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy Thông thường các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào, vì vậy phương pháp lọc lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm Tuy nhiên, có một số trường hợp hoạt chất lại được giải phóng ra ngoài môi trường trong quá trình phát triển Vì vậy việc thu hồi các hoạt chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém Các hoạt chất sau khi tách chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng dược lí và bào chế các sản phẩm

1.1.4 Yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất

1.1.4.1 Thành phần môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường là 1 trong 2 nhóm yếu tố quyết định thành công của quá trình sinh khối Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế bào phát triển đồng thời nó cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh lí, sinh hóa của tế bào, quyết định năng suất và hàm lượng hoạt chất Các nhà khoa học đã thiết lập được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối

vô cơ khác nhau Môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là Murashige Skoog (MS) [51] Đặc tính quan trọng của môi trường MS là nồng độ cao các muối nitrat của kali và amoniac Môi trường B5 được thiết lập bởi Gamborg cũng đang được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng Thành phần muối vô cơ trong môi trường B5 thấp hơn trong môi trường MS Bên cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như Nitsch, White… Tuy nhiên, người ta thường sử dụng một loại môi trường hoặc kết hợp hai loại môi trường cơ bản, rồi tập trung vào sử dụng các hormone thực vật khác nhau Sự kết hợp môi trường thích hợp thường tạo được những sản phẩm có khả năng tồn tại và tốc độ tăng trưởng cao hơn [36],[ 51]

a/ Các nguồn cacbon

Hydratcacbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát triển khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây

Các chất hay sử dụng là đường glucose, saccarose, maltose, fructose… các loại đường này có thể sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong qua trình nuôi cấy Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của

tế bào mà còn ảnh hưởng đến các con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Misawa và cộng sự, 1985 khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào

Coleus blumei đã khảo sát nồng độ đường saccarose ảnh hưởng tới hàm lượng

hoạt chất acid rosmarinic Kết quả cho thấy khi dùng với nồng độ 7,5% trong môi trường nuôi cấy thì hàm lượng hoạt chất đạt 3,3 g/l Trong khi nếu dùng 2,5% đường thì hàm lượng hoạt chất chỉ là 0,8% Đối với SKTB rễ dừa cạn

(Catharanthus roseus) Knobloch and Berlin, 1980 cho thấy hàm lượng các

alkaloid nhân indole cao nhất khi nồng độ đường nuôi cấy nằm trong khoảng

từ 4 -12%

Ngoài ra hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy còn gây ra áp suất thẩm thấu, khi áp suât thẩm thấu tăng tác động vào tế bào sẽ kích làm tăng tổng hợp các phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản phẩm thứ cấp Do và Cormier, 1990 [42] đã tạo tress áp suất thẩm thấu bằng cách sử dụng đường và một số chất khác để làm tăng hàm lượng

anthocyanindin trong SKTB cây Vitis vinifera Theo lí thuyết đó, Sakamoto et al., 1993 khi nuôi cấy tế bào Aralia cordata nếu sử dụng nồng độ đường 3%

thì kích thích làm tăng hàm lượng hoạt chất Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ đường tới 5% thì hàm lượng hoạt chất giảm Vì vậy trong thực nghiệm phải tối ưu hóa loại đường và nồng độ đường sử dụng nhằm đảm bảo cho tế bào phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất

b/ Nguồn nitơ và các ion vô cơ

Nếu cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ như một yếu tố thiết yếu để sinh trưởng và phát triển thì để nuôi cấy thành công những tế bào chưa biệt hóa ở một miếng mô được cắt ra từ cây, trong môi trường nuôi cấy cũng cần phải có các muối vô cơ Nuôi cấy tế bào thực vật đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn ni tơ và các ion vô cơ như phospho, kali, canxi, magnesi, mangan, sulfua Trong đó nguồn Ni tơ yêu cầu cung cấp với hàm lượng rất cao, bởi đây là nguồn năng lượng thích hợp và có hiệu quả cho tế bào phát triển Nguồn ni tơ được đưa vào dưới dạng các muối amoni hoặc nitrat như

NH4NO3; NaNO3 thông thường hay kết hợp với các muối khác như NH4HPO4 , Ca(NO3)2. Tuy nhiên việc cân đối đối giữa tỷ lệ NH4+/NO3- là rất quan trọng ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất có trong SKTB Trong SKTB tam thất

(Panax notoginseng) Zhang et al (1996) [83] thấy rằng hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệNH4+/NO3-giảm

Tuy nhiên nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây một số độc tính cho tế bào và khi đó thí hàm lượng saponin lại giảm Ngoài ra, các vi khoáng chất như: Cu2+; Zn2+; Co2+; Mo2+; I-… là những thành phần không thể thiếu đối với tế bào thực vật Các chất này đóng vài trò như là các coenzym tham gia vào các quá trính sinh lí, sinh hóa của tế bào Đặc biệt chúng tham gia vào kích hoạt các enzym của quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất

c/ Vitamin

Những môi trường cơ bản mô tả ở trên gồm myo-inositol; acid nicotinic; thiamin hydroclorid; pyroxin… Vitamin đóng vai trò là các coenzym tham gia các quá trình chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích thích sự phát triển của các tế bào Nồng độ của myo-inositol trong môi trường này là 100mg/l Trong sự tăng trưởng của các tế bào thực vật, các chất hữu cơ đôi khi được thêm vào môi trường Những phần phụ này bao gồm: acid amin, pepton, các chất men, chiết xuất từ mạch nha và nước dừa, nước dừa cũng được biết có chứa nhiều chất điều tiết sinh trưởng giúp tế bào phát triển

d/ Hormone thực vật

Hormone thực vật hoặc các chất điều tiết sinh trưởng là rất cần thiết đối với các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế bào Hormon thực vật được chia thành 2 nhóm chính

- Nhóm khung auxin: chất điển hình là acid 2,4-diclorophenoxyacetic (2,4-D); 1-naphtalenacetic acid (NAA); Indole-3-acetic acid (IAA); Indole-3-butyric acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1-50µM dùng làm chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào Đặc biệt trong SKTB 2,4-D và NAA là những chất không thể thiếu đặc biệt là giai đoạn nuôi cấy tạo callus

