Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo khối tế bào Thông đỏ Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị ung thư

- Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng cao hơn so với nuôi trồng ngoài tự nhiên, nên kỹ thuật này phù hợ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỌC VIỆN QUÂN Y

ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – HÀN QUỐC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

TẠO KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ VIỆT NAM (Taxus wallichiana Zucc.)

LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

CÁC CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA NGHIÊN CỨU

III CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP NGHIÊN CỨU:

1 Trường Đại học Ajou – Hàn Quốc

2 Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

3 Viện Dược liệu

4 Trung tâm NCƯD Sinh – Y – Dược học – HVQY

5 Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Dược – HVQY

6 Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh lý – Bệnh viện 103 – HVQY

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1 

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

1.1 CÂY THÔNG ĐỎ 3 

1.1.1 Tên khoa học 3 

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 3 

1.1.3 Thành phần hóa học 5 

1.1.4 Tác dụng sinh học 8 

1.2 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 9 

1.2.1 Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai 9 

1.2.2 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 12 

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuôi cấy tế bào thực vật 13 

1.3 SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL 19 

1.3.1 Paclitaxel và nhu cầu nguồn nguyên liệu 19 

1.3.2 Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật 21 

1.3.3 Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ 28 

1.3.4 Phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ SKTB thông đỏ 29 

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31 

2.1.1 Nguyên liệu và hoá chất 31 

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 32 

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 

2.2.1 Xây dựng quy trình tạo sinh khối thông đỏ quy mô phòng thí nghiệm 33 

2.2.2 Phương pháp xây dựng TCCS 43 

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu độc tính và tác dụng kháng tế bào ung thư của paclitaxel chiết xuất từ sinh khối thông đỏ 44 

2.2.4 Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu 50 

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 51 

3.1.1 Kết quả xây dựng quy trình tạo callus thông đỏ 51 

3.1.2 Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng trong bình 250 ml 67 

3.1.3 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít 87 

3.1.4 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 15 lít 88 

3.1.5 Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ 90 

3.1.6 Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 93 

3.1.7 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của sinh khối tế bào thông đỏ 95 

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 129 

3.2.1 Kết quả xây dựng TCCS của cành non thông đỏ 129 

3.2.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của sinh khối thông đỏ 136 

3.2.3 Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của paclitaxel 142 

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 150 

3.3.1 Kết quả đánh giá độc tính 150 

3.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư 160 

KẾT LUẬN 171 

KIẾN NGHỊ 174 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 175 

DANH MỤC CÁC BẢNG  

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn 52 

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn 54 

Bảng 3.3: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy (Đơn vị: mg/l) 55 

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 56 

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 56 

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus 59 

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 60 

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 60 

Bảng 3.9: Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 63  Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 64 

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 65 

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 66 

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 68 

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào 70 

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ 72 

Bảng 3.16 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ 73 

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát triển tế bào 74 

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 75 

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 76 

Bảng 3.20: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào 77 

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 79 

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 80 

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 82 

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 83 

Bảng 3.25: Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 85 

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường 86 

Bảng 3.27: Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít 88 

Bảng 3.28: Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 15 lít 89 

Bảng 3.29: Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ 92 

Bảng 3.30: Khảo sát điều kiện pha động 97 

Bảng 3.31: Chương trình chạy sắc ký 98 

Bảng 3.32: Độ lặp lại của hệ thống 99 

Bảng 3.33: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ paclitaxel 100 

Bảng 3.34: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ baccatin III 100 

Bảng 3.35: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel 102 

Bảng 3.36: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III 102 

Bảng 3.37: Kết quả xác định độ chính xác 103 

Bảng 3.38: Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III 104 

Bảng 3.39: Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử 104 

Bảng 3.40: Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ 106 

Bảng 3.41: Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá thông đỏ tự nhiên bằng HPLC 108 

Bảng 3.42: Số liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) của các các chất 1 – 6 114 

Bảng 3.43: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) của các chất 1 - 6 115 

Bảng 3.44: Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau 118 

Bảng 3.45: Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM (n=6) 119 

Bảng 3.46: Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế paclitaxel (n=6) 120 

Bảng 3.47: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh chế paclitaxel (n=6) 121 

Bảng 3.48: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và hiệu suất tinh chế paclitaxel (n=6) 122 

Bảng 3.49: Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 123 

Bảng 3.50: Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 124 

Bảng 3.51: Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các giai đoạn chiết xuất, tinh chế 125 

Bảng 3.52: Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong cành non thông đỏ 132 

Bảng 3.53: Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 136 

Bảng 3.54: Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 137 

Bảng 3.55: Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ

137 

Bảng 3.56: Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ 139 

Bảng 3.57: Kết quả xác định năng suất quay cực của paclitaxel 143 

Bảng 3.58: Kết quả xác định độ ẩm trong paclitaxel 143 

Bảng 3.59: Kết quả xác định tro toàn phần của paclitaxel 143 

Bảng 3.60: Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng của paclitaxel 144 

Bảng 3.61: Kết quả định lượng nội độc tố có trong paclitaxel 144 

Bảng 3.62: Kết quả xác định sự có mặt của các vi khuẩn trong paclitaxel 146 

Bảng 3.63: Kết quả xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong paclitaxel 146 

Bảng 3.64: Kết quả xác định hàm lượng % các tạp chất trong paclitaxel 146 

Bảng 3.65: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel 147 

Bảng 3.66: Tỷ lệ chuột chết sau tiêm Paclitaxel 151 

Bảng 3.67: Ảnh hưởng của Paclitaxel đối với trọng lượng cơ thể thỏ (n = 12) 152 

Bảng 3.68: Ảnh hưởng của Paclitaxel đối với điện tim thỏ (n = 12) 153 

Bảng 3.69: Chỉ số hồng cầu và huyết sắc tố thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12) 154 

Bảng 3.70: Chỉ số bạch cầu và tiểu cầu thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12) 155 

Bảng 3.71: Hoạt độ AST và ALT (IU/l) của các lô thỏ nghiên cứu (n = 12)156  Bảng 3.72: Nồng độ creatinin và ure máu thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12) 157  Bảng 3.73: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HEP G2 160 

