Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus dịch tả vịt nhược độc và dịch tả vịt cường độc chủng 7 69 ứng dụng chủng virus dịch tả vịt cường độc 7 69 trong kiểm nghiệm vacxin

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 2.3.1 Xác ñịnh ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 2.3.2 Xác ñịnh ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

LA THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA CHỦNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT NHƯỢC ðỘC VÀ DỊCH TẢ VỊT CƯỜNG ðỘC CHỦNG 7/69 ỨNG DỤNG CHỦNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT CƯỜNG ðỘC 7/69

TRONG KIỂM NGHIỆM VACXIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

LA THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA CHỦNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT NHƯỢC ðỘC VÀ DỊCH TẢ VỊT CƯỜNG ðỘC CHỦNG 7/69 ỨNG DỤNG CHỦNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT CƯỜNG ðỘC 7/69

TRONG KIỂM NGHIỆM VACXIN

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN



đầu tiên cho tôi ựược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban quản lý ựào tạo -Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các Thầy Cô giáo ựã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sự kắnh trọng sâu sắc tới TS.Trịnh đình Thâu, PGS.TS Nguyễn Thị Lan ựã giành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện ựề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Cho tôi ựược gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Tạ Hoàng Long - Giám ựốc Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, cán bộ nhân viên trong Trung tâm ựã ựộng viên, tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành ựề tài tốt nghiệp

Qua ựây tôi xin cảm ơn các bạn bè ựồng nghiệp người thân và gia ựình ựã tạo ựiều kiện về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện ựề tài

Một lần nữa tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân ựã tạo ựiều kiện giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả

LA THỊ HƯƠNG

LỜI CAM ðOAN



Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu, số liệu ñược trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác cũng như chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học

vị nào Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

LA THỊ HƯƠNG

1.2 Một số ñặc ñiểm của virus dịch tả vịt và bệnh dịch tả vịt 8

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Xác ñịnh ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc

2.3.2 Xác ñịnh ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc

7/69 ñược lưu giữ tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1 28 2.1.3 Ứng dụng chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc 7/69 ñể kiểm

nghiệm vacxin Dịch tả vịt nhược ñộc, ñông khô do công ty

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu một số ñặc tính sinh học chủng virus

3.1 Kết quả xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus dịch

3.1.1 Kết quả xác ñịnh hiệu giá chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 38

3.1.2 Xác ñịnh chỉ số gây nhiễm trên phôi EID50 39 3.1.4 Kết quả kiểm tra ñộ ổn ñịnh của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 42 3.2 Kết quả xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus dịch

3.2.1 Kết quả xác ñịnh hiệu giá chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc 7/69 45 3.2.2 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm (LD50) 46 3.2.3 Kết quả kiểm tra ñộ ổn ñịnh của chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc 49 3.3 Sử dụng chủng virus dịch tả vịt cường ñộc 7/69 ñể kiểm nghiệm

3.3.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường ñộc 54

DANH MỤC BẢNG

3.1 Kết quả kiểm tra vô trùng của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 37 3.2 Kết quả xác ñịnh hiệu giá chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 39 3.3 Kết quả xác ñịnh chỉ số EID50 của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 40 3.4 Kết quả xác ñịnh chỉ số EID50 của giống virus cường ñộc qua 2

3.11 Kết quả công cường ñộc bằng virus Dịch tả vịt cường ñộc chủng

DANH MỤC HÌNH

3.1 Gây nhiễm chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc trên phôi trứng 43

3.4 Phôi chết sau khi gây nhiễm chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc 43

3.6 Vịt ủ rũ sau khi gây nhiễm chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc 50

3.8 Vịt chết sau khi gây nhiễm chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc 51

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Cs Cộng sự

DNA Dezoxy ribonucleic acid

EID 50 50% Embryo Infective Dose

ELISA Enzime Linked Immunosozbent Assay

FAO Food and Agriculture Organisation

HI Hemagglutination Inhibition test

HGKTTB Hiệu giá kháng thể trung bình

LD 50 50 Percent Lethal Dose

OIE Office International de Epizooties

PCR Polymerase Chain Reaction

TTKNTTYTW1 Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y

Trung ương 1

WHO World Health Organisation

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Việt Nam là một nước nông nghiệp có truyền thống lâu ñời, trong ñó ngành chăn nuôi giữ vai trò hết sức quan trọng, nó góp phần vào việc phát triển kinh tế nông nghiệp và nâng cao chất lượng cho cuộc sống của nhân dân Cùng với sự phát triển của ngành kinh tế, chăn nuôi vịt ñang dần trở thành ngành sản xuất hàng hóa, góp phần vào chương trình xóa ñói giảm nghèo cho nông dân ở một số vùng nông thôn nước ta

Cùng với sự ñi lên của ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gia cầm nói riêng, sự phát triển của các phương thức chăn nuôi công nghiệp hiện ñại cũng không tránh khỏi dịch bệnh xảy ra ðặc biệt với ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm cùng với sự ña dạng trong phương thức nuôi thả nước

ta càng thuận lợi cho những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như Dịch tả vịt, Viêm gan vịt….phát triển và gây nhiều thiệt hại Trong ñó bệnh Dịch tả vịt là một bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn ðây là bệnh truyền nhiễm cấp tính

do một loại Herpes virus thuộc họ Herpesvirideae gây bệnh ở vịt mọi lứa tuổi Cho ñến nay, bệnh chưa có thuốc ñiều trị Biện pháp tốt nhất ñể kiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học và sử dụng vacxin phòng bệnh

ðể phòng bệnh, ở Việt Nam hiện nay ñã có vacxin Dịch tả vịt nhược ñộc Nhưng ñể sản xuất ñược một vacxin phòng bệnh tốt và có hiệu quả, ñiều quan trọng là chúng ta phải có ñược một chủng virus cùng nguồn gốc với virus gây bệnh và có tính ổn ñịnh cao Nó không những phục vụ cho việc sản xuất vacxin mà còn có ý nghĩa rất quan trong trong việc kiểm tra tính hiệu quả của vacxin sau khi ñược sử dụng