- Cytokinin: gồm kinetin và benzyladenine có vài trò làm tăng sinh tổng hợp nguyên liệu di truyền, kích thích quá trình sinh trưởng làm cho tế bào phát triển nhanh hơn Các chất này có thể được sử dụng đơn lẻ Tuy nhiên trong đa số các nghiên cứu, chúng thường được sử dụng kết hợp với nhóm auxin như 2,4-D, NAA Mỗi loại tế bào thực vật khác nhau yêu cầu những mức hormone thực vật khác nhau cho sự phát triển của tế bào cũng như tạo các sản phẩm thứ cấp của nó Việc lựa chọn các chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất để xác định sự tối ưu nhất đối với mỗi loại thực vật là thật sự quan trọng

Ngoài 2 nhóm trên còn có các chất khác: Acid jasmonic, acid ginberilic, các ethylen… cũng có thể được sử dụng trong môi trường để kích thích tổng hợp nguồn hoạt chất

e/ Các chất kích thích làm tăng hoạt chất (elicitor)

Bình thường, bản thân trong tế bào có hệ thống tự bảo vệ Syschemic acquired resistance; ISR – Induced systemic resistance) tế bào để chống đỡ lại các mầm bệnh (pathogens), khi các mầm bệnh tác động vào tế bào, hệ thống tự bảo vệ này được khởi động Những chất có khả năng kích thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là các elicitor Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp elicitor là chất không độc cho tế bào nó vẫn có thể tồn tại cùng với tế bào Vì vậy người ta có thể định nghĩa elicitor như sau: Elicitor là những các chất có bản chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác dụng kích thích tạo các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào thực vật, trong đó có việc kích thích làm tăng tổng hợp các sản phẩm thứ cấp

(SAR-Cơ chế hoạt động của elicitor là kích hoạt hệ thống tự bảo vệ theo cách thức truyền tín hiệu: Elicitor gắn kết với receptor trên màng tế bào, các tín hiệu của elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp: kênh ion, GTP-Protein; các phân tử oxy hoạt động, Inositol 1,4,5-trisphosphates các enzym, các chất trung gian dẫn truyền kết qủa cuối cùng kích thích sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp

Sơ đồ cơ chế tác dụng của elicitor

Elicitor được chia làm 2 loại

- Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): Gồm các chất (nội sinh, hay ngoại sinh) thu được có nguồn từ thực vật, vi sinh vật: nấm, dịch chiết các thực vật + Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitors): bản chất là những thành phần đã có hoạt tính elicitor

+ Elicitor nội sinh (endogenous elicitors) là sản phẩm tương tác của chính các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra: đây thực chất là các elicitor thực

sự

- Elicitor vô sinh:

+ Gồm các chất hoá học tổng hợp: Acid salicylic, acid Benzoic, acid Ferulic, acid Jasmonic,

+ Các yếu tố vật lý: ánh sáng, tia UV, nhiệt độ,

+ Ion kim loại nặng

+ Những tổn thương cơ học

Trong nghiên cứu sử dụng các elicitor cần phải lựa chọn được nồng độ, loại elicitor cũng như thời gian tiếp xúc của từng loại elicitor cho phù hợp với từng loại tế bào

1.1.4.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

a/Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào thực vật và sự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp Mỗi loại tế bào thực vật có một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định Nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế bào ngừng phát triển hoặc chết đi, nhiệt độ quá cao sẽ gây chết tế bào Trong khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật thường có một nhiệt độ tối ưu Tại nhiệt độ này, sự phát triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa Tuy nhiên, khác với vi khuẩn, vi nấm tế bào thực vật thường thích nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 – 280C Trong nghiên cứu

SKTB dừa cạn (Catharanthus roseus) C M Bailey và cs 1989 [7] đã tối ưu hóa

được khoảng nhiệt độ thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và hàm lượng vinblastin và vincristin cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ từ 22-250C Theo Kee Won

Yu và cs (2005) [22] nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi cấy tế bào nhân sâm (Panax ginseng CA.Mayer) là 24-260C

b/ Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới lượng tế bào thu được và sự sinh tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp Các tế bào sinh vật nói chung và tế bào thực vật nói riêng trong công nghệ sinh khối đều có một đường cong phát triển, đường cong này được chia thành 4 pha:

- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase) tại pha này, các tế bào thực vật gần như không phát triển, nó chỉ thích nghi với điều kiện

và môi trường nuôi cấy mới

- Pha phát triển (logarit phase or exponent phase) pha này các tế bào đã trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm luỹ thừa Trong pha này, khối tế bào phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng tế bào có thể phát triển cực đại

- Pha dừng (stationary phase): trong pha này các tế bào gần như không phát triển và nhân lên nữa Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tới hằng định Trong pha này các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp, pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao Vì vậy cần phải cung cấp dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào trong pha này nhằm kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp

A Yari Khosroushahi và cs, 2005 khi khảo sát tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tế bào thông đỏ (Taxus baccata) thấy rằng ngoài sử dụng các elicitor,

khi bổ sung 1% saccarose vào môi trường khi kết thúc pha phát triển thì hàm lượng Taxol tăng gấp 16 lần so với nhóm chứng [80]

Hình 1.2 Đường cong phát triển của tế bào thực vật

- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase), trong pha này các tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm Biểu hiện bên ngoài

là thay đổi màu sắc tế bào và môi trường nuôi cấy, thay đổi pH môi trường Như vậy cần phải xác định điểm kết thúc của qúa trình nuôi cấy - đó là thời điểm bắt đầu chuyển sang pha ly giải Khi đó sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất tốt nhất và không bị lãng phí môi trường

c/ pH môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và hình thành saponin vẫn chưa được nghiên cứu Tuy nhiên, mô thực vật được biết là có khả năng thích nghi lớn với sự thay đổi của pH Trong môi trường nuôi cấy, pH có thể được thay đổi bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp Theo W M van Gulik và cs trong nghiên cứu nuôi cấy tế

bào Nicotiana tabacum cho thấy khoảng pH thích hợp để nuôi cấy là 5,4-5,6 trong khi đó đối với Catharanthus roseus thì pH = 5,8 là tối ưu [45]

d/ Nồng độ oxy hoà tan

Sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí nói chung đều cần sự có mặt của oxy Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật Tốc độ phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy Trong thực tế, các

tế bào thực vật phát triển tương đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp cho tế bào không cần cao Thông thường nồng độ oxy hòa tan thích hợp trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật khoảng 20-40% [36]

