bài giảng môn công nghệ sinh học

Định nghĩa: PCR là quá trình nhân bản một hay nhiều phân đoạn ADN thông qua polymerase trong điều kiện - Taq polymerase Thermus aquaticus chịu được 95 o C và hoạt tính tối ưu ở 75 O C

4 Nội dung của kĩ thuật ADN tái tổ hợp

5 Các ứng dụng của Công nghệ gen

DNA is packaged in the cell nucleus as chromosomes

Image compliments of National Human Genome Research Institute

DNA is tightly coiled into chromosome structures which are found in the nucleus

of all living cells in plants and animals.

DNA sequences encode protein sequences

Image compliments of National Human Genome Research Institute

Giới thiệu về công nghệ gen

Acid Phosphoric

Đường Ribose

Base hữu cơ

Adenin Thymidin Cytocin Guanin

3 Thành phần tạo nên một nucleotid

3’

5’

Dịch mã gen là

Sinh tổng hợp

protein

ADN mARN

Protein

Ribosom

Các Phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu genome

1 PCR: Phản ứng chuỗi polymerase

-Polymerase Chain Reaction (PCR)

2 RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA –

DNA đa hình nhân bản ngẫu nhiên

3 AFLP: Amplified Fragment Length

Polymorphism - đa hình chiều dài phân đoạn nhân bản

4 RFLP: Restriction Fragment Length

Polymorphism - đa hình chiều dài phân đoạn cắt hạn chế

5 SSR: Simple Sequence Repeats Các trình tự

lặp lại đơn giản

1 PCR

1 Định nghĩa: PCR là quá trình nhân bản một hay nhiều

phân đoạn ADN thông qua polymerase trong điều kiện

- Taq polymerase (Thermus aquaticus) chịu được 95 o C

và hoạt tính tối ưu ở 75 O C

- 1-2 loại đoạn mồi primer

b) Quá trình phản ứng 

Giáo lý trung tâm (Central Dogma)

& Lai Phân Tử

DNA > Lai DNA+DNA* (probe=Mẫu dò)=Lai > Southern + Gene được tìm thấy

mRNA > lai RNA+DNA* = Northern > Gene được phiên mã thành mRNA

Protein > Lai Western = Lai protein (kháng nguyên) + Kháng thể (Miễn dịch) > Khẳng định sản phẩm dịch mã của gene được tạo ra.

Biol Activity > Biotest (thử sinh học)

Lai phân tử Molecular hybridization

1 Lai Southern: DNA+DNA*

- Nguyên lý: DNA genome ss + DNA* mẫu dò ss theo nguyên tắc base bổ sung

- Mục đích: Khẳng định sự tồn tại của gen

2 Lai Northern: RNA+DNA*

- Nguyên lý: mRNA lai với DNA* mẫu dò theo nguyên tắc base bổ sung

- Mục đích: Khẳng đinh gen được phiên mã thành

mRNA

3 Lai Western: Protein Kháng nguyên+ Protein Kháng thể*

- Nguyên lý: Phản ứng miễn dịch giữa KN với KT.

- Mục đích: Khẳng định gen được biểu hiện thành sản phẩm

2 RAPD

Nhân bản các phân đoạn DNA genome bằng PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide.

Không cần thông tin về đoạn gen cần nhân bản

Không xác định được thể dị hợp tử

3 AFLP

Cắt DNA genome

bằng EcoR1 và Mse1

Nối các đoạn cắt với

adapter

PCR bằng mối tương

thích với adapter Biến dị sản phẩm PCR

Kết quả: 300-500

bằng DNA

5 Lai với mẫu dò – probe từ MM đánh

dấu bằng phóng xạ hoặc huỳnh quang

6 Hiển thị trên film

7 Codominance: §ång tréi

Gene chips enable the expression of

8500 different genes to be tested in a single experiment

Each spot on the gene chip represents a different DNA sequence and the

darkness of each spot represents its level of gene expression in the

experiment

This enables identification of genes that all function together (e.g all expressed in a particular stage of plant development or in response to some change of environmental conditions)

DNA Microarrays - the "Gene Chip"

Analysis of Gene Expression Throughout the Genome

Image compliments of Dean Lavelle & Richard Michelmore, UC Davis.

Genomics Methods Are Accelerating Crop Improvement

Image compliments of UCD Biotechnology Program.