Hiện tại chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc, Dịch tả vịt cường ñộc ñang ñược lưu giữ tại Trung tâm bằng phương pháp truyền thống, rồi ñông khô và ñược bảo quản ở nhiệt ñộ -500C Trong quá trình giữ giống, tính kháng

nguyên, ñặc tính sinh học, ñộc lực và tính ổn ñịnh của virus có thể thay ñổi do

nhiều yếu tố ảnh hưởng Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc và Dịch tả vịt cường ñộc chủng 7/69 Ứng dụng chủng virus Dịch tả vịt cường ñộc 7/69 trong kiểm nghiệm vacxin”

2 Mục ñích của ñề tài

- Xác ñịnh ñược một số ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc, Dịch tả vịt cường ñộc chủng 7/69 ñược lưu giữ tại TTKNTTYTWI

- Kết quả của ñề tài ñược ứng dụng trong kiểm nghiệm vacxin phòng bệnh Dịch tả vịt

3 Ý nghĩa khoa học của ñề tài

Trên cơ sở nghiên cứu ñặc tính sinh học của chủng virus Dịch tả vịt nhược ñộc, Dịch tả vịt cường ñộc chủng 7/69, từ ñó giúp ích cho việc giữ các chủng giống vi sinh vật thú y khác một cách có hệ thống

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Năm 1930, tại Hà Lan, De Zeeuw mô tả một trường hợp bệnh tương

tự xảy ra ở một ñàn vịt 150 con Năm 1942, dịch lại tái phát ở ñất nước này làm chết 2600 trong tổng số 5700 vịt Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám khi vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, dạ dày tuyến, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu ở cuống họng và lỗ huyệt Lần này Boss ( 1943) ñã phân lập ra virus

và cấy truyền 18 ñời trên vịt

Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng virus do Boss phân lập ñược, Jansen

và Kunst ñã ñề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) OIE (2000) Bệnh dịch tả vịt còn có các tên gọi khác nhau như: Endenpest (Hà Lan), Pest

du canard (Pháp), Enteupest (ðức) (Nguyễn Xuân Bình, 2006)

* Phân bố bệnh

Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt ñã ñược Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964 Năm 1970, Gaudry phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp, Asplin phát hiện bệnh ở Anh Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroij công bố bệnh dịch tả vịt xảy ra

ở ðức Do sự lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ các nước châu

Âu, đặc biệt là ðức đã đề cao biện pháp cách ly thuỷ cầm bằng lưới trong khoảng thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005 Tuy nhiên tỷ lệ chết đã tăng đột biến trong những ngày này Tổng cộng cĩ 17/124 (14%) lồi chim trưởng thành và 149/184 (81%) lồi chim 1 năm tuổi bị chết Phản ứng trung hồ sử dụng kháng huyết thanh dịch tả vịt đã phát hiện vịt và các lồi chim chết do bệnh dịch tả vịt

Tại Châu Mỹ, bệnh dịch tả vịt được chẩn đốn lần đầu tiên ở tây bán cầu vào năm 1967 từ một vùng sản xuất vịt thương phẩm tập trung tại hạt Suffolk, New York (Leibovitz and Hwang, 1967) Vụ dịch đầu tiên xảy ra trên đàn thuỷ cầm hoang ở Mỹ xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam Dakota Vụ dịch này đã tấn cơng với sự tàn phá nhanh chĩng và khốc liệt Gần 40% của 100.000 lồi thuỷ cầm trú đơng, hầu hết là vịt trời đã bị chết Vào thời kỳ cao điểm của dịch, mỗi ngày chết hơn 1000 chim Tất cả những lồi thuỷ cầm đại diện tại hồ Andes đều bị gánh chịu bao gồm ngỗng Canada, vịt trời, vịt đen, vịt lai nhọn đuơi, vịt trời Mỹ, vịt gỗ, vịt

mỏ nhọn Mỹ đầu đỏ mắt vàng, vịt Nga và vịt Bắc Kinh Những lồi chim cịn sống sau vụ dịch ở hồ Andes đã phân tán rộng khắp vùng Bắc Mỹ Những mẫu máu được lấy từ những vịt sống sĩt ở hồ Andes đã chỉ ra rằng cĩ tới 30%

số vịt đã bị phơi nhiễm virus Tại tiểu bang Michigan (Mỹ) bệnh dịch tả vịt đã được báo cáo vào năm 1979 trên vịt Nga và vịt trời Brand C.J et at.(1984)

đã xác nhận bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Mỹ Năm 1993 bệnh dịch tả vịt lại tái phát ở hồ Finger (Mỹ)

Tại Châu Á, năm 1944 bệnh xảy ra ở Ấn ðộ và tái phát vào năm 1963 Năm 1968, Jansen cơng bố bệnh xảy ra ở Trung Quốc Khi nghiên cứu về bệnh này, Mukerji xác nhận chủng virus của Ấn ðộ và chủng virus của Hà Lan cĩ cùng tính chất kháng nguyên Năm 1976, 1977 bệnh đã phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại tới 650.000 vịt (Voxapeer Suwathanaviroij, 1978) Năm 1979 đã cĩ báo cáo về sự xuất hiện bệnh dịch tả vịt ở đàn vịt trời và vịt Muscovy

1.1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt trên thế giới

* Nghiên cứu về miễn dịch và vacxin phòng bệnh

Những nghiên cứu về ñáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào và xác ñịnh ñộ dài của tiêm chủng vacxin Dịch tả vịt qua từng qui trình cũng ñược nhiều tác giả nghiên cứu

Thực hiện tiêm phòng vacxin thương mại cho vịt ở nhiều lứa tuổi và công cường ñộc sau tiêm chủng 14 ngày bằng chủng KLM7 và KPV8 Kết quả cho thấy tiêm phòng giai ñoạn từ 30 – 124 ngày tuổi bảo hộ ñạt từ 88.9 – 100% Tiêm chủng lúc 2 tuần tuổi bảo hộ 76.5% và tiêm phòng ở vịt nhỏ hơn thì không có sự bảo hộ ( Balla, 1984)

Dùng vacxin Dịch tả vịt chủng Hà Lan và loại vacxin chế từ chủng gây bệnh Dịch tả vịt ở ñịa phương thuộc tỉnh Chachoensao, Thái Lan ñể tiêm phòng cho vịt lúc 3 – 4 tuần tuổi Kết quả kiểm tra bằng công cường ñộc cho thấy tỉ lệ bảo hộ ñạt 100% ñến 8 tháng tuổi ( Tantaswasdi, 1987)