Bảng 3.74: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HEP 3B 160 

Bảng 3.75: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào BT474 161 

Bảng 3.76: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào H211 161 

Bảng 3.77: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HTB85 161 

Bảng 3.78: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào KG-1 162 

Bảng 3.79: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào K-562 162 

Bảng 3.80: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào NCE-Z2 162 

Bảng 3.81: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HT29 163 

Bảng 3.82: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào NCL-N87 163 

Bảng 3.83: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HEP G2 164 

Bảng 3.84: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HEP 3B 164 

Bảng 3.85: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào BT474 164 

Bảng 3.86: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào H211 165 

Bảng 3.87: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HTB85 165 

Bảng 3.88: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào KG-1 166 

Bảng 3.89: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào K-562 166 

Bảng 3.90: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào NCE-Z2 166 

Bảng 3.91: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HT29 167 

Bảng 3.92: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào NCL-N87 167 

Bảng 3.93: Tỷ lệ (%) tế bào HEP G2 trong các pha và Apoptosis (sub-G1)169   

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4 

Hình 1.2: Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5 

Hình 1.3: Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 12 

Hình 1.4: Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 18 

Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel 23 

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính 39 

Hình 3.1: Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 53 

Hình 3.2: Callus trên các môi trường khác nhau 56 

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 57 

Hình 3.4: Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 62 

Hình 3.5: Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH 62 

Hình 3.6: Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 68 

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 69 

Hình 3.8: Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong bioreactor 91 

Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 94 

Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết lỏng -lỏng (a) và lỏng - rắn (b) 95 

Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha động III sử dụng cột Luna L43 97 

Hình 3.12: Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) 98 

Hình 3.13: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b) 99 

Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ paclitaxel 100 

Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ baccatin III 101 

Hình 3.16: Sắc ký đồ các mẫu phân tích 107 

Hình 3.17: Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9 116 

Hình 3.18: Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột 123 

Hình 3.19: Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel 125 

Hình 3.20: Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ 128 

Hình 3.21: Ảnh vi phẫu cành non thông đỏ 130 

Hình 3.22: Các đặc điểm của bột cành non thông đỏ 130 

Hình 3.23: Sắc ký đồ HPLC của chuẩn (a) và cành non thông đỏ (b) 131 

Hình 3.24: Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b)

138 

Hình 3.25: Một số hình ảnh tế bào trong nghiên cứu 168 

Hình 3.26: Ảnh điện di ADN tổng số 169 

Hình 3.27: Sự di cư của tế bào ung thư phổi 170 

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

10-DAB 10-deacetylbaccatin III 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid CAN Acetonitril

BAP 6-Benzyl amino purin

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

IAA Indole – 3 acetic acid

IBA Indole – 3 butyric acid

MS Môi trường Murashige – Skoog

SH Môi trường Hildebrandt

SKTB Sinh khối tế bào

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

USP Dược điển Mỹ

VSO4 Vanadyl sulfat

Xyl Xylosyl

1

MỞ ĐẦU

Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ yếu tại

khu vực dãy núi Hymalaya Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ Từ lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá ; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol), cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol… Tuy nhiên, thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong cây thấp Theo tính toán của các nhà khoa học, để điều trị khỏi cho một bệnh nhân cần sử dụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60 năm tuổi Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125]

Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã nhân giống thành công và trồng rộng rãi thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6] Hiện nay, Bộ Khoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về nghiên cứu chiết xuất phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ

ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thuốc điều trị ung thư phục vụ cộng đồng Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125]

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm

2

mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các hoạt chất [46], [53] Công nghệ sinh khối tế bào có ưu điểm so với việc gieo trồng ngoài tự nhiên là: thời gian từ khi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn, không chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, dịch bệnh, thời vụ; chất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thể được cải thiện hơn so với trồng ngoài tự nhiên Công nghệ này rất thích hợp cho việc sản xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó tổng hợp bằng con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong cây tự nhiên Từ công nghệ sinh khối tế bào thực vật, các nhà khoa học đã cung cấp cho thị trường những sản phẩm có giá trị phục vụ cho ngành công nghiệp Dược phẩm

và thực phẩm [9], [53]

Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng công nghệ sinh

khối tế bào thực vật, đề tài: “Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo

khối tế bào thông đỏ Việt Nam (Taxus wallichiana Zucc.) làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu:

1 Xây dựng được quy trình công nghệ sinh khối tế bào Thông đỏ Việt Nam quy mô phòng thí nghiệm

2 Xây dựng được tiêu chuẩn nguyên liệu cành non thông đỏ, tiêu chuẩn

cơ sở của sinh khối tế bào Thông đỏ Việt Nam và kiểm định hàm lượng hoạt chất chiết xuất từ sinh khối tế bào Thông đỏ Việt Nam

3 Đánh giá độc tính, tác dụng kháng tế bào ung thư của hoạt chất chiết

xuất từ sinh khối tế bào Thông đỏ

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY THÔNG ĐỎ

Cây thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng được phân bố khắp các vùng

ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm Có nhiều loài thông đỏ trên thế giới trong đó 8 loại được ghi nhận bao gồm: thông đỏ Châu

Âu (T baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia); thông đỏ Canada (T canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T chinensis), thông đỏ Nhật Bản (T cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T floridana); thông đỏ Mexico (T globosa) và thông đỏ Himalaya (T wallichiana) – loài thấy có ở cao nguyên

Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta Ngoài ra, còn có hai giống lai được công

nhận: Taxus × media = T baccata × T cuspidata và Taxus × hunnewelliana

= T cuspidata × T canadensis

Tại Việt Nam chủ yếu là loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (hình 1.1) Ngoài ra tại các vùng Sapa – Lào Cai,

Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai

Châu còn có thêm loài thông đỏ Trung Quốc (T chinensis) [1] Trong đề tài này đề cập tới loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana Zucc.) mọc ở Đà

Lạt được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu tạo sinh khối tế bào

4

khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân Các nón cái bị suy giảm mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm, nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim ăn và nhờ đó mà hạt được phát tán khi chim đánh rơi chúng [1]

Hình 1.1: Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

Tại Việt Nam, thông đỏ phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến

1.700 m (hình 1.1) Khu phân bố là các hẻm núi, cạnh khe suối, nơi cây lá

rộng thường chiếm ưu thế, rất ít cây lá kim Đây là dược liệu có trong sách

đỏ Hiện nay, do nạn phá rừng bừa bãi nên quần thể thông đỏ tự nhiên hiện chỉ còn đếm được ở con số hàng trăm cá thể Mặt khác, vì đặc tính tái sinh hẹp và thế hệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây rừng thông đỏ rất cao Hiện nay, tại Đà Lạt đã có nhiều dự án nghiên cứu nhân giống thành công bằng công nghệ nuôi cây mô và giâm cành Kết quả đã phát triển được hàng chục hecta thông đỏ để thu hái lá dùng trong chiết xuất 10-DAB và các dẫn chất khác để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]

Photo by: Vu Binh Duong

5

Tuy nhiên, thông đỏ vẫn là những cây đã được đưa vào sách đỏ thế giới và sách đỏ Việt Nam để lưu ý bảo vệ [3]

