Tài liệu Bài thuyết trình - Công nghệ sinh học pdf

III.2 Quy trình... Ph ươ ng pháp:a... Ph ươ ng pháp:c... Các sai sót gây ra do Taqpolymerase.

MÔN: SINH H C PHÂN T Ọ Ử

MÔN: SINH H C PHÂN T Ọ Ử

GVHD: NGUY N TH DUY KHOA NGUY N TH DUY KHOA Ễ Ễ Ị Ị

GVHD: NGUY N TH DUY KHOA NGUY N TH DUY KHOA Ễ Ễ Ị Ị

1. NGUY N ĐÌNH B O NGUY N ĐÌNH B O Ễ Ễ Ả Ả

2. TR N QU C H C TR N QU C H C Ầ Ầ Ố Ố Ọ Ọ

3. NGUY N H U SĨ NGUY N H U SĨ Ễ Ễ Ữ Ữ

4. PHAN NG C TH NH PHAN NG C TH NH Ọ Ọ Ị Ị

5. TR N XUÂN ÁI TR N XUÂN ÁI Ầ Ầ

6. QUÁCH TH QUỲNH MAI QUÁCH TH QUỲNH MAI Ị Ị

7. H TH NH SANG H TH NH SANG Ồ Ồ Ị Ị Ư Ư

8. PH M TH T NH PH M TH T NH Ạ Ạ Ị Ỉ Ị Ỉ

9. VÕ TH B O ÁI VÕ TH B O ÁI Ị Ả Ị Ả

10. NGUY N TH THU L U NGUY N TH THU L U Ễ Ễ Ị Ị Ự Ự

11. NGUY N MINH TH T NGUY N MINH TH T Ễ Ễ Ậ Ậ

QUÁCH TH QUỲNH MAI Ị

QUÁCH TH QUỲNH MAI Ị

I KHÁI NI M Ệ

 PCR là ch vi t t t c a c m tữ ế ắ ủ ụ ừ Polymerase Chain Reaction

 PCR là Ph n ng chu i trùng h p ả ứ ỗ ợ hay g i là "ph n ọ ả ứng khu ch đ i gen" ế ạ

 PCR là m t k thu t ph biộ ỹ ậ ổ ến trong sinh h c phân t nhọ ử ằm khuy ch đ i (tế ạ ạo ra nhi u b n sao) m t đo n DNA mà không ề ả ộ ạ

c n s d ng các sinh v t s ng nh ầ ử ụ ậ ố ư E coli hay n m menấ

 PCR được s d ng trong các nghiên c u sinh h c và y h c ử ụ ứ ọ ọ

ph c v nhiụ ụ ều m c đích khác nhau, nh phát hiụ ư ện các

b nh di truy nệ ề , nh n d ng, ch n đoán nh ng ậ ạ ẩ ữ

b nh nhi m trùngệ ễ , tách dòng gene, và xác đ nh huy t th ngị ế ố

II L CH S L CH S Ị Ị Ử Ử

Ph ươ ng pháp căn b n ch y PCR đ ả ạ ượ c Kary Mullis

phát minh, ông đã đo t ạ gi i Nobel v Hóa h c ả ề ọ vào

khi ông đ a ra ý t ư ưở ng Ý ki n c a Mullis là phát ế ủ

tri n m t quy trình mà DNA có th nhân lên nhi ể ộ ể ề ầ u l n

m t cách nhân t o qua nhi u chu kỳ sao chép b i ộ ạ ề ở

III TH C NGHI Ự Ệ M

 PCR được dùng đ khu ch đ i m t đo n DNA ng n, đã ể ế ạ ộ ạ ắ

xác đ nh đị ược m t ph n Đó có th là m t gen đ n, hay ộ ầ ể ộ ơ

DNA-polymerase đ xây d ng DNA m i ể ự ớ

- Dung d ch đ m, cung c p môi trị ệ ấ ường hóa h c cho ọ

DNA-polymerase

III.1 Đo n ạ m i ồ

nucleotides)