Nồng độ oxy quá cao cũng không ảnh hưởng nhiều tới tốc độ phát triển của tế bào Tuy nhiên khi nồng độ oxy quá thấp có thể gây chết tế bào Trong quy trinh sinh khối, giai đoạn nuôi cấy tế bào trên hệ thống các bioreactor nồng

độ oxy hòa tan đóng vai trò quan trọng Theo Nguyễn Thành Trung và cs, 2006

khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào sâm Triều tiên (Panax ginseng) cho thấy nồng

độ oxy hòa tan trong hệ thống bioreactor 15 lít phù cho tế bào phát triển tốt nhất là 35- 40% [63], [50]

Trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào Lithospermum erythrorhizon của

Yasuhiro Fvà cs (1985) mức nồng độ oxy hòa tan đã được sử dụng là 50% thì hàm lượng shikonin cao nhất đạt 2.300mg/l tương đương với hàm lượng hoạt chất là 46% [81] Như vậy, tuỳ theo đặc tính của tế bào và tốc độ phát triển của mỗi giai đoạn mà ta điều chỉnh nồng độ oxy hoà tan cho phù hợp

1.1.5 Thành tựu của công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế cao là sản phẩm của công nghệ SKTB thực vật.[ 36, 66, 41, 51]

1.1.5.1 Các hoạt chất dùng trong dược phẩm

Các alkaloid

Người ta có thể thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây

Coffea arabica, betalain trong callus củ cải đường, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng

đáng kể berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương pháp nuôi cấy tế bào)… Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp hương liệu và trong y học

Reserpine là alkaloid chiết xuất từ cây Ba gạc (Rauwolfia sp) có tác dụng

chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối loạn tuần hoàn đã được sản xuất bằng

phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina Từ hệ thống bioreactor

10000 lít có thể sản xuất được 3.500 kg reserpine trong thời gian 30 ngày, tương đương với lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó

Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy

Sĩ) đã sản xuất được loại alkaloid là scopolamine từ tế bào cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấy Bằng cách chọn

lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng (monoclonal variation) và kỹ thuật gen, người ta đã tăng được sản lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần Sikuli và cộng sự (1997) sau khi gây

nhiễm cây Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy

hàm lượng hyoscyamine ở rễ đạt cực đại 100 mg/l sau 6 tuần nuôi cấy

Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây

Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình thường Một số nghiên cứu đã phân lập được các dòng tế bào Cantharanthus

sản xuất serpentin và ajmalacine từ nuôi cấy in vitro Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt người ta đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tế bào tốt nhất lên một mức cao hơn nữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg/L serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L ajmalacine Mới đây, người ta đã hoàn thiện được công nghệ nuôi cấy tế bào

của cây C roseus để sản xuất viblastine và vincristine là hai chất chống ung

thư rất mạnh, hiện đang để chữa ung thư máu

Các steroid

Các Steroid là những hợp chất sử dụng nhiều trong ngành dược làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc trợ tim, thuốc chống viêm giảm đau, các hormon tuyến thượng thận…Năm 1969 Kaul và cs đã nuôi cấy thành

công tế bào của cây Dioscorea deltoidea để sản xuất diosgenin

Một số chất khác

Thí dụ điển hình nhất là công nghệ sản xuất shikonin, một loại sắc tố đỏ

có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ của cây Lithospermum erythrorhizon

Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ Tuy nhiên, các nhà khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5

kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin Cho tới nay toàn

bộ nguồn nguyên liệu shikonin đều được sản xuất bằng công nghệ này

Paclitaxel là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng – thông

đỏ (Taxus sp) đang được sử dụng hiệu quả trong điều trị nhiều loại ung thư

Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp Công ty Escagenetics (California, Mỹ)

đã thành công trong sản xuất taxol bằng công nghệ SKTB thực vật Hàm lượng taxol trong SKTB cao hơn 10 -20 lần so với cấy tự nhiên Hiên tại 2 sản phẩm này là độc quyền sở hữu trí tuệ toàn cầu của hãng Figire và đang bán với doanh số mỗi năm hàng tỷ đô la

là nguồn tiềm tàng nhất trên thế giới Hiện nay, người ta cũng đã tiến hành

nuôi cấy tế bào của các loài Vitis vinifera, Daucus carota và Euphorbia millii

để sản xuất anthocyanin với hàm lượng cao, từ 10-20% trọng lượng khô

- Crocin

Crocin và crocetin một loại sắc tố màu đỏ tươi được tìm thấy trong đầu

nhụy cây nghệ tây (Crocus sativus) Đây là loại nguyên liệu có giá trị cao do

thực tế cây nghệ tây chỉ có thể sinh trưởng ở những vùng địa lý đặc biệt trên thế giới và đòi hỏi nhiều nhân công khi thu hoạch Muốn thu hoạch 1 kg đầu nhụy nghệ tây (một loại gia vị có giá trị) cần phải có khoảng 150.000 hoa Hiện nay, người ta đã phát triển các phương pháp nuôi cấy tế bào của đầu nhụy cây nghệ tây trong điều kiện in vitro để sản xuất các callus có màu chứa crocin và các crocetin

b/ Các chất mùi

- Vani

Vani là hỗn hợp phức tạp của các thành phần chất mùi chiết ra từ hạt của

cây Vanilla planifolia Đây là nguyên liệu tạo mùi phổ biến và được sử dụng

rộng rãi nhất trong nghành công nghệ thực phẩm Mỗi năm thế giới tiêu thụ khoảng 12.000 tấn vani Nhưng trong đó chỉ khoảng 20 tấn được tách chiết từ hạt, phần còn lại được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hóa học và phương pháp nuôi cấy tế bào Trong đó nuôi cấy tế bào chiễm tới gần 50% sản lượng Các nhà khoa học đã sử dụng các biện pháp kích thích hoạt chất trong sinh khối tăng hàm lượng vanilla từ 100 mg/L lên đến hơn 1.000 mg/L, tương đương 8% hàm lượng vanilla trên trọng lượng khô, cao hơn trong cây tự nhiên gấp 4 lần