1.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chủ yếu từ lá, vỏ thân và cành của loài T wallichiana

đã được nghiên cứu từ hơn một trăm năm nay bao gồm các nhóm hoạt chất sau: alcaloid hoặc diterpenoid khung taxan, steroid, lignan, biflavonoid và các dẫn xuất của đường [82], [136]

1.1.3.1 Các hợp chất vòng taxan diterpenoid

Các hợp chất diterpenoid khung taxan là thành phần tiêu biểu quan trọng nhất tạo nên hoạt tính của cây thông đỏ Hiện nay, các nhà khoa học đã phát

hiện được trên 50 chất diterpenoid khung taxan trong loài Taxus wallichiana

Zucc [6] Trong đó nhiều chất quen thuộc có trong các loài khác thuộc chi

Taxus như: paclitaxel (5), baccatin III (1), 10-deacetyl baccatin III (3) Khung

taxan diterpenoid là một khung gồm 20 carbon, trong đó có 4 loại khung khác

nhau gồm: khung 6-8-6, khung 5-7-6, khung 6-10-6 và khung 6-12 (hình 1.2)

Trong đó, các chất phân lập được đa số thuộc khung 6-8-6 và 5-7-6

19

20 18

17 16 15 14 13

12

11 10 9

8 7 6 5 4 3 2 1

12 11

10 9 8 7 6 5 4 3

2 1

12 11 10 9

8 7 6 5 4 3 2 1

Khung 6-10-6 Khung 6-12 Hình 1.2: Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ

6

Trong 4 bộ khung taxan thì các chất thuộc khung taxan 6-8-6 rất đáng chú

ý với nhiều các hoạt chất quan trọng như baccatin III, 10-DAB, paclitaxel

R4

1

O OBz

R2

R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 TLTK

Baccatin III (1) OH H OAc OH OH [145]

19-Hydroxybaccatin III (2) OH OH OAc OH OH [95] 10-Deacetylbaccatin III (3) OH H OH OH OH [145] Các hợp chất baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 19-hydroxybaccatin III

có nhiều trong lá thông đỏ Đặc biệt, trong đó 10-deacetyl baccatin III có hàm lượng khoảng 0,01 - 0,15% là nguồn nguyên liệu quý dùng để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]

R2

HO

R4

O Ph

O

O HO

Paclitaxel (taxol) (5) OH OAc OBz OBz [136] 10-deacetyltaxol-7-xylosid (6) O-Xyl OH OBz OBz [82]

7-Xylosyl-10-Deacetyltaxol C (8) O-Xyl OH C5H11 OBz [122]

10-deacetylcephalomannin (10) OH OH OBu(i) OBz [95]

7

Trong các hoạt chất tìm thấy tác dụng thì nhóm các chất thuộc bộ khung

6-8-6 chiếm đa số, điển hình là paclitaxel (5) Paclitaxel được tìm ra lần đầu

tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs [136] trong loài thông đỏ Thái Bình Dương

(T brevifolia), sau đó được phân lập ở tất cả các loài thông đỏ khác, trong đó

hàm lượng paclitaxel trong thông đỏ khoảng 0,0045 – 0,015% [3]

1.1.3.2 Các chất khác

a) Các terpenoid khác

Ngoài các taxan diterpenoid, trong thông đỏ còn có các terpenoid khác

như: rhodoxathin (11), vomifoliol (12), dehydrovomifoliol (13) và

15

OH OH

O

OH

OH OH

16

O

OH

OH O

17

OH OH OH

OH

Trong nghiên cứu in vitro đã cho thấy rằng larciresinol và isolarciresinol

8

có tác dụng ức chế mạnh yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và taxiresinol được cho là có tính bảo vệ cao chống lại các tổn thương dạ dày

c) Các biflavonoid

Các hợp chất flavonoid được tìm thấy ở đây chủ yếu trong thông đỏ là các

flavonoid dimeric kiểu amentoflavone như: Ginkgetin (18), sciadopitysin (19)… [39], [115], [117]

19

d) Các steroid

Các hợp chất steroid quen thuộc cũng được phát hiện trong loài T

wallichiana như: β-sitosterol (20), stigmasterol (21)… mà hoạt tính của các

chất này đã được biết đến [20], [115], [142], [145]

HO

20

HO

21

Ngoài ra các đường khử, acid kojic và tanin… đã được phát hiện trong tất

cả các loài thông đỏ [142] nhưng không mang nhiều ý nghĩa và không được chú ý nghiên cứu nhiều, được xem là các tạp chất cần loại bỏ trong quá trình phân tách

1.1.4 Tác dụng sinh học

Cao lá thông đỏ, cho chuột cống trắng cái uống liều 100 và 500 mg/kg, trong những ngày 1-7 sau khi giao hợp, có tác dụng ức chế sự thụ thai đến 60% và 80% tương ứng [3]

Vỏ cây, lá và hạt thông đỏ có độc tính cao

9

Alcaloid taxin từ thông đỏ gây các triệu chứng độc: nôn, tiêu chảy, mê sảng, có tác dụng ức chế tim làm giảm lực co cơ tim, giảm nhịp tim và phong

bế nhĩ thất do tác dụng ức chế kênh natri và calci [3]

Phân đoạn flavonoid từ lá thông đỏ gồm 3 biflavonoid (sciadopitysin, gingetin và sequoiaflavon) có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương và giảm đau mà không gây ngủ

Đặc biệt paclitaxel phân lập từ cây thông đỏ có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh với các loại ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày, ruột

1.2 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1 Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai

1.2.1.1 Một số khái niệm cơ bản

Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn mà không cần thâm canh gieo trồng Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ nguyên [9], [73], [111]

Nguyên tắc của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng (totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật Khi được đưa vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, các tế bào thực vật có thể phát triển thành một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dòng tế bào đó Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo ra cây

từ đỉnh sinh trưởng được tách ra Sau đó, cây được nhân nhanh tạo ra nhiều mầm cây con, từ đó có thể kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây Sau

đó, biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cùng cũng phát triển thành một cây mới hoàn chỉnh [57], [112]

Khác với nuôi cấy mô, công nghệ sinh khối tế bào thực vật không nuôi

10

cấy tạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi các tế bào để tạo ra sinh khối và có thể

sử dụng cho chiết tách các hoạt chất sinh học Quá trình này cũng bắt đầu từ việc tạo ra callus từ những mô khác nhau của thực vật Sau đó, chúng được làm mất tính biệt hóa và được thuần hóa trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống bình nuôi cấy (bioreactor ) Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, đặc tính của tế bào được giữ nguyên như ban đầu Các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với

tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên, trong đó có việc tổng hợp và tích lũy hoạt chất [53], [59]