Dùng vacxin virus sống nhược ñộc ” AKV ” của Viện Thú Y Liên Bang Nga tiêm phòng cho vịt 10 – 15 ngày tuổi Kết quả công cường ñộc cho thấy vacxin bảo hộ ñược 60% ñàn vịt sau khi tiêm chủng 5 tháng (Sergeev, 1990)

Nghiên cứu của Sharma (1996 ) cho thấy, tiêm phòng vacxin ñược làm thích nghi trên nguyên bào sợi phôi gà ở liều 10 4.5 EID50 / ml có khả năng chống lại virus công cường ñộc sau khi tiêm phòng trong vòng 24 giờ Bordolai et al (1994 ) cũng cho rằng vacxin cấy chuyển 12 lần qua môi trường tế bào sơi phôi gà là ưu việt, có hiệu quả cao và không xảy ra phản ứng ñối kháng Tuy nhiên, Wang et al (1984 ) thì nhận thấy vacxin Dịch tả vịt làm chết gà con khi tiêm lúc 5 ngày tuổi

Kulkarni (1998) thí nghiệm ñánh giá miễn dịch của vacxin Dịch tả vịt của 2 loại vacxin thị trường và vacxin nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy tiêm vacxin 2 lần ñã làm tăng tỉ lệ bảo hộ so với tiêm liều

ựơn với cả hai loại vacxin ựược khảo sát Nghiên cứu vacxin nhược ựộc nhị giá phòng cùng một lúc bệnh Dịch tả vịt và Viêm gan vịt Nhận thấy vacxin

an toàn khi tiêm ựến liều 100, bảo hộ chống bệnh Viêm gan vịt ựến 6 tháng và bệnh Dịch tả vịt ựến 9 tháng

Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng tiêm vacxin kịp thời vào ổ dịch sẽ hạn chế một phần thiệt hại do sự hình thành interferon chống lại virus Dịch tả vịt (Zheng,1983) Nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt trên ngỗng ở hạt Zhi Ờ an, tỉnh Fujian, Trung Quốc vào các năm 1978, 1980 ựã kết luận rằng, vacxin tạo sự bảo hộ ựầy ựủ và ựược thực hiện như một phương pháp khẩn cấp khi bệnh ựã xảy ra

Ngoài ra sự tác ựộng của các chất gây ô nhiễm mội trường ựến sức ựề kháng và ức chế miễn dịch cũng ựược một số tác giả quan tâm nghiên cứu

Goldberg (1990) ựã so sánh tỉ lệ vịt chết khi công cường ựộc vịt bị nhiễm dầu nhiên liệu, dầu thô và ựối chứng dương với vịt ựược ức chế miễn dịch bằng cyclophosphamid ( một chất ựược biết là gây ức chế miễn dịch) Kết quả cho thấy các hóa chất gây ô nhiễm môi trường mà vịt ăn phải có thể ảnh hưởng ựến tình trạng miễn dịch, làm gia tăng nguy cơ bệnh Dịch tả vịt và tăng tỉ lệ chết trong ựàn

1.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt ở trong nước

Các nghiên cứu về Dịch tả vịt ở Việt Nam ựược bắt ựầu từ những năm

1960 và tập trung nhiều ở các tỉnh phắa Bắc Các nghiên cứu mở ựầu góp phần ựáng kể cho việc phòng chống bệnh Dịch tả vịt tại Việt Nam

Năm 1963, tại Cao Bằng, bác sỹ thú y đặng Trần Dũng cho biết bệnh dịch tả vịt ựã xuất hiện làm thiệt hại trên 3000 vịt

Tháng 5/1969, trong vòng 3 tháng bệnh dịch tả vịt ựã làm thiệt hại tới

15000 vịt ở 4 huyện ngoại thành Hà Nội Cũng năm này, Vũ đình Tiếu và Mai Anh phối hợp với xắ nghiệp thuốc thú y Trung ương I sản xuất vacxin nhược ựộc Dịch tả vịt bằng chủng virus vacxin nhập từ Trung Quốc Vacxin

có tỉ lệ bảo hộ từ 28 – 80 %, góp phần khống chế dịch bệnh ở Hà Nội và Thanh Hóa trong thời gian này

Năm 1978, Công ty thuốc Thú y Trung Ương II ( TP.HCM ) bắt ñầu sản xuất vacxin Dịch tả vịt nhược ñộc nuôi cấy trên phôi trứng vịt từ chủng virus Dịch tả vịt Trung Quốc Vacxin ñược sử dụng rộng rãi góp phần phòng chống bệnh Dịch tả vịt trong cả nước hơn 2 thập kỉ vừa qua

Nghiên cứu của Trần Minh Châu (1980 ) cho thấy tiêm vacxin nhược ñộc pha loãng với tỉ lệ 1/500 cho vịt có tỉ lệ bảo hộ 50% ở 30 ngày tuổi và 45% ở 45 ngày tuổi Nhưng pha với tỉ lệ 1/200 và 1/100 thì tỉ lệ bảo hộ là 100% ở 45 ngày tuổi và 50% ở 90 ngày tuổi Tác giả kết luận nồng ñộ virus vacxin có ảnh hưởng ñến ñộ dài miễn dịch của vịt con và ñưa vacxin vào cơ thể qua ñường tiêm bắp hoặc tiêm dưới da cho bảo hộ chắc chắn hơn nhỏ mắt, mũi

Năm 1898, Phạm Thị Lan Thu và Thân Thị Hạnh cho biết ñàn vịt của Phú Khánh trong những năm 1980-1986 thường phát ra bệnh và lây lan nhanh

ở nhiều nơi Các tác giả ñã tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên ñàn vịt ở Phú Khánh

Lê Văn Lãnh (1991) nghiên cứu ñặc tính sinh học của virus vacxin dịch tả vịt chủng Jansen và cho biết virus vacxin có tính ổn ñịnh khi nuôi cấy trên phôi gà và tế bào xơ phôi gà 1 lớp, chỉ số ELD50 biến ñộng trong khoảng

an toàn cho mọi lứa tuổi vịt, hiệu lực của vacxin cao Vacxin ñược chế biến dưới 2 dạng là vacxin tươi và vacxin ñông khô