III.2 Quy trình

B n Tre ng d ng công ngh PCR Real-time trong ế ứ ụ ệ

B n Tre ng d ng công ngh PCR Real-time trong ế ứ ụ ệ

Trước tiên, m u tôm Post ẫ

được nghi n nhuy n trong m t ề ễ ộ

dung d ch tách chi t gen di ị ế

B n Tre ng d ng công ngh PCR Real-time trong xét ế ứ ụ ệ nghi m b nh tôm ệ ệ

H n h p dung d ch và tôm post ỗ ợ ịnghi n nhuy n l i tr i qua công đo n ề ễ ạ ả ạ

làm l nh nhanh, cho vào t đông ạ ủ ở

nhi t đ (-200C) trong vòng 15 phút ệ ộ

H n h p tiỗ ợ ế ụp t c được đ a vào ưmáy ly tâm kho ng 5 phút, v i tả ớ ố c đ ộ

780.000 vòng/h đ lo i tể ạ ạ p ch t ấ

Ph n c n bã và ch t h u c b ầ ặ ấ ữ ơ ị

l ng xu ng đáy Ph n dung d ch còn ắ ố ầ ị

l i có ch a DNA ạ ứ

B n Tre ng d ng công ngh PCR Real-time trong xét ế ứ ụ ệ nghi m b nh tôm ệ ệ

ti ng đ ng h T i đây s diế ồ ồ ạ ẽ ễn

ra quá trình ph n ng nhân ả ứ

b n DNA.ả

1 Nguyên li u ệ

1 Nguyên li u ệ :

Promega, Pharmacia, Sigma, MERCK).

I Ph ươ ng pháp nghiên c u ứ

2 Ph ươ ng pháp:

a Tách ADN:

b K thu t PCR: ỹ ậ

(25mg/ml).

2 Ph ươ ng pháp:

c K thu t đi ỹ ậ ệ n di:

Các m u sau khi th c hi ẫ ự ệ n quá trình PCR

đã đ ượ c ki m tra trên gel agaroza 2% sau ể

đó đ ượ c đi n di trên gel polyacrylamide ệ 6% s d ng ure 7M Băng ADN đ ử ụ ượ c

phát hi n b ng ph ệ ằ ươ ng pháp nhu m b c ộ ạ

c a Bassam, 1991 ủ

d Ph ươ ng pháp ch n l ọ ọ c và xây d ng ự

thang alen

d Ph ươ ng pháp ch n l ọ ọ c và xây d ng ự

thang alen

* Xây d ng thang alen: Trong quá trình ự đánh s , chúng tôi đ ng th i ch n ra ố ồ ờ ọ

nh ng m u mang nh ng alen khác nhau ữ ẫ ữ

t p h p l i đ t o thang alen Thang alen ậ ợ ạ ể ạ

đ ượ ạ c t o b ng ph ằ ươ ng pháp tr n m u ộ ẫ

* Chu n thang alen: ký hi u l i các ẩ ệ ạ alen đã kh o sát đ ả ượ c theo quy ướ c qu c ố

t Alen c a locus D7S820 đ ế ủ ượ c ký hi u ệ

t 6 đ n 14 căn c vào s đo n l p c a ừ ế ứ ố ạ ặ ủ

m i alen ỗ

II K t qu ế ả

1 K t qu t ế ả ố ư i u nhi t đ g n m i quá ệ ộ ắ ồ trình PCR :

K t qu kiế ả ểm tra s n ph m PCR m t s m u trên gel ả ẩ ở ộ ố ẫ

agaroza theo đi u ki n nhi t đ g n m i 58oCề ệ ệ ộ ắ ồ

2 K t qu ch n l ế ả ọ ọ c alen và t o thang ạ

alen :