- Chất mùi tỏi (garlic) và và mùi hành (onion)

Các chất mùi tỏi và hành cũng được sản xuất trong nuôi cấy tế bào Các chất mùi này phát triển từ các tiền chất (precusor) ngoại sinh trong quá trình

xử lý sau thu hoạch Nuôi cấy tế bào cây tỏi (Allium sativum) không phân hóa

(hoặc các callus phân hóa có màu xanh lục) đã thu được một số loại tiền chất amino acid (methyl, propyl, allyl và cysteine sulphoxides) và hai loại hợp chất ninhydrin-positive không xác định Chất mùi tổng số thu được trong callus hình cầu màu trắng (globular white callus) và callus màu xanh lục phân hóa chậm (semidifferentiated green callus) tương ứng là 4% và 13% so với cây trồng trong tự nhiên Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật của cây hành tây

(Allium cepa) để sản xuất các chất mùi hành cũng đã được phát triển Prince

(1991) đã chứng minh sự tăng lên của các hợp chất mùi hành trong nuôi cấy

rễ Thông qua việc bổ sung các amino acid như cysteine, methionine và glutathione, nồng độ cuối cùng của sản phẩm có thể tăng lên rất lớn

1.1.6 Tình hình ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật cho các loài sâm

* Nhân sâm (Panax ginseng) là loại thực vật có nhiều tác dụng sinh

học Thành phần quyết định tác dụng của nhân sâm là các ginsenosid Đối với sâm nuôi trồng toàn bộ cây, thì vấn đề tuổi sâm rất quan trọng (sâm phải từ 4 đến 6 năm mới có tác dụng), theo kinh nghiệm trên một mảnh đất không được nuôi trồng sâm liên tục trong nhiều năm Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc

đã sử dụng công nghệ SKTB rễ nhân sâm để thu hoạch các sản phẩm làm thuốc bổ, thuốc phòng chống các bệnh tim mạch, thuốc chống gốc tự do, thuốc tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm [16,19] Hiện nay, Hàn Quốc có khoảng trên 70 sản phẩm về nhân sâm bán trên thị trường, trong số đó, rất nhiều sản phẩm từ SKTB nhân sâm

* Tam thất (Panax notoginseng) là dược diệu được đánh giá tốt tương

tự như nhân sâm, phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía đông nam Trung Quốc và một số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam Hiện nay loại cây dược liệu này được trồng thành những cánh đồng lớn đạt tiêu chuẩn GAP cung cấp tam thất sạch cho ngành dược Bên cạnh đó các nhà khoa học đã áp dụng công nghệ SKTB thực vật, tạo ra sản phẩm từ nguồn nguyên liệu sinh khối Trong đó các tác giả đã sử dụng nhiều chất kích thích làm tăng sinh tổng hợp các saponin trong tế bào, như sử dụng các dẫn chất của acid jasmonic, sử dụng stress áp lực thẩm thấu [33] Các kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng saponin trong

tế bào đã tăng đáng kể khi sử dụng các biệp pháp này

1.2 SÂM NGỌC LINH

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hình 1.3 Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamenesis)

Sâm Việt Nam hay còn gọi là sâm Ngọc Linh (SNL) được Dược sĩ Đào Kim Long phát hiện dầu tiên vào năm 1973 và sau đó được Hà Thị Dụng và

GS Grushvinski xác định là một loại Panax mới của thế giới với tên khoa học

là: Panax vietnamensis Ha et Grushv, họ nhân sâm (Araliaceae) [7],[ 11]

Cây thân thảo sống nhiều năm, cao đến 1 m Thân rễ mập có đường kính 3,5 cm, không có rễ phụ dầy dự trữ, đôi khi ở một số cây phần cuối thân

rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 3 cm Đốt trên cùng của của thân rễ tồn tại 1 - 4 thân [7].[31]

Thân nhẵn cao 40 - 80 cm, rỗng có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc Lá mọc vòng thường có 4 lá kép chân vịt có 5 lá chét, lá dài 7

- 12 cm Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14

cm, rộng 3 - 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 cặp dọc theo gân chính và ở bên mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 cm, mặt dưới ít hơn Cụm hoa dài

25 cm, gấp 1,5 - 2 lần chiều dài cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tận cùng, đôi khi có thêm 1 - 4 tán phụ hoặc đơn độc Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4 mm Bầu 1 ô, 1 vòi, đôi khi có 2 ô, 2 vòi Quả chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả Quả 1 hạt hình thận, quả 2

hạt hình cầu hơi dẹt dài 7 - 10 mm rộng 4 - 6 mm (hình 1.3) [7],[ 31]

Rc1, gypenosid-IX, gypenosid-XVII, quinquenosid-R1, notoginsengnosid-Fa

và majonosid-F1 (nhóm protopanaxadiol); ginsengnosid-Re, glucoginsengnosid-Rf, ginsengnosid-Rg1, ginsengnosid-Rh1, pseudo-ginsengnosid-Rs1 (= monoacetyl ginsengnosid-Re), noto ginsengnosid-R1, noto ginsengnosid-R6 (nhóm protopanaxatriol), pseudo-ginsengnosid-Rt4, 24(S)-pseudo-ginsengnosid-F11 Ngoài ra trong sâm còn có lượng lớn các saponin nhóm ocotilol điển hình là majonosid-R2 chiếm tới 50% tổng lượng saponin

20-Sâm Việt Nam chứa rất ít saponin thuộc nhóm olean gồm ginsengnosid-Ro (= chikusetsu-saponin-V) và hemslosid-Ma3 Các saponin có cấu trúc mới, được đặt tên là: vina-ginsengnosid-R1, -R24 Sâm Việt Nam chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít saponin nhóm olean Thành phần saponin của sâm Việt Nam tự nhiên rất giống với thành phần của các sâm trồng, nó chứa đầy đủ các saponin chủ yếu có trong các loài sâm trồng như ginsengnosid-Rb1, -Rd, -Re, -Rg1, và notoginsengnosid-R1, nhưng hàm lượng saponin toàn phần của saponin Việt Nam lại cao hơn cả