Vacxin tươi thường ñược ñóng ở Ampulle 100 liều, chỉ bảo quản tối

ña là 4 tháng ở kho lạnh và phải dùng không quá 6 giờ khi ñã pha loãng vacxin bằng nước sinh lý Vacxin ñông khô thì thời gian bảo quản dài hơn (khoảng 1 năm) và ít bị mất hiệu lực khi gặp ñiều kiện bất lợi Vacxin ñông khô có thể ñóng Ampulle 100 liều hoặc chai có từ 500-1000 liều (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) Tuỳ theo liều ñóng vacxin mà pha

loãng với nước sinh lý ñủ cho 0,2ml/vịt con và 0,3-0,5ml/vịt lớn ðường tiêm chủ yếu là dưới da hoặc bắp lườn

Nguyễn Ngọc Huân (2006), khuyến cáo sử dụng vacxin dịch tả vịt ñông khô của Navetco trong quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho vịt nuôi ở nông hộ

1.2 Một số ñặc ñiểm của virus dịch tả vịt và bệnh dịch tả vịt

Virus gây bệnh dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus Virus chỉ có một serotyp ñược biết ñến nhưng có nhiều chủng có ñộc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh, 2001) Theo Li et at.(2006) virus gây bệnh dịch tả vịt có thể ñược phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae

là 93,5 nm, trong nguyên sinh chất có ñường kính là 136 nm và thành thục ở không bào với ñường kính 250 nm Bằng phương pháp lọc qua màng lọc Hess and Dardini (1968) ñã nhận xét, virus dịch tả vịt nhược ñộc chủng Jansen và virus cường ñộc có kích thước 150 - 250 nm

1.2.2 Sức ñề kháng

Với nhiệt ñộ, ở 220C virus giảm dần tính gây nhiễm ñến 30 ngày thì chết Virus bị mất hoạt tính ở 500C sau 2 giờ 30 phút Nếu ñược sấy khô bằng CaCl2 thì sau 9 ngày virus bị chết Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) ở 00C -

40C virus không bảo quản ựược 3 tháng nhưng ngâm trong dung dịch Glyxerin 50% thì virus giữ ựược ựộc lực trong thời gian trên Trong ựiều kiện lạnh từ -100C ựến

-200C, virus có thể tồn tại rất lâu Làm ựông khô các chất chứa virus không những có thể giữ virus nhiều năm mà không làm mất ựộc lực của virus

Với pH môi trường, virus ổn ựịnh ở pH từ 5-10 và bị bất hoạt khi pH <

3 hoặc pH > 10

Với một số nhân tố hoá học, virus dịch tả vịt rất nhạy cảm với ete và chloroform Dưới tác dụng của 2 chất này, virus bị phá huỷ Kunst (1967) cho rằng Natri lauryl sulfate, Natridesoxycholate, Zephirol, Saponin có ảnh hưởng tới virus Theo Nguyễn Thát (1975) thì cồn 750 diệt virus trong 5-30 phút, acid phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút NaOH 2% và NH4OH 0,5% ở 220C cũng giết chết virus sau 30 phút

Với một số enzym, virus dịch tả vịt bị các men Trypsin, Chimotrypsin, Lypase của tuỵ phá huỷ (Dardini A.H and W.R Hess, 1968)

Ở môi trường ngoài, với ựiều kiện nhiệt ựộ phòng thắ nghiệm, virus

có thể tồn tại tới 30 ngày OIE (2006) Trong ựiều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài, 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt chúng vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987)

1.2.3 độc lực

đã xác ựịnh ựược một số chủng virus dịch tả vịt có ựộc lực khác nhau:

- Hà Lan có chủng O ựộc lực mạnh nhất, sau ựó ựến các chủng W59, W60, N (Jansen, 1968)

- Việt Nam có chủng 769, 880 có ựộc lực mạnh nhất, sau ựó là các chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987)

Nguyễn đức Hiền (2005) phân lập một chủng virus gây bệnh dịch tả vịt

ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có ñộc lực cao, có khả năng gây bệnh

và gây chết vịt ở phòng thí nghiệm khi tiêm bắp với liều 103EID50/ml

1.2.4 ðặc tính nuôi cấy

Virus dịch tả vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, không hấp thụ hồng cầu Trong tế bào phôi vịt, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành tiểu thể bao hàm Trong môi trường nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình thành Plague Khi có mặt bổ thể, kháng thể dịch tả vịt có khả năng làm tan tế bào xơ phôi vịt bị nhiễm virus

* Nuôi cấy trên phôi

Theo Jansen (1968) virus dịch tả vịt sau khi ñã tiêm truyền trên phôi vịt

sẽ dễ dàng thích nghi trên phôi vịt

Tuy vậy, khi nuôi cấy trên phôi vịt, tỷ lệ chết của phôi không cao và theo kinh nghiệm thì virus Dịch tả vịt của Việt Nam có vẻ như khó nuôi cấy trên phôi vịt (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1978)

Về khả năng nhân lên trên phôi của virus dịch tả vịt, Trần Minh Châu (1980) cho rằng màng nhung niệu là ñường tiêm truyền tốt nhất Theo Nguyễn Như Thanh (2001) nuôi cấy virus trên màng niệu ñệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, ñầu; gan và quả tối có ñiểm xuất huyết

và hoại tử Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày

Virus dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết phôi chết sau 3-5 ngày Virus cường ñộc dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền ñầu tiên trên phôi vịt ðối với phôi vịt 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 ñời liên tiếp virus mới thích nghi

Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi vịt ñộc lực của virus

sẽ giảm dần với vịt Người ta sử dụng những chủng virus nhược ñộc này qua

phôi vịt, phôi vịt ñể chế tạo vacxin

* Nuôi cấy trên tế bào

Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi vịt một lớp và gây ra biến ñổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968), ( Burgess ,1981) công bố virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi vịt Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến ñổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK 15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987)

Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường ñộc trên tế bào xơ phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) Lớp tế bào này sẽ bị phá huỷ hoàn toàn vào ngày thứ 4 Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng ñộ loãng, có thể phát hiện ñược Plague (những

ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc ñỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng, 1972) Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền ñỏ, hình tròn, bờ không gọn và có ñường kính 1-2 mm (Trần Minh Châu, 1987)

Theo Dardini and Hess (1968), Plague của virus dịch tả vịt cường ñộc hình tròn, to nhỏ không ñều, có ñường kính từ 1-8 mm Plague của virus dịch

tả vịt nhược ñộc thì ñều hơn, có bờ gọn và sáng, ñường kính là 3-4 mm Nguyễn Như Thanh (2001) mô tả, với các chủng virus nhược ñộc, Plague ñều, gọn và sáng rõ, ở ngày thứ 3 có ñường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4-7 mm và sau 14 ngày sẽ là 10 mm

Sự xuất hiện Plague trên các môi trường nuôi cấy khác nhau là khác nhau Virus cường ñộc thì nhân lên và hình thành các Plague ñẹp theo thứ tự

các môi trường sau: tế bào xơ phôi ngan và uyên ương, xơ phôi vịt Bắc Kinh, vịt ñen, vịt ñầu ñỏ; còn Plague trên tế bào xơ phôi vịt mốc và vịt bãi là kém nhất Virus dịch tả vịt nhược ñộc của Hà Lan lại có thứ tự các môi trường thích hợp khác: tế bào xơ phôi vịt Bắc Kinh, tế bào xơ phôi vịt, trĩ Mông Cổ, cun cút ðối với virus nhược ñộc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi trường tế bào xơ phôi vịt Chỉ sau 24 giờ nuôi cấy virus, tế bào ñã bắt ñầu có hiện tượng huỷ hoại Tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng ñám và có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học (Nghiên cứu của bộ môn Vi sinh vật trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội)

1.2.5 Truyền nhiễm học

* D ịch tễ học

- Loài vật mắc bệnh

Bệnh dịch tả vịt là bệnh của nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt ñầu

ñỏ, … Các loài thuỷ cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài chim hoang dã cũng cảm nhiễm bệnh (Docherty D.E và cs 1992 ; Friend, 1973)

Trong phòng thí nghiệm, vịt con là cảm nhiễm nhất ñối với bệnh Virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968)

Nhiều nghiên cứu cho thấy các thủy cầm trong hoang dã là vật mang

trùng và gieo rắc virus ñịnh kỳ khi di trú tạo thành những ổ bệnh Dịch tả vịt cho thủy cầm nuôi do sử dụng chung nguồn nước

Việc nhập khẩu con giống từ những nơi từng xảy ra bệnh cũng có thể là nguyên nhân làm bộc phát dịch bệnh tại những quốc gia chưa từng có bệnh do thủy cầm có thể mang virus trong cơ thể có thể kéo dài tới 4 năm

- Chất chứa và bài xuất virus

Trong cơ thể gà bệnh, hầu hết các cơ quan phủ tạng ñều chứa virus Thường 44 giờ sau khi nhiễm có thể tìm thấy virus ở thận, lách, túi Fabricius, ñường hô hấp, tụy và não Máu chứa virus nhưng không thường xuyên

Virus ñược bài xuất qua phân, nước mắt, nước mũi Cơ thể bài xuất virus bắt ñầu từ 20 -24 giờ trước khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng và kéo dài suốt thời kỳ bệnh cho ñến khi ra khỏi hoặc chết Gà lành bệnh trở thành vật mang trùng và bài xuất virus ra môi trường xung quanh trong khoảng 2 tuần có khi kéo dài ñến 5 tuần

- Cơ chế sinh bệnh

ðường xâm nhập của virus vào cơ thể sẽ ảnh hưởng ñến khả năng gây chết ñộng vật cảm thụ Theo Spriker et al (1996) tiêm truyền bằng ñường tiêm bắp thị chỉ cần một lượng virus thấp ñể gây bệnh, qua ñường mũi, niêm mạc mắt cần nhiều virus hơn và qua ñường miệng cần lượng virus lớn nhất Theo Lê Huy Chính và cs (2003) cơ chế sinh bệnh có thể tóm lược như sau.Khi Herpesvirus xâm nhập vào cơ thể, nó sẽ hấp phụ vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ các thụ thể của tế bào Trong khoảng 6-8 giờ ñầu tiên, virus xâm nhập vào nguyên tương tế bào do sự hòa màng, sau ñó là sự cởi vỏ và phức hợp DNA – protein sẽ di chuyển vào nhân tế bào vật chủ trong vòng 12 giờ

Sau khi tập hợp trong nhân, DNA virus sao mã thành mRNA và nucleocapsid sẽ di chuyển ñến tế bào chất ñể thu nhận vật chất tổng hợp protein virus Sự lắp ráp hình thành capsid của virus sảy ra trong nhân tế bào Khi capsid ñi

ra khỏi nhân tế bào vật chủ, áo ngoài virus sẽ ñược tạo thành từ nhân tế bào Sau cùng nhờ hệ thống enzyme, virus phá vỡ tế bào thoát ra ngoài và theo máu lưu hành tác ñộng toàn cơ thể Chu kỳ sinh sản của Alpha Herpesvirus khoảng 18 giờ, nhanh nhất trong họ Herpesvirus, cho thấy bệnh Dịch tả vịt có thời gian nung bệnh tương ñối ngắn

Những tổn thương ban ñầu xuất hiện trong thành mạch máu bao gồm những mạch máu nhỏ và những tiểu tĩnh mạch Kết quả của sự tổn thương mạch máu tách ra, nhu mô bị thoái hóa và biến ñổi gây viêm hoại tử và xuất huyết ở hầu hết các cơ quan nội tạng

Từ hệ thống mạch máu, virus xâm nhập vào tế bào thần kinh, ñịnh vị và phát triển gây hủy hoại tế bào thần kinh, gây hiện tượng co giật, bại liệt ở thủy cầm mắc bệnh

Thủy cầm ủ bệnh 2-8 ngày, thủy cầm có thể chết trong vòng 8 ngày, hoặc có thể kéo dài làm kế phát các bệnh nhiễm khuẩn khác