1.2.1.2 Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật

- Công nghệ sinh khối tế bào thực vật không chịu tác động của các yếu tố

tự nhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai do toàn bộ quy trình tạo sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm hoặc nhà máy Điều này giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiên tới năng suất, chất lượng sản phẩm và loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo

trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất [9], [19]

- Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trong môi trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian Tuy nhiên, sau khi đã lựa chọn được điều kiện, môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất một mẻ sinh khối thường khoảng từ 15 - 50 ngày Như vậy, thời gian đã rút ngắn rất nhiều

so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục

vụ sản xuất [9] Theo Guilk và cs (2006) trong nghiên cứu xây dựng quy trình

tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid

nhân indole, thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày [56] Trong khi

sản xuất sinh khối thông đỏ Châu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thích hợp

cho 1 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường lỏng là 28 ngày [107]

11

- Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ sinh khối tế bào thực vật rất ổn định Vì các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, thành phần môi trường, cường độ ánh sáng đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho tế bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định Do đó, sản phẩm thu được có chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP [7], [57], [59]

- Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng cao hơn so với nuôi trồng ngoài

tự nhiên, nên kỹ thuật này phù hợp với các dược liệu có hàm lượng hoạt chất thấp hoặc các chất rất khó tổng hợp hóa học được như: taxol, vinblastin, vincristin, shikonin, reserpin Nghiên cứu về sinh khối tế bào thông đỏ cho thấy khi sử dụng các biện pháp kích thích làm tăng hoạt chất thì hàm lượng

hoạt chất cao hơn trong cây tự nhiên từ 10 - 15 lần [148] A Y Khosroushahi

[72] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ đã tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy Kết quả hàm lượng paclitaxel đã cải thiện rất nhiều so với ban đầu

- Đối với các dược liệu quí hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá thành sản xuất sẽ thấp hơn Vì trong thời gian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí nguyên liệu cho nuôi cấy thấp [111], [132]

1.2.1.3 Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào, đó là thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ oxy hòa tan,

pH môi trường và đặc điểm cấu tạo của hệ thống bình nuôi cấy) Chi phí đầu

tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng cho phù hợp với từng loại tế bào [109], [119] Hàm lượng các hoạt chất trong sinh khối tế bào còn thấp, đặc biệt là với các tế bào có nhiều nhóm hoạt chất cùng tồn tại thì việc kích thích tăng riêng rẽ hàm lượng từng nhóm chất rất khó khăn [9] Những khó khăn trên đang được các nhà

12

khoa học tập trung nghiên cứu khắc phục

1.2.2 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật

Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật thường được tiến hành theo năm

giai đoạn kế tiếp nhau [9] (Hình 1.3)

* Giai đoạn 1: Tạo callus

Callus là dòng tế bào ban đầu, chưa biệt hóa được tạo ra trong phòng thí nghiệm, tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây Callus được hình thành từ các mô, các tế bào được tách ra từ cơ thể thực vật nhờ tác động của chất kích thích sinh trưởng Trong giai đoạn này, ngoài thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thì kỹ thuật vô khuẩn được xem

là yếu tố quan trọng nhất [9]

* Giai đoạn 2: Duy trì nuôi cấy callus trong môi trường thạch mềm

Việc duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào thích nghi hoàn toàn với điều kiện sống mới (tách ly hoàn toàn ra khỏi cơ thể mẹ) Đồng thời, nó làm cho tế bào có hình thái mềm, xốp, có đủ sức sống và đặc biệt làm mất khả năng biệt hoá thành các cơ quan bộ phận khác Điều này tạo thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang môi trường nuôi cấy lỏng

Hình 1.3: Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật

a - Tạo callus; b - Duy trì nuôi cấy callus; c - Nuôi cấy trong môi trường lỏng; d - Khuếch đại qui mô nuôi cấy; e - Thu hoạch sinh khối

13

* Giai đoạn 3: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng

Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm lượng hoạt chất của sinh khối Trong giai đoạn này, phải khảo sát đầy đủ các yếu tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, nhằm mục đích cho sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối cao nhất [7], [116]

* Giai đoạn 4: Nâng cấp quy mô nuôi cấy (scale-up)

Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để tăng khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các bình nuôi cấy có thể tích khác nhau tùy theo quy mô Ở giai đoạn này, các yếu tố về điều kiện sản xuất như loại bình nuôi cấy, kiểu cánh khuấy, phân áp oxy hòa tan

là những yếu tố cần phải khảo sát Trong quy trình sản xuất taxol và shikonin, người ta đã sử dụng các bioreactor 10.000 và 75.000 lít [119], [125]

* Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào

Thu hoạch khối tế bào là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy Thông thường, các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào nên phương pháp lọc lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm Tuy nhiên, có một số trường hợp hoạt chất lại được giải phóng ra ngoài môi trường nên việc thu hồi các hoạt chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém [111] Các hoạt chất sau khi tách chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng sinh học và bào chế sản phẩm

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuôi cấy tế bào thực vật

1.2.3.1 Môi trường nuôi cấy

* Loại môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường là một trong hai nhóm yếu tố quyết định thành công của quá trình tạo sinh khối Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế bào phát triển Đồng thời, môi trường cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh

lý, sinh hóa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất Các nhà

14

khoa học đã thiết lập được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối vô cơ khác nhau [47] Môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS) Bên

cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như B5, Nitsch, White [46]

* Vai trò của một số yếu tố trong môi trường nuôi cấy

- Nguồn hydratcarbon

Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát triển khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây Các đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose , có thể

sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong quá trình nuôi cấy [130]

Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào mà còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Vì khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy làm tăng áp lực thẩm thấu và tác động vào tế bào thì nó kích thích làm tăng tổng hợp các phytoalexin [11],

[102] Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào Coleus blumei Benth cho thấy khi

dùng saccharose 7,5% trong môi trường nuôi cấy, thì hàm lượng hoạt chất là 3,3 g/l, nếu dùng saccharose 2,5% thì hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94]

Vì vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu hóa loại và nồng độ đường nhằm đảm bảo cho tế bào phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất

- Hormon thực vật

Hormon thực vật hoặc các chất kích thích sinh trưởng rất cần thiết đối với các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế bào Hormon thực vật thường dùng trong sinh khối gồm 2 nhóm chính:

+ Nhóm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50

1-µM dùng làm chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào Đặc biệt, trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất không thể thiếu nhất là ở

15

giai đoạn nuôi cấy tạo callus [11], [44], [64]

+ Nhóm cytokinin: gồm kinetin và benzyladenin có vai trò làm tăng sinh tổng hợp nguyên liệu di truyền, kích thích quá trình sinh trưởng làm cho tế bào phát triển nhanh hơn Các chất này thường được sử dụng kết hợp với nhóm auxin như 2,4-D, NAA Mỗi loại tế bào thực vật khác nhau yêu cầu nồng độ hormon thực vật khác nhau cho sự phát triển của tế bào cũng như tạo các sản phẩm thứ cấp của nó Việc lựa chọn các chất kích thích sinh trưởng thích hợp nhất đối với mỗi loại thực vật là một khâu trong quá trình nghiên cứu tạo sinh khối [44], [119]

Ngoài 2 nhóm trên, các chất khác: acid gilberilic và các ethylen cũng có thể được sử dụng để kích thích tăng tổng hợp hoạt chất [67]

- Các biện pháp kích thích làm tăng hàm lượng hoạt chất

Các kỹ thuật phổ biến để tăng tích lũy hoạt chất là: dùng các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) hoặc các tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất, kỹ thuật nuôi cấy 2 pha, nghiệm pháp gen kích hoạt, bất động tế bào, nuôi cấy 2 giai đoạn Trong đó, các elicitor chất làm tăng hàm lượng hoạt chất thường được sử dụng Elicitor là các chất có bản chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác dụng kích thích tạo các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào thực vật, trong đó có việc kích thích làm tăng sinh tổng hợp các hoạt chất Bình thường, hệ thống tự bảo vệ trong tế bào được khởi động khi có tác nhân

có hại tác động vào tế bào [22], [65]

Những chất có khả năng kích thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là các elicitor Elicitor liên kết với receptor trên màng tế bào Các tín hiệu của elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp (kênh ion, GTP, phân tử oxy hoạt động, inositol 1,4,5 - trisphosphate, các enzym, các chất trung gian dẫn truyền ) dẫn đến kết quả cuối cùng kích thích sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp, nhằm bảo vệ tế bào, trong đó có các hoạt chất

16

sinh học [65] Elicitor được chia làm 2 loại:

+ Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): gồm các chất (nội sinh hay ngoại sinh)

có nguồn gốc từ các cơ thể sống: thực vật, vi sinh vật, nấm Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) là những thành phần đã có hoạt tính kích thích tổng hợp hoạt chất Elicitor nội sinh (endogenous elicitor) là sản phẩm tương tác của chính các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra Đây là các chất kích thích

sinh tổng hợp hoạt chất thực sự [102]

+ Elicitor vô sinh (abiotic elicitor): là các chất các yếu tố không có nguồn gốc từ cơ thể sống gồm các chất hoá học tổng hợp (acid salicylic, acid benzoic, acid ferulic, acid jasmonic ), các yếu tố vật lý (ánh sáng, tia tử ngoại, nhiệt độ ), ion kim loại nặng và những tổn thương cơ học [102] Khi tiến hành nghiên cứu sử dụng các elicitor, cần phải lựa chọn được loại

và nồng độ elicitor cũng như thời gian tiếp xúc của từng loại elicitor thích hợp cho từng loại tế bào

- Các nguyên tố đa lượng

Bao gồm các loại muối của nitơ, phospho, kali, calci, magnesi và sulfua Đây

là các nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao Nếu cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ để sinh trưởng và phát triển, thì để nuôi cấy thành công những tế bào chưa biệt hóa, đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn nitơ

và các ion vô cơ như phospho, kali, calci, magne, mangan và sulfua Trong đó, nguồn nitơ thường chiếm tỷ lệ cao [85] Nguồn nitơ được đưa vào dưới dạng các muối amoni hoặc nitrat như NH4NO3, NaNO3 hoặc kết hợp với các muối khác như NH4H2PO4 và Ca(NO3)2 Tuy nhiên, việc cân đối giữa tỷ lệ NH4+ /NO3- rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất có trong sinh khối tế bào [11] Theo S Lui và cs [86] trong sinh khối tế bào sâm Hoa Kỳ

(Panax notoginseng Wall.) hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệ NH4+/NO3-giảm Nhưng nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây độc cho tế bào và hàm lượng saponin lại giảm

17

- Các nguyên tố vi lượng

Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, đồng, molybden và coban ở dạng vi lượng Các vi khoáng chất là những thành phần không thể thiếu đối với tế bào thực vật Các chất này đóng vai trò như là các coenzym tham gia vào các quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào Đặc biệt, chúng tham gia vào kích hoạt các enzym của quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất [86], [99]

- Các phụ gia hữu cơ

Một lượng nhỏ các loại vitamin (myoinositol, thiamin, acid nicotinic, pyridoxine, riboflavin ) đóng vai trò là các coenzym tham gia các quá trình chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào Các acid amin (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng) và các phụ gia hữu cơ khác (dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa, một số dịch chiết từ thực vật ) cũng chứa các yếu tố tăng trưởng góp phần kích thích tế bào phát triển Vì vậy, chúng được thêm vào môi trường nuôi cấy, góp phần làm tế bào phát triển tốt hơn [65]

1.2.3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

* Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới tốc độ phát triển của tế bào và sinh tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp Tốc độ phát triển của các tế bào sinh vật nói chung và tế bào thực vật trong công nghệ sinh khối nói riêng đều theo một

đường cong phát triển Đường cong này gồm có 4 pha (Hình 1.4) [18]

- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase): tại pha này, các

tế bào thực vật gần như không phát triển, nó đang thích nghi với điều kiện và môi trường nuôi cấy mới

- Pha phát triển (exponent phase): ở pha này các tế bào đã trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm lũy thừa, khối tế bào phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy

đủ chất dinh dưỡng, tế bào có thể phát triển tối đa

18

- Pha dừng (stationary phase): các tế bào gần như không phát triển và nhân lên nữa Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tới hằng định Trong pha này, các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp Pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao Vì vậy, cần phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào, nhằm kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp [119], [125]

Hình 1.4: Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian

- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase): trong pha này các tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm Biểu hiện bên ngoài là thay đổi màu sắc tế bào và môi trường nuôi cấy, pH môi trường thay đổi Như vậy, cần phải xác định điểm kết thúc của quá trình nuôi cấy, đó là thời điểm trước khi chuyển sang pha ly giải Khi đó sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất và không bị lãng phí môi trường [9]

* Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào thực vật và sự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp Mỗi loại tế bào thực vật có một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định Nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế bào ngừng phát triển hoặc chết đi, nhiệt độ quá cao sẽ gây chết tế bào Trong khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật, thường có một nhiệt độ tối ưu Tại

19

nhiệt độ này, sự phát triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa Tuy nhiên, khác với vi khuẩn và vi nấm, tế bào thực vật thường thích nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 - 280C [7], [69]

* pH môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và sinh tổng hợp của hoạt chất sinh học vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Tuy nhiên, mô thực vật có khả năng thích nghi lớn với sự thay đổi của pH Trong môi trường nuôi cấy,

pH có thể được điều chỉnh bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp [32], [55]

* Nồng độ oxy hoà tan

Nhìn chung, sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí đều cần sự có mặt của oxy Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật Tốc độ phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy Trong thực tế, các

tế bào thực vật phát triển tương đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp cho tế bào không cần cao [37], [119]

1.3 SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL 1.3.1 Paclitaxel và nhu cầu nguồn nguyên liệu

1.3.1.1 Paclitaxel

Paclitaxel được phân lập lần đầu tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs [136]

từ loài thông đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia), sau đó chúng được xác định

cấu trúc hóa học và được đưa vào sử dụng đầu tiên trong điều trị ung thư vào năm 1992 dưới tên biệt dược là Taxol

* Cơ chế tác dụng chống ung thư của paclitaxel

Paclitaxel ức chế sự phân rã mạng lưới vi thể của thoi nhiễm sắc; nó kích thích quá trình ghép các dimer của vi ống thành mạng lưới vi thể và ổn định mạng lưới vi thể bằng cách ngăn chặn quá trình tháo xoắn của chúng Tính ổn

20

định này ức chế sự tái tổ chức năng lượng bình thường của mạng lưới vi thể, một hiện tượng chủ yếu của chức năng sống của tế bào trong kỳ trung gian của quá trình phân bào, làm cho tế bào không phân chia và nhân lên được Ngoài ra, paclitaxel còn gây ra sự hình thành không bình thường các nhóm hay bó của mạng lưới vi thể trong suốt chu kỳ của tế bào và tổ chức quá trình phân chia thể sao của mạng lưới vi thể trong quá trình nhân đôi [79], [139]

* Chỉ định [2]

- Điều trị ung thư buồng trứng tiến triển (> 1 cm) sau phẫu thuật Ngoài ra còn dùng trong điều trị ung thư buồng trứng đã di căn

- Điều trị ung thư vú giai đoạn sớm, ung thư vú đã di căn

- Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở giai đoạn không thể phẫu thuật hoặc xạ trị Ngoài ra, paclitaxel còn dùng để điều trị ung thư Kaposi có liên quan đến bệnh AIDS

21

1.3.1.2 Nhu cầu paclitaxel trong điều trị ung thư

Paclitaxel là một trong những loại thuốc chống ung thư thành công nhất được phát triển trong 50 năm qua Bình quân mỗi năm doanh số bán hàng trên toàn thế giới của paclitaxel trên 1,5 tỷ USD - số liệu năm 1999 của Bristol Myers Squibb (công ty độc quyền nhãn hiệu Taxol) Tuy nhiên nếu như paclitaxel chỉ được chiết xuất từ các loài thông đỏ thì không thể đáp ứng được nhu cầu điều trị ung thư cho nhân loại bởi: thông đỏ là loại cây có tốc độ sinh trưởng chậm, mỗi năm bình quân cây phát triển thêm từ 2-3 cm đường kính, không những thế hàm lượng hoạt chất trong cây rất thấp (0,001-0,05%) Để được 1 kg hoạt chất cần 10.000 kg vỏ cây hoặc 3000 cây thông đỏ [125] và điều trị một bệnh nhân ung thư khỏi bệnh cần chặt hạ khoảng tám cây thông

đỏ 60 tuổi Ngoài ra, chiết xuất paclitaxel cũng đòi hỏi một hệ thống thiết bị

phức tạp và kỹ thuật tinh chế đặc hiệu sử dụng công nghệ tiên tiến và đắt tiền Trong khi việc tổng hợp toàn phần paclitaxel và các chất dẫn chất chỉ mang giá trị khoa học mà không có giá trị ứng dụng thực tiễn do các hợp chất này

có cấu trúc hoá học phức tạp gồm nhiều loại đồng phân như hình học, quang học [61] Cho tới nay mới chỉ nghiên cứu việc bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel từ các chất trung gian như baccatin III hoặc 10-deacetylbaccatin III

chiết xuất trong lá của các loài Taxus Với những khó khăn trên, việc tạo ra

được nguồn paclitaxel và các dẫn chất tương tự thay thế có tính ổn định, bền vững và thân thiện với môi trường là rất cần thiết Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là phương pháp có nhiều lợi thế bởi: công nghệ không phải chịu ảnh hưởng của thời tiết, mùa hoặc lây nhiễm, thời gian tạo nguồn ngắn, hàm lượng hoạt chất có thể được cải thiện so với nuôi trồng tự nhiên [130] Đây là công nghệ đang được ứng dụng phổ biến trong sản xuất paclitaxel và các dẫn

chất từ tế bào các loài thông đỏ (Taxus sp.)

1.3.2 Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Hiện nay công nghệ sinh khối tế bào thực vật đã áp dụng trong nghiên cứu

1.3.2.1 Con đường sinh tổng hợp paclitaxel

Paclitaxel được hình thành chủ yếu từ nguyên liệu ban đầu là các phân tử

geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (xem hình 1.5)

Việc nghiên cứu tìm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thông

đỏ, góp phần cung cấp các hiểu biết về phản ứng cũng như các enzyme tham gia phản ứng Từ đó giúp các nhà khoa học nghiên cứu các biện pháp kích hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine,

sử dụng elicitor, các chất kích hoạt enzym [41], [125]

23

Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel

24

1.3.2.2 Lựa chọn các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất cao

Dòng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, các tế bào có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng hoạt chất khi nuôi cấy các dòng tế bào khác nhau Điều này là do có sự khác biệt

về gen dẫn đến sự khác biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất Vì vậy, trong quá trình nghiên cứu phải tạo ra được những dòng tế bào phát triển nhanh có khả năng tạo hoạt chất với hàm lượng cao K.Bunakova và cs [30]

khi nghiên cứu nuôi cấy 9 dòng dòng tế bào T baccata khác nhau thì chỉ có

một dòng cho thấy sự cải thiện sản lượng (23,2 µg/g khối lượng khô) Trong một nghiên cứu khác của cùng một nhóm, dòng tế bào được K.Brunakova lựa chọn và nhân bản vô tính sau 20 tháng kích hoạt tạo callus, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt tới 0,0109% [31]