Thang alen chu n c a locus D7S820 v i 7 alen khác ẩ ủ ớ

nhau được phân tách b ng k thu t điằ ỹ ậ ện trên gel PA

Xác đ nh quan h huy t th ng: ị ệ ế ố

Xác đ nh quan h huy t th ng: ị ệ ế ố

Đ t chính xác 99,9% ạ

Đ t chính xác 99,9% ạ

GS Lê Đình L ươ ng và các c ng s đã t ộ ự ự ỏ ề b ti n túi

đ nghiên c u ể ứ ứ ng d ng k thu t này trong vi ụ ỹ ậ ệ c

CÁC CÁCH L Y M U Ấ Ẫ

 Cách thu th p m u ADN b ng tăm bông: ậ ẫ ằ

các t bào má t bên trong mi ng ế ừ ệ

 Vi c l y m u máu khô ệ ấ ẫ

Cách thu th p m u ADN b ng tăm ậ ẫ ằ

Cách thu th p m u ADN b ng tăm ậ ẫ ằ

đ a đ u bông vào phía trong má rư ầ ồi chà xát đ u ầ

bông vào thành má lên xu ng t i thi u mố ố ể ườ ầi l n,

v a chà xát, v a xoay tròn đ u tăm bông đ toàn b ừ ừ ầ ể ộcác m t c a đ u tăm đặ ủ ầ ược th m t bào má.ấ ế

 L y xong que th nh t, đ a trấ ứ ấ ư ả ạ l i ngay vào phong

bì mà b n v a lạ ừ ấy ra

 L p l i nh th v i ba que tăm còn lặ ạ ư ế ớ ại (nên nh là ớ

có b n que thì hai que l y t bào má bên trái, hai ố ấ ếque l y t bào má bên ph i) ấ ế ả

 V i tr ớ ườ ng h p tr còn nh , không t l y đ ợ ẻ ỏ ự ấ ượ c thì ng ườ ớ i l n

l y h ấ ộ L u ý: ư Không nói chuy n khi l y m u, đ tránh b n ệ ấ ẫ ể ắ

Vi c l y m u máu khô ệ ấ ẫ

 Chu n b m t miẩ ị ộ ếng v i bông tr ng s ch (m i), kích ả ắ ạ ớ

thước kho ng 3x3 cm Vi t tên ngả ế ười cho m u vào ẫmép mi ng v i trế ả ước khi l y m u.ấ ẫ

 Dùng c n và bông lau s ch đ u ngón tay Dùng kim ồ ạ ầchích máu chích vào đ u ngón tay Nh ba - b n ầ ỏ ố

gi t máu th m vào gi a mi ng v i Sau đó, ph i ọ ấ ữ ế ả ơ

ho c hong khô.ặ

 Sau khi khô, m i m u đỗ ẫ ược cho vào m t túi ny-lông ộ

s ch, m i, rạ ớ ồ ưi đ a vào m t phong bì nh Ghi tên ộ ỏ

người cho m u ngoài phong bì.ẫ

Sáu khâu chính c a quy trình xét ủ

nghìn kilômet, m t nhi u ngày, ấ ề

trong phong bì bình th ng, qua ườ

b u đi n, không c n b o qu n ư ệ ầ ả ả

l nhạ

Sáu khâu chính c a quy trình xét ủ

2 Tách chi t ADN: ế Nhi u quy ề

trình tách chi t ADN khác nhau ế

Sáu khâu chính c a quy trình xét ủ

Sáu khâu chính c a quy trình xét ủ

4 Đi n di: ệ Đi n di đệ ược dùng đ ể

tách bi t các đo n ADN có đ dài ệ ạ ộ

lên hàng trăm l n, giúp phân bi t rõ ầ ệ

các đo n ADN ch chênh l ch nhau ạ ỉ ệ

b n nucleotid ố

Sáu khâu chính c a quy trình xét ủ

5 Nhu m ADN: ộ Ch t lấ ượng

đi n di và k t qu nhân ADN ệ ế ả

đ c hi u ch có th hiặ ệ ỉ ể ện rõ trên

b n gel v i quy trình nhu m ả ớ ộ

ADN đượ ố ưc t i u hoá và phương

pháp nhu m thích h p độ ợ ượ ực l a

ch n Ngoài ra, kinh nghi m và ọ ệ

k năng c a k thu t viên cũng ỹ ủ ỹ ậ

r t c n thi t, góp ph n h giá ấ ầ ế ầ ạ

thành chung

Sáu khâu chính c a quy trình xét ủ

6 Phân tích k t qu : ế ả B n gel sau ả

khi nhu m xong s có d ng nh hình ộ ẽ ạ ư

trên Các đo n ADN có đ dài khác ạ ộ

nhau hi n rõ trên b n gel, có th quan ệ ả ể

B kit phát hi n b nh ộ ệ ệ

đ m tr ng tôm, do ố ắ ở Phòng thí nghi m ệ Công ngh Sinh h c ệ ọ Phân t ĐH Khoa h c ử ọ