Trong một số ñiều kiện nhất ñịnh, bệnh có thể ở thể ẩn hoặc duy trì, lúc này virus trở thành hình thái tiềm tàng trong tế bào Dù vịt không thể hiện triệu chứng bệnh nhưng do một số tế bào nhiễm virus vẫn tổng hợp và giải phóng virus nên mang trùng sẽ là nguồn gieo rắc mầm bệnh trong bầy ñàn Trạng thái tiềm tang có thể làm bệnh phát ra từng ñợt theo chu kỳ

1.2.6 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh ñối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần ñầu tiên xảy ra hay ñã từng xảy ra ñối với ñàn vịt

Ở ñàn vịt con bệnh thường bắt ñầu bằng những dấu hiệu: Nhiều con tự nhiên lờ ñờ, không thích vận ñộng, không muốn xuống nước Ở vịt lớn khi lùa

ăn một số con rớt lại sau ñàn Bắt xem thấy chân có dấu hiệu liệt, thân nhiệt cao Ở ñàn vịt ñẻ khi bệnh xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống, có khi

ngừng ñẻ hẳn Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, ñứng một chân, ñầu rúc vào cánh Trong ñàn vịt nhiều con có tiếng kêu khản ñặc Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt ñỏ Lúc ñầu chảy nhiều nước mắt làm ướt cả vùng lông dưới mi mắt Sau nước mắt ñặc lại có màu vàng như mủ ñóng ñầy khoé mắt và có khi làm

2 mi mắt dính lại với nhau Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc ñầu trong, sau ñặc lại Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi Nhiều con ñầu sưng to, sờ nắn có cảm giác ñầu mềm như quả chuối chín Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù thũng Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và có màu trắng xanh Hậu môn bẩn, lông dính bết ñầy phân (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Ngoài ra, bệnh dịch tả vịt còn có một số triệu chứng khác ñáng chú ý như: Vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh Vịt tì mỏ xuống ñất Vịt ñực bị

sa dương vật, niêm mạc có những vết loét Vịt ñẻ giảm sản lượng trứng mạnh (Phạm Quang Hùng, 2003) Sau khi xuất hiện triệu chứng ñược 5 - 6 ngày, vịt bệnh gầy rạc, tứ chi liệt, nằm một chỗ, rũ cánh, thân nhiệt giảm dần rồi chết

1.2.7 Bệnh tích

Xác chết gầy, bẩn, da vùng ñầu, cổ, ngực, bụng, ñùi xuất huyết lấm tấm Tổ chức liên kết dưới da vùng ñầu, cổ thuỷ thũng, có dịch trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng Mổ khám các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ tim thì thấy ở các cơ quan này ñều biểu hiện bệnh tích sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết, ở gan có những ñiểm hoại tử màu trắng ñục, to bằng ñầu ñinh ghim hoặc to hơn (Trần Kim Anh, 2004)

Bệnh tích của bệnh dịch tả vịt ñặc trưng là ở ñường tiêu hoá có những chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng, bên trên phủ lớp màng giả khó bóc Ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn nhìn từ ngoài vào thấy

có màu nâu hoặc tím rất ñặc trưng Ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những ñặc

trưng riêng: Vịt bố mẹ bệnh tích chủ yếu là ở tuyến ức, xuất huyết mơ và tổn thương bộ máy sinh sản Cịn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu ở các Lymphoid

Theo Nguyễn ðức Hiền (2005) cơng bố tỷ lệ bệnh tích đặc trưng trên vịt thực nghiệm, trong đĩ: Niêm mạc mắt xuất huyết (95,45%); phổi viêm, tụ máu, thuỷ thũng (95,45%); dạ dày tuyến xuất huyết (100%); ruột non xuất huyết viêm loét (100%); ruột già xuất huyết viêm loét (97,73%); lách tụ máu

cĩ nốt hoại tử và gan xuất huyết cĩ nốt hoại tử (100%)

1.2.8 Chẩn đốn bệnh

ðể chẩn đốn bệnh dịch tả vịt cĩ nhiều phương pháp được sử dụng, dưới đây là sơ đồ chẩn đốn bệnh dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Nơng nghiệp và phát triển nơng thơn 10 TCN 815-2006

* Chẩn đốn lâm sàng

Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ học, bệnh sử và truyền lây của bệnh như: Bệnh xảy ra ở vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi, bệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng 2-3 ngày

Kiểm tra triệu chứng: Vịt giảm ăn, mất thăng bằng, ỉa phân lỗng, xù lơng Mắt vịt cĩ dử, mí mắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi

Sơ đồ chẩn đốn bệnh dịch tả vịt

Kiểm tra bệnh tích: Vịt trưởng thành cĩ hiện tượng gan bị bạc màu Con đực trưởng thành cĩ thể xảy ra hiện tượng dương vật bị thay đổi vị trí Ở con cái quan sát thấy các nang trứng bị xuất huyết Mạch máu bị tổn thương, tổn thương hệ bạch huyết, thối hố nhu mơ, ống tiêu hố cĩ nhiều chất nhờn ðối với bệnh tích vi thể thấy xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các biểu mơ của hệ thống tiêu hố

Phân lập virus

PCR

Lấy mẫu bệnh phẩm

ðặc điểm dịch tễ học

Phát hiện virus

Phát hiện kháng thể (SN)

Kiểm tra lâm sàng

Chẩn đốn phân biệt bệnh dịch tả vịt với một số bệnh sau:

Bệnh viêm gan do virus: Bệnh chỉ tập trung ở vịt con từ 1-3 tuần tuổi Gan chủ yếu bị viêm, xuất huyết thành điểm, thành vệt, ít cĩ hiện tượng hoại tử

Bệnh tụ huyết trùng và phĩ thương hàn: Do Pasteurella và Salmonella

gây nên ðây là những vi khuẩn thường trú trong cơ thể vịt, ngay cả ở vịt khoẻ Cho nên bệnh dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khĩ khăn cho cơng việc chẩn đốn bệnh Tuy nhiên nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phĩ thương hàn đơn thuần thì khi điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu cĩ thể nhanh chĩng dập tắt dịch