1.3.2.3 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động và ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Trong nuôi cấy các loại thông đỏ, 2 môi trường thường được sử dụng là SH và B5 Tuy nhiên, các thành phần thường được thay đổi để tốc độ phát triển của tế bào tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất Các thành phần này thường là:

* Nguồn hydratcarbon

Hydratcarbon không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào, mà còn ảnh hưởng đến các con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Bởi hydratcarbon trong môi trường tạo ra áp suất thẩm thấu Khi áp suất thẩm thấu tăng, tác động vào tế bào, sẽ làm tăng tổng hợp các phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản phẩm thứ cấp [60], [72], [97]

* Các hormon thực vật

Hormon thực vật hoặc chất kích thích sinh trưởng là chất rất cần thiết đối

25

với sự phát triển cũng như biệt hóa của các dòng tế bào, đặc biệt là khi tế bào

đã tách ra khỏi cơ thể ban đầu Trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ, thường sử dụng 2 nhóm chất kích thích sinh trưởng chính là auxin (NAA; 2,4-D; 2,4,5-T, picloram) và cytokinin (kinetin, BAP) Thông thường, 2 nhóm chất này được sử dụng kết hợp với nhau Các hormon thực vật được sử dụng với nồng độ cao ở giai đoạn pha phát triển với mục đích tăng sinh tế bào Tuy nhiên, khi chuyển sang môi trường nuôi cấy để sản xuất hoạt chất, thì hàm lượng các hormon thực vật sử dụng với nồng độ thấp hơn [27], [72]

* Các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)

Chất kích thích tăng hoạt chất đã được sử dụng như một chất quan trọng trong việc tăng hàm lượng paclitaxel và các dẫn chất trong nuôi cấy tế bào của các loài thông đỏ Một số loại elicitor đã được sử dụng như: dịch chiết tế

bào của các loài vi khuẩn (Penicillium minioluteum, Botrytis cinerea, Verticillium dahlliae, Gilocladium delicquecesens); chitosan glutamate;

lichenan; các polysaccharid phức hợp từ thành tế bào vi khuẩn, các acid ferulic, arachidonic và benzoic; các elicitor vô sinh như: La+3, V+2, Co+2, Ag+[119] Trong đó, acid jasmonic và dẫn chất (methyl jasmonat, ethyl jasmonat)

đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình dẫn truyền các tín hiệu điều chỉnh gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hoạt chất [102] Vì vậy, các chất này đã được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong việc tăng sinh hoạt chất Y Yukimune và cs [144] thêm 100 µM MJ vào

ngày thứ 14 của chu kỳ nuôi cấy tế bào T baccata Kết quả, hàm lượng

paclitaxel tăng từ 0,4 mg/l lên 48,3 mg/l và baccatin III tăng từ 0,4 mg/l lên

53,6 mg/l so với nhóm chứng Nghiên cứu của Y.D Wang [135] ở loài T chinensis cho thấy, khi thêm 100 µM MJ vào ngày thứ 7, thì sau 14 ngày nuôi

cấy, tất cả các hoạt chất đều tăng hơn so với nhóm không dùng MJ (paclitaxel tăng từ 412 µg/g lên 3,153 µg/g, bacatin III từ 7 µg/g lên 69 µg/g, 10-deacetyl baccatin III từ 203 µg/g lên 456 µg/g)

26

* Tiền chất (precursor)

Một chiến lược trong việc tăng sinh hoạt chất là sử dụng các tiền chất trong quá trình nuôi cấy, giúp làm giảm thời gian sinh tổng hợp các hoạt chất Tuy nhiên, việc bổ sung tiền chất phải dựa trên hiểu biết về con đường sinh tổng hợp của hoạt chất đó Với paclitaxel, quá trình sinh tổng hợp bắt đầu từ các phân tử isopentenyl diphosphat trải qua nhiều phản ứng trung gian để tạo

ra khung cơ bản taxan (10-deacetyl baccatin III, baccatin III) trước khi phản ứng với phenylalanin dạng Coenzyme A để tạo ra cấu trúc cơ bản của

paclitaxel (hình 1.5) [125] Vì vậy, các nhà khoa học đã bổ sung tiền chất

phenylalanin vào môi trường nuôi cấy, nhằm tăng nhanh việc hình thành sản

phẩm paclitaxel Khi nuôi cấy loài T baccata, người ta đã bổ sung

phenylalanin kết hợp với sử dụng AgNO3, VSO4, CoCl2 để kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất Kết quả, hàm lượng paclitaxel cao hơn gấp 5-6 lần (13,75 mg/l) so với nhóm chứng (2,5 mg/l) [72]

1.3.2.4 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, thường sử dụng các chiến lược nhằm tăng sinh hoạt chất cho tế bào Các chiến lược đó bao gồm:

* Nuôi cấy 2 giai đoạn (two stage culture system)

Quá trình phát triển của tế bào trải qua 4 giai đoạn khác nhau: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn suy tàn Trong

đó, giai đoạn phát triển là giai đoạn tế bào tăng sinh nhanh, tạo ra khối lượng lớn tế bào; còn giai đoạn ổn định diễn ra quá trình sinh tổng hợp hoạt chất Vì vậy, hiện nay người ta đã sử dụng hệ thống nuôi cấy 2 giai đoạn, với 2 môi trường khác nhau cho giai đoạn phát triển và giai đoạn ổn định Trước hết, cần tạo được môi trường thuận lợi ở giai đoạn phát triển, để tế bào phát triển tốt nhất, thu được khối lượng tế bào cao nhất Khi tế bào chuyển sang giai đoạn ổn định, sẽ chuyển sang môi trường mới, giúp duy trì và kéo dài giai đoạn ổn định, nhằm làm cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất được kéo dài

27

hơn Ngoài ra, trong giai đoạn này có thể bổ sung các tiền chất và các elicitor góp phần kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất ở mức cao nhất Chiến lược này đã được sử dụng thành công để cải thiện việc sản xuất paclitaxel và baccatin III khi nuôi cấy các loài thông đỏ trong môi trường lỏng Khi nuôi

cấy dòng tế bào T baccata, J Palazon và cs [108] đã sử dụng môi trường B5

có bổ sung saccharose (0,5%), fructose (0,5%), NAA (2,0 mg/l), BAP (0,1 mg/l) giúp tăng trưởng, sau đó chuyển giao môi trường saccharose 3%, picloram 2,0 mg/l và kinetin 0,1 mg/l, để tạo thành paclitaxel và baccatin III Kết quả, hàm lượng paclitaxel đạt 1,58 mg/l, baccatin III đạt 0,32 mg/l, cao hơn so với khi sử dụng một loại môi trường