• identification of genes that control valuable traits

• manipulation of genes to produce crops with improved traits

Genome Gene map Gene sequence Gene expression Traits

Yield Drought Disease Stress

Oil quality

Maturity

Stress

Disease Yield

Herbicide tolerance

a

a

c

g g

c

t

g

Image from Access Excellence Graphics Gallery

genetic map gene clones DNA sequence

Use of genomics data for "Marker-Assisted Breeding"

Genomics data provides "markers" throughout the genome

"Molecular markers" are unique DNA sequences that are:

a) located at known positions throughout the genome

b) easily assayed in a small tissue sample

c) (occasionally) located very close to a "gene of interest"

Nematode-resistance gene Mi linked to the Aps marker

genetic map physical map

Linkage of the Mi gene to the Aps marker gene provided a quick easy assay

Almost every progeny plant that contained the Aps marker also contained the Mi gene.

Chỉ thị phân tử và đa hình DNA

Protein do gen XYZ mã hoá

Phân tích ASH bằng DNA chip

Đơn vi khoảng cách cho biết hai gen cách nhau bao nhiêu Thường 1 centimorgan bằng khoảng 1 triệu cặp base.

Kết quả biến di sản phẩm RAPD của quần

thể vải nghiên cứu với mồi OPG-05

Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên khi tiến hành phản ứng

RAPD với mồi OPG-05

Thø tù c¸c dßng v¶i nghiªn cøu *

CD¦ T

(Kb) ADN P§ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 ADN TB

2,0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1,5 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 1,42 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1,4 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 1,25 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 37 1,2 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 1,05 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,95 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,85 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0,78 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 0,66 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 43 0,63 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,6 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 0,55 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,45 16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 0,35 17 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,25 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 TP§ ADN 12 12 12 12 12 12 12 12 11 12 12 11 12 12 11 12 12 12 11 11 12 12 12 13 16 13 12 12 12 12 12 11 12 12 9 11 12 12 11 12 12 12 12 12 12 535

• DNA >Gemone > Genomics

• mRNA>Transcriptome>Transcriptomics (RT – PCR)

• Proteins>Proteome>Proteomics MS/MS TOF)

(Nano-LC-• Metabolits>Metabolome>Metabolomics

Nghiên cứu genom

Các phương pháp nghiên cứu genom

- Sequencing

- PCR

- RAPD/AFLP/RFLP

- Lai phân tử

Ngân hàng dữ liệu

(Database) NCBI (NIH)

EMBL DDBJ

Swiss Protein Datebase

Phương pháp NC Genomics

Các kĩ thuật mới

Hệ gen học (Genomics)

Khai thác sử dụng

Sinh tin học (Bioinformatics )

Về cấu trúc gen, Gen điều khiển

Sinh học phân tử

Lưu giữ, xử lý dữ liệu Phần mềm SHPT

Phân tích trình tự nucleotid trong DNA

Thiết bị mới/Thư viện chỉ thị phân tử/DNA chip

Trình tự nucleotit của gen nh2nh5 được nhân bằng cặp mồi NH2-NH5

GAGAAGCTGAAGGAGAAGGAGAAGCAGAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGATAAACAAAAA 60 GATAAAGATAATGATGGAGCTAGTGACGGAAATGATGTGTCAACTAGCACAAAAACTGGA GAGAGAGATAGAGATGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTTTCACTGTTCCAAGGATAAAG 120 TCTTTTACTGATAAGATGATTTTACCAAGAATTAAGGGAAAGTCTGTCCTTAATTTAAAT CATCTTCTTCAGTATAATCCGAAACAAATTGACATCTCAAACACTCGTGCCACTCAATCT 300 CAATTTGAAAAGTGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTATGGTCTTAGTGATAACGAAATG CAAGTGATGTTAAATGGTTTGATGGTTTGGTGTATCGAAAATGGTACATCTCCAGACATA 420 TCTGGTGTTTGGGTAATGATGGATGGGGAAACCCAGGTTGATTATCCTATCAAACCTTTA ATTGAACATGCAACTCCTTCATTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAG 540 GCATATATCGCGAAGAGAAATGCAACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATTAAAAGG AATTTGACTGACATTAGCCTCGCTCGATATGCTTTTGATTTCTATGAGGTGAACTCGAAA 660

ACACCTGATAGGGCTCGTGAAGCTCATATGCAGATGAAGGCTGCAGCGCTACGTAATACT AGTCGCAGAATGTTCGGAATGGACCGCAGTGTCAGTAACAGGGAAGAAAACACCGAAAGA 780

A 781

Trình tự axit amin của protein dịch mã từ gen nh2nh5

EKLKEKEKQKEKEKEKDKQKDKDNDGASDGNDVSTSTKTGERDRDVNAGTSGTFTVPRIK 60 SFTDKMILPRIKGKSVLNLNHLLQYNPKQIDISNTRATQSQFEKWYEGVRNDYGLSDNEM 120 QVMLNGLMVWCIENGTSPDISGVWVMMDGETQVDYPIKPLIEHATPSFRQIMAHFSNAAE 180 AYIAKRNATERYMPRYGIKRNLTDISLARYAFDFYEVNSKTPDRAREAHMQMKLQRYVIL 240 VAECSEWTAVSVNREENTER 260

Điều mới mẻ: cho cả 30.000 gen

(không phải 100.000) và 200 giống của vi khuẩn

Giải mã genom – Tiến hành

như thế nào?