- Ly tâm 2.000 vịng/15ph

- Lấy dịch trong ở trên

- Kiểm tra vơ trùng: Trên mơi trường nước thịt BHI, hoặc trên mơi trường thạch máu

b Phân lập virus

* Phân lập trên vịt con

Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg) với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn Nếu bệnh phẩm cĩ virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt giống như đã mơ tả ở phần 2.1.3

* Phân lập trên trứng vịt cĩ phơi

- Tiêm 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mơ hoặc màng nhung niệu phơi vịt 11-12 ngày: 5 phơi/mẫu bệnh phẩm

- Trứng ñược ấp tiếp ở tủ ấp 370C Soi trứng Loại bỏ những phôi chết trong khoảng 24h sau khi tiêm

- Virus dịch tả vịt gây phôi chếtsau 4-10 ngày với ñặc trưng: Xuất huyết lan rộng

- Thu hoạch gan phôi và nước niệu ñể giám ñịnh virus

* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)

- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc ñĩa nuôi cấy (ñĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập

- Thu hoạch hỗn dịch tế bào, ñông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám ñịnh virus

c Phương pháp giám ñịnh virus

* Phương pháp trung hoà trên trứng vịt có phôi (VN-Virus Neutralization):

- Chuẩn bị:

+ Pha loãng virus phân lập: Nồng ñộ 10-1-10-9 với dung dịch PBS + Lô ñối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng ñộ virus ñã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô ñối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng ñộ virus ñã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

- đánh giá kết quả:

+ Tắnh toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index) Nếu kết quả phân lập và giám ựịnh dương tắnh với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương pháp trung hoà VN), kết luận có virus dịch tả vịt

* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):

- Chuẩn bị:

+ Tế bào DEF trên ựĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ ựã nuôi cấy ựược 2-3 ngày + Pha loãng virus phân lập ở các nồng ựộ 10-1-10-9 với môi trường nuôi cấy MEM

+ Lô ựối chứng dương: trộn kháng huyết thanh dương tắnh dịch tả vịt với các nồng ựộ virus ựã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô ựối chứng âm: trộn huyết thanh âm tắnh với các nồng ựộ virus ựã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

- Tiến hành:

+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào ựĩa ựã nuôi cấy tế bào DEF (ựĩa 96 lỗ), 100ộl/lỗ, 8 lỗ/nồng ựộ

+ Ủ ựĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1h

+ đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100ộl/lỗ

+ Tiếp tục ủ ựĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C

+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co tròn và tụ lại thành ựám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử

- đánh giá kết quả:

+ Tắnh toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index) Nếu thuỷ cầm chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể dịch tả vịt (bằng phương pháp trung hoà SN), kết luận thủy cầm ựã nhiễm virus dịch tả vịt

* Chẩn ựoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

đã phát triển phương pháp PCR ựể phục vụ cho việc phân lập virus dịch

tả vịt ở Việt Nam Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh và chắnh xác

giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirus gia cầm khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khắ quản truyền nhiễm và bệnh do Herpesvirus gây ra ở ngỗng (Pritchard L.I et at., 1999)

Theo Vũ Minh Thục (2004), nhược ựiểm chắnh của phương pháp PCR là

sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả Ộdương tắnh saiỢ, và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thắ nghiệm Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999) ựã khẳng ựịnh sự ựặc trưng của ựoạn mồi ựã ựược kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như ựại bàng, chim câu, vịt, Kết quả cho thấy sự khuếch ựại vẫn không cho sản phẩm điều này

có nghĩa là phản ứng này ựặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt Với hai ựoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR ựược ựánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn ựoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bào

1.2.9 Miễn dịch chống virus Dịch tả vịt

* đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu

Khả năng ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu của vịt ựối với virus dịch

tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không ựặc hiệu, bao gồm:

lên của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng virus Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông ựiệp của virus ở Ribosome của tế bào (Nguyễn đường, 1990)

Jansen (1968) khi nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện tượng cản nhiễm ựã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt ựã bị nhiễm virus dịch tả vịt cường ựộc trước khi tiêm vacxin Nếu nhiễm virus cường ựộc dịch tả vịt trước 4 giờ thì trong 10 vịt ựược can thiệp bằng vacxin

sẽ sống 8 con Nếu can thiệp vacxin lúc vịt nhiễm virus trước 8 giờ, 15 vịt phát bệnh nhưng còn sống 3 con Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên, dù

tiêm vacxin vịt vẫn không ñược bảo hộ Như vậy rõ ràng interferon có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus dịch tả vịt và hiện tượng cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch ñể nhanh chóng dập tắt dịch

virus do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào ñích (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tín hiệu hoạt hoá và dung giải tế bào ñích (Vũ Triệu An, 1997)

gây bệnh Từ ñó tạo ñiều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên

khỏi bệnh thì vịt sẽ có kháng thể kháng virus dịch tả vịt trong cơ thể Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì vịt khỏi bệnh có thể bị mắc trở lại Bệnh tái phát thường ở thể ẩn, không có triệu chứng rõ Nếu khám vịt ốm, chỉ thấy bên dưới lưỡi có nốt rộp, từ nốt rộp có tác giả ñã phân lập ñược virus dịch tả vịt Do mang ñặc tính của một virus Herpes, nên khi gặp ñiều kiện thuận lợi, virus lại tiếp tục phát triển và gây bệnh làm thành nốt rộp mới Tác giả ñã ñề xuất phương pháp kiểm tra bệnh dịch tả vịt ẩn tính bằng cách khám nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi (Trần Minh Châu, 1987)

nhờ ñược tiêm vacxin Hiệu lực và ñộ dài ñáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại vacxin, ñường ñưa vacxin vào cơ thể, Trên thực tế, khả năng ñáp ứng miễn dịch của ñàn vịt khi sử dụng vacxin dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược ñộc Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn (Fenner, 1974) Về ñường ñưa vacxin, (hawky S.A and Sandhu T.S, (1997) cho rằng ñường ñưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm dưới da Phương pháp nhỏ mắt, nhỏ mũi ñòi hỏi nhiều thời gian mà hầu như không gây ñược miễn dịch Tuy nhiên tại Việt Nam, nghiên cứu về hiệu lực miễn dịch phòng bệnh của vacxin dịch tả vịt khi áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau trong sản xuất, Nguyễn ðức Hiền (1999) cho biết với phương pháp nhỏ mắt hay tiêm bắp hoặc phối hợp cả hai phương pháp trên ñều cho ñáp ứng miễn dịch không khác nhau nhiều Tuổi tiêm chủng ñầu tiên là 14 ngày tuổi thì có ảnh hưởng tốt ñến hiệu quả sử dụng vacxin