T nhiên TP.HCM ự nghiên c u và làm ra ứ

cung c p cho các phòng thí nghi m lâm ấ ệ

sàng các b th nghi ộ ử ệ m PCR (b kit) ộ đ ể

phát hi n các virus gây b nh cho ng ệ ệ ườ i

nh : lao, viêm gan B, viêm gan C, s t xu t ư ố ấ

huy t, u nhú (virus Human Pailloma), m n ế ụ

gi p (virus Herpes) ộ Ngoài ra, đ giúp các ể

CH N ĐOÁN B NH Đ M TR NG Ẩ Ệ Ố Ắ

(WHITE SPOT SYNDROME VIRUS) CHO TÔM SÚ B NG CÁC K Ằ Ỹ

THU T PCR Ậ

(a) K thu t PCR t ỹ ậ ổ (nested PCR)

 K thu t này s d ng 2 c p m i thay vì 1 c p m i ỹ ậ ử ụ ặ ồ ặ ồ

nh k thu t PCR c điư ỹ ậ ổ ển, trong đó c p m i th hai ặ ồ ứ

n m gi a c p m i th nh t K thu t này còn g i là ằ ữ ặ ồ ứ ấ ỹ ậ ọ

k thu t PCR 2 bỹ ậ ước

 K thu t này s có nhiỹ ậ ẽ ều đo n s n ph m DNA h n ạ ả ẩ ơ

là k thu t PCR c đi n, s đo n ADN đỹ ậ ổ ể ố ạ ược phát

hi n s nói lên tính đ nh lệ ẽ ị ượng tương đ i c a ph n ố ủ ả

ng

ứ

 K thu t n y đỹ ậ ầ ược Lo et al công b vào năm 1996 ố

(b) K thu t real-time PCR ỹ ậ

Có nhi u cách phát hi n l ề ệ ượ ng ánh sáng (màu) sinh ra:

K thu t PCR trong ch n đoán s m ỹ ậ ẩ ớ

l ượ ng tôm trong đàn nh ng t ư ổ ng tr ng l ọ ượ ng không quá 1 gam

và cũng không nh h n 0,1 gam, l ỏ ơ ấ y m u t ẫ ươ i hay đã đ ượ ố c c

đ nh trong c n 950 ị ồ

+ M u tôm nuôi: l ẫ ấ y m t ph n nh mang c ộ ầ ỏ ủ a 10 - 20 con

có bi u hi n b nh lý đ c tr ể ệ ệ ặ ư ng nh ng t ư ổ ng tr ng l ọ ượ ng không quá 1 gam và cũng không nh h n 0,1 gam, l ỏ ơ ấ y m u t ẫ ươ i ho c ặ

2 Tách chi t DNA (Desoxyribonucleic ế Acid

Nguyên t c c a vi c tách chi t này là d a trên ắ ủ ệ ế ự

s ph i h p c h c (nghiự ố ợ ơ ọ ền), hóa h c và s c nhiọ ố ệt

đ tách chi t DNA virus ra d ch chi t C th , m u ể ế ị ế ụ ể ẫ

được nghi n trong b nghi n m u vô trùng v i m t ề ộ ề ẫ ớ ộ

lượng dung d ch tách chi t DNA (NaOH và SDS) ị ế

D ch nghi n đị ề ược đ a vào bi n tính b ng cách đun ư ế ằ

sôi 5 - 10 phút r i làm l nh nhanh đi u ki n l nh ồ ạ ở ề ệ ạ

Sau đó d ch nghi n đị ề ược ly lâm 5 phút v i t c đ ớ ố ộ

13.000 vòng/phút D ch n i thu đị ổ ược sau khi ly tâm

đ a vào khuy ch đ i DNA ho c b o qu n lư ế ạ ặ ả ả ạnh –

20oC trong vòng m t tu n (khi m u ch a độ ầ ẫ ư ược phân

tích ngay)