Mặt khác, sâm Việt Nam chứa hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh ocotilol rất cao, nhất là majonosid-R2 (hình 1.4) thành phần đặc biệt này đã giúp sâm Việt Nam trở thành một loài Panax độc đáo không những về mặt phân loại mà còn về mặt dược l ý

Ngoài thành phần saponin, trong SNL còn có hợp chất khác như: polyacetylen, các sterol, các acid amin, acid béo, khoáng chất…

a

Majonosid R 2 Ginsenosid Rb 1

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các saponin chính trong sâm Ngọc Linh

1.2.3 Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu cho thấy SNL một số tác dụng dược lý sau:

- Tác dụng bổ chung và sinh thích nghi: SNL có tác dụng bổ dưỡng toàn thân, tăng sức lực dẻo dai, cải thiện thể lực Khi dùng cho bệnh nhân phục hồi sức khỏe tốt, bệnh nhân ăn ngon,

- Ngoài ra SNL có tác dụng sinh thích nghi, tăng sức đề kháng không đặc hiệu của cơ thể với những yếu tố gây độc hại (tăng khả năng chịu các tác nhân stress vật lý, hóa học, sinh học), làm tăng sức bền bỉ bao gồm khả năng làm việc về trí tuệ, tinh thần và thể lực

- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: SNL có tác dụng bổ thần kinh, tăng trí nhớ, tăng cường hưng phấn vỏ đại não, cải thiện tính linh hoạt của hoạt động thần kinh SNL còn nâng cao khả năng làm việc bằng thể lực và trí lực

- Chống stress, chống gốc tự do

- Tăng cường chức năng sinh dục

- Tác dụng bảo vệ tế bào gan: SNL có tác dụng tốt trong mô hình gây độc cho tế bào gan trên thực nghiệm Khi dùng để điều trị viêm gan cấp, SNL

có tác dụng làm chức năng gan phục hồi nhanh chóng và làm giảm khả năng chuyển bệnh thành mạn tính

- Điều trị viêm loét dạ dày: trên các mô hình gây loét dạ dày cấp và mạn tính thực nghiệm, SNL có tác dụng hạn chế tổn thương loét niêm mạc dạ dày, thu nhỏ ổ loét

- Làm đẩy nhanh quá trình liền sẹo vết thương

- Ngoài ra còn nhiều tác dụng khác cần được nghiên cứu đánh giá thêm trên thực nghiệm cũng như trên lâm sàng như tác dụng tăng cường miễn dịch, tác dụng trên bệnh đái tháo đường

1.2.4 Nuôi trồng

SNL là loại cây quý, có rất nhiều tác dụng chữa bệnh, nhưng cũng là

loại cây rất hiếm SNL chỉ mọc ở độ cao trên 1.500 m, chủ yếu tập trung ở vùng núi Ngọc Linh có độ cao khoảng 2.500 m thuộc huyện Đăk Tô, tỉnh Kom Tum; và huyện trà My, tỉnh Quảng Nam Tại tỉnh Quảng Nam, công ty

cổ phần Dược và vật tư y tế tỉnh Quảng Nam chuyên trực tiếp triển khai nuôi trồng sâm tại vị trí nơi cây mọc hoang: huyện Trà My, tỉnh Quảng Nam Tại Kom Tum cũng có nông trường Ngọc Linh, chuyên trồng và bảo tồn sâm Do SNL là cây thuốc có giá trị, nên việc nuôi trồng SNL đã được đầu tư Đề tài

"Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất giống, kỹ thuật trồng và phát triển cây SNL" đã được triển khai tại Kom Tum Trên cơ sở kết quả của đề tài, từ năm 2004, Chính phủ đã đồng ý cho tỉnh Kom Tum triển khai dự án bảo tồn

và phát triển cây SNL Nhưng kết quả cho thấy hiệu quả trồng SNL không cao và còn gặp nhiều khó khăn

Những khó khăn chủ yếu là:

- Khó khăn về nguồn giống: cây đậu quả không đáng kể, nên khó khăn trong việc tạo nguồn giống

- Khó khăn về kỹ thuật chăm sóc, chế độ phân bón, kỹ thuật trồng trọt

- Năng suất không cao, cây có thời gian ngủ đông dài

- Chất lượng cây sâm phụ thuộc chế độ chăm bón, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng…

- Thời gian để thu hoạch lâu: khoảng 6 năm, trong khi đó tình trạng sâm

bị khai thác trộm trước thời gian được phép thu hoạch thường xuyên xảy ra Theo thông báo của Viện Dược liệu năm 2003 các nhà khoa học phát hiện tại đỉnh núi Ngọc Lung có SNL nhưng chỉ sau thời gian ngắn đã bị khai thác trộm hoàn toàn

Đứng trước tình hình trên, bên cạnh việc đầu tư tổ chức quy hoạch, trồng và bảo tồn SNL, một vấn đề đặt ra, cần phải triển khai phát triển công nghệ SKTB SNL tạo nguồn hoạt chất ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc,

mỹ phẩm, thực phẩm chức năng Đây là một hướng đi cấp bách và phù hợp với xu hướng phát triển công nghệ SKTB thực vật của nhiều nước trên thế

giới để sản xuất hoạt chất nguồn gốc thực vật

CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

- Rễ (củ) SNL tươi, khoảng từ 5 – 6 tuổi, được thu hái từ núi Ngọc Linh

độ cao 1.500 m thuộc xã Măng Ri – Tu Mơ Rông – Kon Tum tháng 3 năm

2006 đã được Viện dược liệu – Bộ Y tế thẩm định

- Dịch chiết SNL sinh khối đạt TCCS, dùng uống để nghiên cứu tính an toàn và tác dụng dược lý thực nghiệm

- Dịch chiết rễ (củ) SNL tự nhiên 5-6 năm tuổi đạt TCCS, dùng để đối chứng

2.1.2 Hóa chất

- Các hoá chất dùng để pha chế môi trường nuôi cấy của hãng Sigma đạt tiêu chuẩn cho nuôi cấy tế bào thực vật

- Chất chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1, Rd (Wako - Nhật)

- Dung môi chạy sắc ký: acetonitril, methanol (dùng cho HPLC, Merck, Đức); nước cất (dùng cho HPLC, Prolabo, Tây Ban Nha); ethanol (tinh khiết phân tích) và một số hóa chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết

- Carrageenin của hãng Sigma – Hoa Kỳ ; acid thiobarbituric p.a, aid trichloacetic p.a, acid metaphosphoric p.a, EDTA p.a, đệm tris, thuốc thử Ellman: 5-5’ dithiobis-(2 nitrobenzoic acid) (Merck); tetrachlorua cacbon (Trung Quốc)

- Các kit xác định hoạt độ GPx, SOD, TAS của hãng Sigma

2.1.3 Các thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn vô khuẩn dùng cho nuôi cấy tế bào

- Tủ nuôi cấy vi sinh, model LHC – 4A1 (hãng Esco – Singapo)

- Hệ thống máy lắc, model: ISF-4-W (Hãng Kuhner – Thụy Sĩ)

- Tủ tạo không khí sạch (Lamine) Narie – Đức

- Máy hấp tiệt trùng Hirayama – model HV-110 – Nhật Bản

- Máy sắc ký lỏng hịêu năng cao detector UV 2 kênh Gradient(Waters): 2695D, buồng gia nhiệt, hệ thống bơm mẫu tự động

- Máy lắc siêu âm (Soniclean 500 UT)

- Máy cất nước 2 lần Hamilton WSC 14D – Đức

- Máy li tâm tốc độ 30.000 vòng/phút (Universal 320) – Đức

- Máy cất quay chân không Tokyo Rikakikai model N-100 – Nhật Bản

- Cân phân tích Satorius độ chính xác 0,01 mg – Đức

- Máy xét nghiệm sinh hoá 4010 của hãng Boerhinger mann

- Rotarod, (Mouse Rota-Rod, Cat No.47600, Ugo Basile – Italia)

- Máy đo sức cơ chân chuột nhắt (Grip strength meter for mouse, Cat

No.47106, Ugo Basile – Italia)

- Bảng đục lỗ (Hole Board, Cat No.6650, Ugo Basile – Italia)

- Máy đo phản xạ tự động có điều kiện (Automatic Reflex Conditioner, Cat No 7530, Ugo Basile – Italia)

- Chuông thủy tinh có đường kính 30 cm, cao 40 cm, dùng cho nghiên cứu chuột bơi

- Chuồng mª lộ (classic maze): được thiết kế gồm nhiều đường dÝch dắc nhưng chỉ cã một đường đi đóng tới đÝch (nơi để thức ăn ngon), cßn tất cả c¸c đường kh¸c (12 đường) đều là đường vào ngâ cụt, kh«ng tới đÝch Qu·ng đường từ điểm xuất ph¸t (cửa vào) đến nơi để thức ăn dài tổng cộng 7m

- Mê cung nước (morris water maze): Là một bể bơi hình tròn đường kính 120cm, cao 30cm, được chia làm 4 phần Nước cã nhiệt độ 20-210C được đổ vào bể đến chiÒu cao 24cm Một bục phao đường kính 10cm được đặt tại một góc cố định trong bể bơi

- Thiết bị nghiền dịch đồng thể gồm: Máy nghiền dịch đồng thể Glasscol (Mỹ), chày Teflon và cối thuỷ tinh chuyên dụng Glascol (Mỹ)

- Máy quang phổ Speccord 40 (Đức)

- Máy ELISA 96 giếng (Thermo - Phần Lan)

Chuột nhắt trắng dòng Swiss trưởng thành, khoẻ mạnh, trọng lượng 20

g - 22 g Chuột cống trắng dòng Wistar trưởng thành, khoẻ mạnh, trọng lượng

200 ± 20g Thỏ khỏe mạnh, trọng lượng 1.800 g – 2.200 g

Các động vật sử dụng đạt tiêu chuẩn dùng cho thí nghiệm, do Ban chăn nuôi - Học viện Quân y cung cấp, nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi làm thí nghiệm, ăn thức ăn theo tiêu chuẩn thức ăn cho động vật nghiên cứu (do Ban chăn nuôi Học viện Quân y cung cấp), nước (đun sôi để nguội) uống tự do

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh

2.2.1.1 Nuôi cấy tạo callus

a Phương pháp tạo callus

Tiến hành theo phương pháp của Kee-Won Yu [54] gồm các bước sau:

- Pha chế môi trường thạch mềm: sử dụng các môi trường khác nhau:

MS, White, B5, SH theo công thức của Kee-Won Yu [51], điều chỉnh pH = 5,8 Đổ vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường, hấp thiệt khuẩn ở 1210C trong

25 phút Để nguội

- Sát trùng mẫu cấy: rễ sâm sau khi thu hái được cắt bỏ các rễ nhỏ, rửa sạch bùn đất bằng nước, ngâm trong nước xà phòng loãng 15 phút, tráng sạch nước xà phòng bằng nước thường, sau đó tráng lại 3 lần bằng nước cất Tiệt khuẩn với dung dịch HgCl2 0,07% trong thời gian 20 phút Sau đó tráng lại 5 lần bằng nước cất vô khuẩn

- Tách các mô ra khỏi rễ sâm tự nhiên: cắt mẫu đã tiệt khuẩn thành những khoanh nhỏ có kích thước 2mm x 2mm x 1mm (loại bỏ phần vỏ và các

mô bị ngộ độc chất sát khuẩn)

- Nuôi cấy trong môi trường thạch trong điều kiện vô khuẩn, không có ánh sáng, nhiệt độ 250C và độ ẩm 50% để cho các tế bào phát triển thành callus

Đánh giá: khả năng tạo thành callus trên các môi trường khác nhau dựa trên các chỉ tiêu sau:

+ Hình thái của callus: tế bào phát triển đều, sáng màu và không bị nhiễm nấm mốc