1 Lập bản để chỉ thị phân tử

đều trên tất cả NST

2 Xây dùng ngân hàng BAC

toàn bộ AND genom

Giải mã bộ gen lúa

Cùng bộ hoàn thành: 4/2002

Qui mô: 400 Mbp Gồm: 30000-50000 gen

http://rgp.dna.affrc.jp

http://www.tmri.org

ứng dụng

1 đánh giá chức năng gen

2 Cải tiến chất lượng hạt

3 Phòng trừ sâu bệnh

So s¸nh víi genom cu¶ ng«

vµ m¹ch

So s¸nh genom c ñ a 6 loµi c©y

trång thuéc hä hoµ th¶o

Ngành khoa học nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các protein thuộc một genom.

Có các đề án xác định toàn bộ các protein của:

(1) Vi khuẩn Bacillus (4000 protein)

(2) của cây Arabidopsis;

(3) của ng ời, v/d Clinical proteomics

GAGAAGCTGAAGGAGAA GGAGAAGCAGAAAGAAA AAGAAAAAGAAAAAGATA AACAAAAA 60

GATAAAGATAATGATGGA GCTAGTGACGGAAATGAT GTGTCAACTAGCACAAAA ACTGGA

GAGAGAGATAGAGATGT CAACGCCGGAACTAGTG GAACTTTCACTGTTCCAA GGATAAAG 120

Trái: Protein của cây mạ khi bị lạnh hiển thị bằng

thuốc nhuộm bạc.

Phải: Protein của Bacillus khi bị shock nhiệt hiển thị

bằng đánh dấu huỳnh quang.

Xác định phổ protein bằng

kỹ thuật 2D-PAGE

20.000 đoạn nucleotid ngắn đại

đIện cho các gen khác nhau

đ ợc gắn lên tấm màng nitrosocellulo

quần thể mRNA

đánh dấu huỳn

h quang

để phát hiện nhữn

g gen mới hoạt hoá

Mục đích: Tìm gen

Kü thuËt di truyÒn

Kü thuËt di truyÒn lµ viÖc chuyÓn gen tõ c¬ thÓ nµy sang c¬ thÓ kh¸c

N«ng nghiÖp

Ng nghiÖp

Y d îc

ứng dụng trong nông nghiệp

•Kháng thuốc diệt cỏ

Gen vi khuẩn vẫn tạo

enzym khử độc amoniac khi gặp thuốc diệt cỏ nhóm

basta

•Kháng sâu hại

Gen vi khuẩn tạo protein

độc diệt sâu hại cây

•Tăng năng suất

Nhờ gen cao sản (sữa,

thịt nạc )

Vần đề An toàn sinh học

GMO – Cây trồng chuyển gen

Lan truyền gen lạ vào tự nhiên

biếnnạp vào vikhuẩn

hoặc nấm men để

Liệu pháp gen – Gene Therapy

Nguyên lý: Đ a một gen hay alen

lành lặn vào tế bào/mô của ng ời

Dùng virus làm vector vận chuyển

gen - Đang nghiên cứu

Bệnh nhân Jesse Gelsinger là 1

trong 18 bệnh nhân đ ợc trị liệu gen

bện thiểu năng gan, mất 9/1999 do cơ

thể phẩn ứng với virus biến đổi gen

gây nên hiện t ợng mất chức năng nhiều

cơ quan dẫn đến tử vong

NhËn d¹ng c¸ thÓ

Th«ng qua ph¶n øng chuçi polymerase

(PCR)

ChØ cÇn mét l îng nhá DNA ban ®Çu cã thÓ

nh©n ® îc sè l îng b¶n copy rÊt lín (1 triÖu b¶n trong 2 giê)

Con cháu nam giới của ông nội Jefferson đều có cùng một

NST Y nh nhau.

Cã ph¶i nhµ kü thuËt di truyÒn

®ang lµm thay viÖc cña th îng

Minh họa

Giám định gen hài cốt liệt sỹ

Lễ bàn giao kết quả giám định gen

hài cốt liệt sỹ

Viện Công nghệ Sinh học

cơ thể cấu

tạo bởi mười nghìn

tỷ (10 13 )

tế bào

Giám định gen hài cốt

Tế bào có 1 nhân chứa hầu như toàn bộ AND của tế bào

Tế bào có nhiều (1000)

ty thể cùng chứa ADN dạng vòng

Phân tích Giám định gen gì?

Vì sao chọn gen ti thể?