mẹ ñược truyền cho vịt con qua lòng ñỏ trứng Lượng kháng thể dịch tả vịt ở trong lòng ñỏ cao hay thấp phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể trong huyết thanh vịt mẹ Ở những vịt con một ngày tuổi, hàm lượng kháng thể dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm lượng kháng thể trong lòng ñỏ Theo thời gian, hàm lượng kháng thể sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối ña là tới ngày 21 Ngoài

ra, dù vịt con có ñược hưởng kháng thể từ vịt mẹ, nhưng nếu bị nhiễm nhiều virus thì vẫn có thể bị chết vì bệnh dịch tả vịt Như vậy, kháng thể do vịt mẹ truyền cho chỉ có thể bảo vệ ñược vịt con trong những ngày ñầu sau khi nở nếu chúng bị nhiễm một lượng virus rất ít (Fenner, 1974 ; Leibovitz, 1991)

Ở vịt một tháng tuổi, sự hình thành kháng thể chủ ñộng kháng virus dịch tả vịt sẽ bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của kháng thể do tiêm huyết thanh miễn dịch ðối với vịt con có kháng thể tiếp thu của vịt mẹ thì sự hình thành kháng thể chủ ñộng bị hạn chế khi ñược tiêm vacxin lúc 1 ngày tuổi (Trần

Minh Châu ,1986) cho biết ở vịt con ñược tiêm vacxin nhược ñộc dịch tả vịt lúc một ngày tuổi thì tỷ lệ miễn dịch bảo hộ giai ñoạn 20-30 ngày tuổi ñạt 25-50% (nếu là con của vịt mẹ ñược tiêm vacxin trước 6 tháng) Tỷ lệ miễn dịch bảo hộ của vịt con chỉ ñạt 20-40% trong giai ñoạn 10-20 ngày tuổi (nếu là con của vịt mẹ ñã ñược tiêm vacxin 1 hay 2 lần) Còn với vịt con mà vịt mẹ không ñược tiêm vacxin thì tỷ lệ bảo hộ ñạt 100% cho ñến 45 ngày tuổi

bị mắc bệnh dịch tả vịt tự nhiên) bằng kháng thể dịch tả vịt Tuy nhiên, việc tạo miễn dịch dạng này không tồn tại lâu trong cơ thể và cũng không mang lại nhiều ý nghĩa trong thực tiễn

1.2.10 Vacxin và phòng bệnh bằng vacxin

* Khái niệm vacxin

Khái niệm “Vacxin” ñược bắt nguồn từ chữ latin “Vacca” có nghĩa là

“bò cái” Nhờ có vacxin phòng bệnh ñã cứu hàng triệu người không chết vì bệnh ñậu mùa, bệnh dại, bệnh lao, Nhiều bệnh truyền nhiễm, nguy hiểm ñối với con người và ñộng vật ñược khống chế và từng bước ñược loại trừ khỏi từng phần Tuy nhiên, cuộc ñấu tranh với bệnh tật, ñặc biệt là bệnh truyền nhiễm ñể bảo vệ sức khoẻ của con người và ñộng vật vẫn còn khá gay go, phức tạp, cho nên việc nghiên cứu, chế tạo các loại vacxin mới và cải tiến nâng cao hiệu lực phòng bệnh các loại vacxin ñã có, vẫn còn ñòi hỏi các nhà khoa học phải quan tâm

giảm tỷ lệ nhiễm bệnh và tăng tác dụng của việc dùng vacxin phòng bệnh

* Một số vacxin phòng bệnh Dịch tả vịt ñang lưu hành tại Việt Nam

Vacxin phòng bệnh dịch tả vịt có 2 loại: Vacxin nhược ñộc và vacxin

vô hoạt

- Vacxin nhược ñộc:

Virus cường ñộc dưới tác ñộng của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua ñộng vật ít cảm thụ, qua phôi, thì ñộc lực của virus giảm ñi

Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên ñược dùng ñể làm vacxin Có hai cách ñể sản xuất vacxin nhược ñộc, bao gồm: tiếp truyền giống virus trên phôi và nuôi cấy virus trên môi trường tế bào xơ phôi vịt một lớp Cả hai loại vacxin trên ñều có ñộ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài sau khi tiêm vacxin (9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch) Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vacxin ñược sản xuất dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin ñông khô

- Vacxin vô hoạt:

ðể vô hoạt virus dịch tả vịt, trước ñây thường dùng hoá chất là formol, gần ñây sử dụng chất BPC (Beta propiolactore) Tại Việt Nam ñã chế thử vacxin vô hoạt như: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxin tím, Vacxin formol gan Theo OIE (2000) vacxin vô hoạt tạo ñược miễn dịch cho ñàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược ñộc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa ñược áp dụng trong sản xuất

Những vacxin dịch tả vịt hiện ñang ñược lưu hành ở Việt nam:

+ Vacxin dịch tả vịt nhược ñộc ñông khô do phân viện thú y miền trung

- Viện thú y sản xuất

+ Vacxin dịch tả vịt nhược ñộc do Công ty TNHH một thành viên

thuốc thú y trung ương NAVETCO 2 (Thành phố Hồ Chí Minh) sản xuất

+ Vacxin dịch tả vịt nhược ñộc do Công ty TNHH một thành viên

thuốc thú y trung ương NAVETCO 2 (Thành phố Hồ Chí Minh) sản xuất trên

môi trường tế bào xơ phôi vịt một lớp

+ Vacxin dịch tả vịt nhược ñộc ñông khô Nobilis Duck Plague nhập

khẩu từ Hà Lan

+ Vacxin dịch tả vịt ñông khô Vaxiduk chủng Jansen nhập khẩu từ Pháp + Vacxin Dịch tả vịt nhược ñộc dông khô do Xí Nghiệp Thuốc Thú Y Trung Ương I sản xuất