+ Khối lượng callus: khối lượng tươi và khô

b.Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo callus

Sử dụng 4 loại môi trường khác nhau cho nuôi cấy tạo callus là: MS, White, B5 và Nitsch Phương pháp tạo callus được mô tả trong mục a, 2.2.1.1 Trong đó, các môi trường được bổ sung 30 gam saccarose; 1mg/l NAA và 0,1mg/l kinetin Sau thời gian nuôi cấy, cân khối lượng tươi và khô Từ đó lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho callus phát triển

c Khảo sát ảnh hưởng của thời gian

Callus được nuôi cấy trên môi trường tốt nhất Theo dõi tốc độ phát triển của tế bào từ ngày nuôi cấy thứ 1 đến ngày nuôi cấy thứ 45 bằng cách cân xác định khối lượng của tế bào khô và tươi Từ đó xác định được thời gian thích hợp cho 1 chu kỳ nuôi cấy đối với callus SNL

d Khảo sát ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng

Sử dụng 3 loại chất điều tiết sinh trưởng khác nhau cho nuôi cấy tạo callus là: NAA, 2,4-D và IAA có sử dụng kết hợp với kinetin Thời gian nuôi cấy là 35 ngày Đánh giá sự thích hợp của chất điều tiết sinh trưởng với callus thông qua khối lượng tế bào khô và tươi

2.2.1.2 Duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch

a Phương pháp duy trì nuôi cấy callus

Callus sau khi tạo được trong môi trường nuôi cấy thích hợp, tiến hành cấy chuyển trên môi trường thạch nhằm mục đích cho tế bào phát triển nhanh, thích nghi với môi trường, đồng thời hạn chế quá trình biệt hóa của tế bào thành các mô, các tổ chức Các bước tiến hành bao gồm:

- Pha chế và tiệt khuẩn môi trường thạch mềm MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau Đổ vào các bình nón dung tích 250ml mỗi bình khoảng 75ml môi trường, tiệt khuẩn ở 1210C trong 25 phút Để nguội

- Cấy vào mỗi bình nón đã chứa sẵn môi trường khoảng 10 gam tế bào

- Nuôi cấy tế bào trong điều kiện vô khuẩn, không có ánh sáng, ở nhiệt

độ 250C Sau từng khoảng thời gian nhất định lấy mẫu kiểm tra

- Các chỉ tiêu đánh giá:

+ Hình thái tế bào

+ Khối lượng tế bào khô

+ Khối lượng tế bào tươi

+ Tỷ lệ tăng trưởng =

2

1

m m

m1: khối lượng tế bào khô thu hoạch (gam)

m2: khối lượng tế bào khô nuôi cấy ban đầu (gam)

b.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng

Từ môi trường thích hợp đã chọn, khảo sát ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình sinh trưởng của callus Sử dụng các chất NAA với nồng độ thay đổi từ 0,5mg/l đến 2,5mg/l Nuôi cấy trong điều kiện không

có ánh sáng ở 240C trong thời gian 35 ngày Cân xác định khối lượng tế bào tươi và khô Từ đó lựa chọn được khoảng nồng độ NAA thích hợp cho callus phát triển

c Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường

Sau khi chọn được loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng phù hợp nhất, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ sinh trưởng của callus Thay đổi pH trong các khoảng khác nhau từ 5,2 - 6,6 và theo dõi kết quả, chọn ra pH thích hợp

d Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Từ môi trường nuôi cấy đã lựa chọn được chất, nồng độ chất điều tiết

sinh trưởng và pH thích hợp nhất, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của callus Thay đổi nhiệt độ trong các khoảng khác nhau từ 22-28°C, theo dõi kết quả và lựa chọn khoảng nhiệt độ phù hợp

2.2.1.3 Nuôi cấy trong môi trường lỏng

Khối tế bào sau khi đã mềm mại khi nuôi cấy trên môi trường thạch, cấy chuyển tế bào sang môi trường lỏng trên hệ thống máy lắc Lựa chọn môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l NAA và 0,1 mg/l kinetin, 30g/l đường saccarose Nuôi cấy trong bình nón 150ml Điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ

250C, độ ẩm 50%, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong điều kiện không có ánh sáng [61] Các bước tiến hành nuôi cấy gồm:

- Pha chế môi trường MS theo công thức [18] từ các dung dịch mẹ, sau

đó bổ sung chất điều tiết sinh trưởng: NAA 1,5mg/l; kinetin 0,1mg/l; saccarose 30g/l Điều chỉnh để dung dịch có pH = 5,8 Đổ 50ml môi trường vào mỗi bình nón dung tích 150 ml Hấp tiệt khuẩn ở 1210C trong 25 phút, để nguội

- Cấy vào mỗi bình môi trường khoảng 5 gam tế bào sâm

- Nuôi cấy ở điều kiện quy định trong thời gian 25 ngày

- Thu hoạch SKTB: sau khi kết thúc nuôi cấy, lọc lấy tế bào, rửa sạch nhiều lần với nước để loại bỏ hết môi trường, cân khối lượng tế bào tươi Sấy

tế bào ở 450C đến khối lượng không đổi, cân khối lượng tế bào khô, tính số gam tế bào trong 1 lít môi trường

a Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường lỏng MS theo phương pháp mô tả mục 2.2.1.3 Đánh giá tốc độ phát triển của tế bào theo thời gian các chỉ tiêu:

+ Khối lượng tế bào tươi

+ Khối lượng tế bào khô

Sau ngày nuôi cấy thứ 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18, thu hoạch tế bào, cân xác định khối lượng

b Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường

Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng với các điều kiện như mô tả mục 2.2.1.3 Tuy nhiên thay đổi pH môi trường nuôi cấy trong khoảng từ 5,2 – 5,8 Sau thời gian nuôi cấy, thu hoạch tế bào Cân xác định khối lượng tế bào tươi

và khô từ đó lựa chọn được pH môi trường nuôi cấy thích hợp

c Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng với các điều kiện như mô tả mục 2.2.1.3 Thay đổi nhiệt độ trong các khoảng khác nhau từ 22-28°C Theo dõi kết quả và lựa chọn nhiệt độ thích hợp

d Lựa chọn chất điều tiết sinh trưởng cho nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy trên môi trường lỏng với các điều kiện như mô tả trong mục 2.2.1.3 Sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau thuộc 2 nhóm auxin

và cytokinin gồm: 2,4- diclorophenoxy acetic acid (2,4-D); Indol butyric acid (IBA) và NAA nồng độ ban đầu 2mg/l, dùng riêng lẻ hay kết hợp với Kinetin nồng độ 0,2mg/l sau thời gian nuôi cấy, cân xác định khối lượng tế bào Từ