Đoạn gen HV1 vùng loop

D-ADN ty thể:

• Cách 40-60 thế hệ

mới có một đột biến trong dòng họ.

H×nh A: S¶n phÈm PCR tõ mÉu ADN r¨ng hµi cèt

H×nh B, C: S¶n phÈm PCR tõ c¸c mÉu m¸u

B íc 2:

Nh©n b¶n c¸c ®o¹n gen ty thÓ

A B C

Nhân dòng phân tử và chẩn đoán cắt hạn chế khẳng định dòng

gen tái tổ hợp

B ớc 3:

Tách dòng gen

Gi¶i tr×nh tù gen trªn m¸y ABI Prism 

T¹i Phßng Dù ¸n Sinh tin häc

B íc 5:

Ph©n tÝch sè liÖu vµ LËp ng©n

hµng d÷ liÖu

So s¸nh lËp c©y ph¶ hÖ

H×nh thµnh c©y ph¶ hÖ tæng thÓ vµ c©y ph¶ hÖ

riªng rÏ

LS ph¶ hÖ PB02

LS ph¶ hÖ PA02

Thu thập mẫu Tách chiết ADN Nhân bản gen Tách dòng gen Đọc trình tự

Không xác định 3-5 ngày 2-3 ngày 3-5 ngày

2-4 ngày

Tổng số: 2-3 tuần Thời gian thực hiện

NghÜa trang liÖt sü t¹i huyÖn Ngäc Håi Kontum

Hµ, Hµ TÜnh

N¬I hy sinh: bªn c¹nh suèi Chµ

MiÖt

GiÊy B¸o tö

§oµn 559 Sè 173/BT Ngµy 25/9/1966

T¹i: MÆt trËn phÝa t©y

§Þa chØ th©n nh©n hiÖn nay: Cha NguyÔn H÷u HuyÒn ë

nguyªn qu¸n

28-2-Tại: Mặt trận phía tây

Thi hìa mai táng tại Nghĩa

Trang đơn vị

Ngày 30/6/1969

LiÖt sü NguyÔn H÷u Vu

Theo Sæ s¸ch cña §oµn 559 Sè thø tù 117 ghi:

BT7 B¶n Nhai, Vu-pu-vong-n

a, tØnh A-to-p

Bè: NguyÔn H÷u HuyÒn

• Vî: Ng« ThÞ Hoµ, Th¹ch §µI, Th¹ch Hµ, Hµ TÜnh

Th«ng tin vÒ LiÖt sü

Saravan

Attop

Những điểm đáng chú ý

Những điểm đúng

• Có Liệt sỹ Trần Tỷ (bia ghi Trần

Xuân Tỷ) hy sinh ngày

28.2.1969 và gia đình đang

sống ở Xuân Hoa, Nghi Xuân,

Nghệ An

• Thông tin về bà Ngô Thị Hoà

trên bia mộ hoàn toàn đúng với

thông tin ghi trên giấy báo tử và

• Thông tin về nơi chôn cất đúng

cho LS Nguyễn Hữu Vu: Cạnh

suối Chà Miệt

Những điểm ch a đúng

• LS Trần Tỷ, Nghi Xuân không có tên đệm là Xuân

• LS Trần Tỷ quê Xuân Hoa, Nghi Xuân, HT, chứ không phải quê Thạch Đài, Thạch Hà, HT

• Chồng bà Ngô Thị Hoà là Liệt sỹ Nguyễn Hữu Vu,

• Vợ Liệt sỹ Trần Tỷ là bà D

ơng Thị Tam,

• Liệt sỹ Nguyễn Hữu Vu hy sinh tr ớc Liệt sỹ Trần Tỷ 3 năm

Di hài Liệt sỹ Trần Xuân Tỷ

đ ợc qui tập từ Lào qua Ngọc Hồi, Kontum,

về Nghĩa

trang QT Việt Lào huyện

Anh Sơn tỉnh Nghệ An ngày 03-07-1997

Gia đình bà Ngô Thị Hoà đề nghị giám định gen

Văn bản đề nghị của gia đình đ ợc giám định gen

Th¹ch §µi

Th¹ch VÜnh

Hµ Néi

Ph¶ hÖ cña LiÖt sü NguyÔn

H÷u Vu

¤.Ng.H÷uHuyÒ n

LS Ng.H÷uVu

TrÇn §øc T«n Ng«ThÞH oµ

TrÇn §¹t

D ¬ngThi Can

Xu©n Hoa, Nghi Xu©n, Hµ

TÜnh

Xãm 5 x· Cæ

§¹m, Nghi Xu©n, HT,

LS ( 1, 2 X ¬ng LS, 4 §C m¸u)

Qui tr×nh nh©n b¶n gen ty

thÓ

2.2 Tr×nh tù nucleotit c¸c mÉu QB1

vµ QB2