* Nuôi cấy 2 pha (two phase culture):

Nuôi cấy 2 pha là sử dụng thêm pha không tan trong môi trường nuôi cấy, nhằm hấp phụ các chất chuyển hóa sinh ra trong quá trình nuôi cấy, mà các chất này thông thường có tác dụng ức chế ngược quá trình sinh trưởng cũng như tổng hợp hoạt chất Hệ thống nuôi cấy 2 pha đã ứng dụng thành công trong sản xuất sinh khối tế bào thông đỏ Trong đó, pha thứ 2 có thể dùng là chất rắn hấp phụ hoặc dung môi không đồng tan với môi trường Tuy nhiên, các chất rắn có nhiều ưu điểm hơn và hay được sử dụng hơn Kwon I.C và cs [80] đã bổ sung Amberlite XAD không ion (một dạng polymer không tan

trong nước) vào ngày thứ 16 trong chu kỳ nuôi cấy tế bào T cuspidata Kết

quả, hàm lượng paclitaxel thu được tăng lên 40-70% Ngoài sử dụng chất rắn hấp phụ, người ta còn sử dụng chất lỏng hữu cơ như dibutyl phthalat, glycerol, dầu silicon, ether, parafin,… Tuy nhiên, việc bổ sung các chất lỏng hữu cơ có thể gây độc và làm chết tế bào Vì vậy, cần phải nghiên cứu đầy đủ

về độc tính, cách sử dụng để thu được hiệu quả tốt nhất

* Bất động tế bào (Immobilization)

Bất động tế bào là quá trình làm giảm sự chuyển động của tế bào trong môi trường nuôi cấy Khi bất động tế bào sẽ làm mật độ tế bào cao hơn, khả

28

năng tiếp xúc tế bào – tế bào tăng, bảo vệ được tế bào dưới chuyển động của dòng môi trường khi khuấy trộn và ngăn ngừa rửa trôi tế bào trong khi vận hành liên tục Với những ưu điểm này, bất động tế bào đã làm tăng quá trình sinh tổng hợp hoạt chất, tế bào phát triển tốt hơn [29] Để tạo ra sự bất động tế bào, người ta sử dụng các chất tạo gel khác nhau như alginat, carrageenan,

polyacrylamid, agarose, polyurethan,… Trong nuôi cấy tế bào T baccata,

Bentebibel S và cs [23] đã sử dụng calci alginat để làm bất động các tế bào trong sản xuất paclitaxel và baccatin III Kết quả cho thấy, sự bất động tế bào

đã nâng cao hàm lượng hoạt chất từ 2-3 lần so với nuôi cấy tế bào không làm bất động Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào loại chất cũng như nồng

độ chất tạo gel cho vào môi trường nuôi cấy Khi sử dụng alginat ở các nồng

độ 1,5%, 2% và 2,5% thì hàm lượng paclitaxel lần lượt đạt là 13,20 mg/l, 10,85 mg/l và 11,90 mg/l; còn hàm lượng baccatin III đạt tối đa 4,62 mg/l khi

Để đánh giá chất lượng của sinh khối tế bào thông đỏ cũng hiệu quả của

các khảo sát lựa chọn quy trình sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus sp.), cần

phải xây dựng các phương pháp định lượng các hoạt chất chính trong sinh khối tế bào thông đỏ như paclitaxel, baccatin III, 10-DAP, cephalomanin… Hiện nay phương pháp phân tích đồng thời các hoạt chất trong thông đỏ thường sử dụng HPLC Trong đó, đáng chú ý phải sử dụng cột chuyên dụng cho phân tích thông đỏ như: Curosil - PFP (250×4,6 mm; 5 µm); Kromasil

C18 (250×4,6 mm; 5 µm); Phenyl Dynamax 60A0 (250×4,6 mm; 8 µm); Cột

29

Luna L43 (250 x 4,6 mm; 5 µm)…[14], [81] Ngoài ra, dectector PDA cũng thường được sử dụng nhằm tăng giới hạn phát hiện, đồng hợp hạn chế các nhầm lẫn cho chồng pic Trong nghiên cứu phải xây dựng phương pháp định lượng các hoạt chất trong sinh khối thông đỏ để tìm ra các điều kiện thích hợp cho từng loại mẫu cụ thể như: cách thức xử lý mẫu, điều kiện pha động, cột Ngoài ra, phương pháp phải được thẩm định độ chính xác, độ đúng, độ ổn định… Trong nuôi cấy loài thông đỏ Trung Quốc, D.W Yan [138] đã sử dụng cột Kromasil C18 (250×4,6 mm; 5 µm), detector PDA mảng diod, với hệ pha động CH3OH-H2O (65:35, tt/tt) để định lượng paclitaxel, baccatin III và cephalomanlin trong sinh khối Một số nghiên cứu khác sử dụng cột chiết pha rắn để loại tạp chất trong mẫu trước khi định lượng [25] Pha động hay sử dụng để định lượng paclitaxel và các dẫn chất taxan thường là hỗn hợp MeOH, ACN và nước cất với chế độ gradient [54]

1.3.4 Phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ SKTB thông đỏ

Việc chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ thường gặp nhiều khó khăn do trong thành phần hóa học có chứa nhiều chất có cấu trúc hóa học gần giống nhau Vì vậy, để tinh chế đạt tiêu chuẩn dược dụng (>97%) phải sử dụng các phương pháp tinh chế đắt tiền như: sắc ký cột, sắc ký điều chế, do đó tốn thời gian cũng như dung môi hóa chất và hiệu suất thu được thấp [75] Cho đến nay đã có nhiều tác giả đã nghiên cứu đưa ra các phương pháp đơn giản, ít tốn kém hơn để tinh chế paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế bào [43], [62], [66], [113]

Thông thường paclitaxel được chiết xuất trong sinh khối bằng các dung môi hữu cơ như: methanol, hexan, cloroform, aceton… trong đó methanol tỏ ra là dung môi có hiệu quả nhất (hiệu suất >95%, hàm lượng paclitaxel đạt 0,5%) Sau khi thu được dịch chiết thô tiến hành giai đoạn tinh chế sơ bộ bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có xử lý hấp phụ bằng than hoạt tính, đất sét hoạt tính Đặc biệt, nghiên cứu tinh chế dựa vào nguyên lý kết tinh phân đoạn và