đó lựa chọn được chất điều tiết sinh trưởng phù hợp

2.2.1.4 Tối ưu hóa môi trường

Sau khi đã lựa chọn được các chất điều tiết sinh trưởng là NAA và kinetin chúng tôi tiến hành tối ưu hóa nồng độ 2 chất này và nồng độ đường saccarose sử dụng, nhằm đánh giá ảnh hưởng của chúng tới tốc độ phát triển

tế bào cũng như hàm lượng saponin trong tế bào Sử dụng phần mềm thông minh Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm nghiên cứu và phần mềm Inform 3.1

để phân tích ảnh hưởng của các yêu tố cũng như tối ưu hóa các điều kiện của

thí nghiệm [8] Các bước thực hiện tối ưu hóa bao gồm:

Bước 1: Xác định biến đầu vào và biến đầu ra

Biến đầu vào: Biến đầu vào là thành phần môi trường nuôi cấy (các

biến phụ thuộc) ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào cũng như hàm lượng hoạt chất Trong thiết kế nghiên cứu này chúng tôi xác định các biến phụ thuộc là:

- Nồng độ NAA (X1)

- Nồng độ kinetin (X2)

- Nồng độ đường (X3)

Biến đầu ra: Biến đầu ra (biến độc lập) là yếu tố phản ánh tốc độ phát

triển cũng như chất lượng của khối tế bào nuôi cấy Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định biến đầu ra gồm các yếu tố sau:

- Khối lượng tế bào khô sau khi nuôi cấy (Y1) g/l

- Khối lượng saponin toàn phần trong tế bào(Y2) mg/g

Bước 2: Lựa chọn các giá trị của biến đầu vào

Từ các kết quả khảo sát trước đó, tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn vùng giá trị của các biến đầu vào (xem bảng 1) Sử dụng phương pháp thiết kế mặt hợp tử tại tâm với sự trợ giúp của phần mềm thiết kế thí nghiệm tối ưu Modde 5.0 để đưa ra thiết kế thí nghiệm nghiên cứu

Bước 3: Tiến hành thí nghiệm

Thực hiện các thí nghiệm theo thiết kế của mô hình tối ưu mà phần mềm đưa ra, mỗi thí nghiệm được lặp lại 6 lần lấy giá trị trung bình

Bảng 2.1 Ký hiệu và mức của biến đầu vào

Biến đầu vào Kí hiệu Mức dưới Mức cơ sở Mức trên

Bước 4: Xác định giá trị của biến đầu ra của thực nghiệm

Xác định các giá trị biến đầu ra của các thí nghiệm theo thiết kế gồm:

- Khối lượng tế bào khô (Y1): Đánh giá tốc độ phát triển của tế bào

- Khối lượng saponin toàn phần(Y2): Đánh giá hàm lượng hoạt chất (chất lượng của tế bào)

Bước 5 Phân tích ảnh hưởng của các biến đầu ra

Sau khi có số liệu thực nghiệm của biến đầu ra Sử dụng phần mềm INForm 3.1 phân tích, đánh giá ảnh hưởng của các biến đầu vào với các biến đầu ra

Bước 6: Lựa chọn điều kiện tối ưu

Để lựa chọn được các giá trị tối ưu của các biến đầu vào thì cần phải đưa ra được mức độ yêu cầu của biến đầu ra Mục đích của nghiên cứu này là: lựa chọn được nồng độ các chất tối ưu để tế bào phát triển tốt nhất và hàm lượng hoạt chất cao nhất Vì vậy, yêu cầu các biến đầu ra cao nhất (bảng 2) Trong đó, khối lượng saponin toàn phần (Y2) là biến có vai trò quan trọng hơn Do đó, trong quá trình luyện phần mềm tối ưu, chúng tôi tăng mức trọng

số cho biến này gấp 10 lần so với biến về khối lượng tế bào (Y1)

Sử dụng phần mềm tối ưu INForm 3.1 để tối ưu hóa các biến đầu vào,

từ đó đưa ra giá trị tối ưu của các biến đầu vào cũng như kết quả dự đoán của các biến đầu ra

Bảng 2.2 Ký hiệu và mức yêu cầu của biến đầu ra

Khối lượng saponin toàn phần Y2 Mức tối đa

Bước 7: Kiểm chứng các điều kiện tối ưu

Sau khi phần mềm đã lựa chọn được các điều kiện tối ưu Chúng tôi tiến hành làm lại các thí nghiệm nuôi cấy Xác định khối lượng tế bào khô, khối lượng saponin toàn phần để kiểm chứng Kết quả so sánh với dự đoán ban đầu của phần mềm

2.2.1.5 Phương pháp khảo sát các chất kích thích làm tăng hoạt chất

Nuôi cấy trên môi trường lỏng đã tối ưu với các điều kiện như mô tả trong mục 2.2.1.3 Sử dụng các chất kích thích làm tăng hoạt chất khác nhau

và ở nồng độ khác nhau Sau thời gian nuôi cấy, lọc thu tế bào Cân xác định khối lượng khô và định lượng các ginsenosid trong sinh khối như mục 2.2.2.2

Từ đó, lựa chọn được chất kích thích hoạt chất tốt nhất

a Lựa chọn chất kích thích

Sử dụng chất kich thích tăng hoạt chất khác nhau là acid jasmonic, acid ferullic, acid caffeic, metyl jasmonat và dịch chiết nấm men Cho chất này vào ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy Sau đó lọc, thu lấy tế bào và định lượng hoạt chất trong tế bào Từ đó, lựa chọn chất kích thích tốt nhất

b Lựa chọn nồng độ chất kích thích

Sau 12 ngày nuôi cấy, cho tế bào SNL tiếp xúc với acid jasmonic ở các nồng độ: 50, 100, 150, 200, 250 và 300 µM Tiến hành nuôi cấy thêm 2 ngày Sau đó, định lượng hoạt chất trong tế bào Từ đó, lựa chọn nồng độ acid jasmonic thích hợp

c Lựa chọn thời điểm cho elicitor

Nuôi tế bào SNL trong môi trường MS như mô tả trong mục 2.2.1.3 Bổ xung acid jasmonic nồng độ 100µM/l vào môi trường nuôi cấy vào ngày thứ

1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13 và 14 Sau 2 ngày cho acid jasmonic, lọc tế bào, định lượng ginsenosid trong tế bào, từ đó lựa chọn được thời điểm bổ xung elicitor