3 Khuy ch đ i DNA ế ạ

phút

5 Phân tích k t qu ế ả

- M u tôm postlarvae ẫ

6 u nh Ư ượ c đi m c a k thu t PCR ể ủ ỹ ậ

6 u nh Ư ượ c đi m c a k thu t PCR ể ủ ỹ ậ

này Các sai sót gây ra do Taqpolymerase

M t s ộ ố ứ ng d ng c a PCR trong ụ ủ

vi sinh v t ậ

1 Xác đ nh c n nguyên c a các ị ǎ ủ

b nh nhi m trùng ệ ễ

Dùng PCR cho nh ng vi sinh v t ch a ữ ậ ư nuôi c y nhân t o đ ấ ạ ượ c ho c nuôi ặ

Ngày nay, ng ườ i ta còn dùng PCR đ xác ể

c ng đ ng, vì r ộ ồ ằ ng nh ng ch ng vi khu n lao ữ ủ ẩ

đa đ kháng đã đ ề ượ c h n ch tung ra môi ạ ế

tr ườ ng bên ngoài.

Helicobacter pylori (HP): HP hi n đang là m t ệ ộ

trong nh ng v n đ th i s c a Y h c th gi ữ ấ ề ờ ự ủ ọ ế ớ i

vì vai trò quan tr ng c a nó trong các b nh lý ọ ủ ệ

viêm, loét và ung th d dày ư ạ

Xác đ nh đ c t c a vi sinh v t ị ộ ố ủ ậ

Xác đ nh vi khu n ngoài môi tr ị ẩ ườ ng:

 Các vi khu n khó nuôi c y và/ho c thẩ ấ ặ ường có m t ặngoài môi trường có th để ược tìm tr c ti p b ng ự ế ằ

PCR, ví d nh các ụ ư Legionella, Salmonella, Shigella

và Vibrio cholerae

 Giá tr ch n đoán b nh c a PCR đ c biị ẩ ệ ủ ặ ệt trong

nh ng trữ ường h p vi sinh v t không nuôi c y đợ ậ ấ ược

ho c nuôi c y rặ ấ ất khó kh n, t n kém; ho c k t qu ǎ ố ặ ế ảnuôi c y r t ch m, ho c ấ ấ ậ ặ ở nh ng b nh nhân đã ữ ệ

dùng kháng sinh trước khi vào vi n, vì r ng PCR ệ ằ

không nh t thi t đòi h i ph i có vi sinh v t s ng.ấ ế ỏ ả ậ ố

ph m là vi khu n thu n Tuy v y, viẩ ẩ ầ ậ ệc chu n b ẩ ị

ADN m u (template) t vi khu n thu n cho PCR rẫ ừ ẩ ầ ất

đ n gi n: ch c n đun sôi cách thu huy n d ch vi ơ ả ỉ ầ ỷ ề ị

khu n trong 10 phút r i thu l y d ch n i sau ly tâm ẩ ồ ấ ị ổ

lo i b tạ ỏ ế bào là đ ủ

3 Phân lo i (classification) vi khu n ạ ẩ

DÙNG K THU T PCR XÁC Đ NH Ỹ Ậ Ị

L I ÍCH C A VI Ợ Ủ Ệ C DÙNG PCR Đ XÁC Ể

 Giúp các gia đình đã có tr Down tránh nguy c l p ẻ ơ ặ

l i (sinh thêm 1 tr Down) ch đ ng h n ạ ẻ ủ ộ ơ

 Xét nghi m máu m giúp h n ch tai biệ ẹ ạ ế ến cho m ẹ

và thai nhi so v i các phớ ương pháp can thi p (nh ệ ư

ch c nọ ướ ốc i, sinh thi t gai nhau ) ế

 ch giúp phát hi n Down trong trỉ ệ ường h p th a ợ ừ

nhi m s c th 21, không tìm ra đễ ắ ể ược các trường

h p Down do các b t thợ ấ ường khác liên quan nhi m ễ

s c th này ắ ể

TRÊN ĐÂY LÀ BÀI THUY T Ế

I love

you,I want

to kiss

you!