KHẢO SÁT XỬ LÝ 1 NAPHTHOL BẰNG HUMIN VÀ BACILLUS SUBTILIS

Các phương pháp chính để loại bỏ 1-naphthol từ môi trường bao gồm: quá trình sử dụng bức xạ năng lượng cao, quá trình xúc tác quang trên các vật liệu bán dẫn, quá trình oxi hoá học, quá

NGUYỄN THỊ HỒNG CHÂU

KHẢO SÁT XỬ LÝ 1-NAPHTHOL BẰNG

HUMIN VÀ BACILLUS SUBTILIS

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Nguyễn đức Lượng

2 TS Hoàng đông Nam

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ờ 2012

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 THAN BÙN VÀ HUMIN 4

1.1.1 Than bùn 4

1.1.2 Humin 6

1.1.3 Một số phương pháp xử lý humin thô 8

1.1.3.1 Phương pháp base (phương pháp kiềm chảy) 8

1.1.3.2 Phương pháp acid 8

1.1.3.3 Ứng dụng của humin 9

1.2 XỬ LÝ NƯỚC THẢI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC 10

1.2.1 Giới thiệu 10

1.2.2 Quá trình sinh hoá trong xử lý nước thải 10

1.2.3 Sự sinh trưởng của vi sinh vật 11

1.2.4 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 12

1.2.4.1 Kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang rắn 13

1.2.4.2 Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel 14

1.2.4.3 Kỹ thuật kết bông tế bào 15

1.2.4.4 Yêu cầu đối với chất cố định 15

1.2.5 Giới thiệu về Bacillus subtilis 15

1.2.5.1 Đặc điểm hình thái 16

1.2.5.2 Đặc tính sinh trưởng 16

1.2.5.3 Ứng dụng của Bacillus subtilis 17

1.3 TỔNG QUAN VỀ 1-NAPHTHOL 18

1.3.1 Giới thiệu về 1-naphthol 18

1.3.2 Tính chất vật lý 18

1.3.5 Nguồn phát sinh 1-naphthol 20

1.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ XỬ LÝ 1-NAPHTHOL 20

1.5 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ PHÂN TÍCH 22

1.5.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 22

1.5.1.1 Phân loại sắc ký 22

1.5.1.2 Hệ thống thiết bị HPLC 24

1.5.1.3 Ứng dụng của phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 24

1.5.2 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thu UV-VIS (phổ kích thích electron) 26

1.5.2.1 Nguyên tắc 26

1.5.2.2 Máy đo phổ hấp thu UV-VIS và nguyên lý hoạt động 26

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 28

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 28

2.1.1 Giống vi sinh vật 28

2.1.2 Nguyên liệu 28

2.1.3 Hoá chất 28

2.1.4 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh 28

2.1.4.1 Môi trường nhân giống (MT1) [1] 28

2.1.4.2 Môi trường xử lý (MT2) [1] 29

2.1.4.3 Môi trường cấy chuyền và trải đĩa 29

2.2 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM 30

2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập humin và khảo sát mẫu humin 31

2.2.1.1 Phân lập humin 31

2.2.1.2 Phổ IR của humin 32

2.2.1.3 Cấu trúc bề mặt của humin 32

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS của 1-naphthol 32

2.2.3.1 Thí nghiệm 3a: Khảo sát sắc ký đồ HPLC của dung dịch

1-naphthol 332.2.3.2 Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của các loại nước lọc dùng

để pha loãng dung dịch 1-naphthol dùng trong phân tích định lượng HPLC 332.2.3.3 Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ

HPLC của 1-naphthol 332.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của

chủng Bacillus subtilis 34

2.2.4.1 Cấy giống và bảo quản giống 342.2.4.2 Giai đoạn nhân giống 342.2.4.3 Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của chủng

Bacillus subtilis 34

2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol của các phương

pháp khác nhau 352.2.5.1 Tạo chế phẩm vi sinh cố định trên humin 352.2.5.2 So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên

humin với các phương pháp khác 362.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xử lý

1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 372.2.6.1 Thí nghiệm 6a: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng humin sử

dụng trong giai đoạn tạo chế phẩm vi sinh cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol 372.2.6.2 Thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến

khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 38

cố định trên humin 39

2.2.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng thích nghi của vi sinh cố định trên humin đối với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao 39

2.2.8 Thí nghiệm 8: Khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 40

2.2.9 Thí nghiệm 9: Khảo sát khả năng tái sử dụng humin để tạo chế phẩm cố định mới 40

2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41

2.3.1 Xác định mật độ tế bào 41

2.3.2 Phân tích định lượng 1-naphthol 41

2.3.3 Tính toán hiệu suất xử lý 1-naphthol 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42

3.1 PHÂN LẬP HUMIN VÀ KHẢO SÁT MẪU HUMIN 42

3.1.1 Phân lập humin 42

3.1.2 Phổ IR của humin 42

3.1.3 Cấu trúc bề mặt của humin 43

3.2 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 2: PHỔ UV-VIS CỦA 1-NAPHTHOL 43

3.3 KHẢO SÁT SẮC KÝ ĐỒ HPLC CỦA 1-NAPHTHOL VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 44

3.3.1 Kết quả thí nghiệm 3a: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 1-naphthol và đường chuẩn của dung dịch 1-naphthol 44

3.3.2 Kết quả thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của các loại nước lọc lên sắc ký đồ của 1-naphthol 46

3.3.3 Kết quả thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ của dung dịch 1-naphthol 48

3.4 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 4: KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TĂNG SINH KHỐI THEO THỜI GIAN CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS 49

3.6 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG XỬ LÝ

1-NAPHTHOL BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN 54

3.6.1 Kết quả thí nghiệm 6a: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng humin trong quá trình tạo chế phẩm vi sinh cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol 54

3.6.2 Kết quả thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 57

3.6.3 Kết quả thí nghiệm 6c: Ảnh hưởng của nồng độ 1-naphthol ban đầu đến khả năng xử lý của chế phẩm vi sinh cố định trên humin 60

3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 7: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THÍCH NGHI

CỦA CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN ĐỐI VỚI

1-NAPHTHOL 64

3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN 66

3.9 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG HUMIN ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH MỚI 68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

4.1 KẾT LUẬN 70

4.2 KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 77

HPLC (High Performance Liquid Chromatography): phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao

Hình 1.1 Sơ đồ tách các hợp chất humic từ than bùn 5

Hình 1.2 Cấu trúc của acid fulvic 5

Hình 1.3 Cấu trúc của acid humic 5

Hình 1.4 Kết quả chụp phổ XRD của humin 6

Hình 1.5 Kết quả chụp phổ IR của humin 7

Hình 1.6 Các nhóm chức trong humin 8

Hình 1.7 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật 12

Hình 1.8 Các phương pháp cố định tế bào 13

Hình 1.9 Hình thái của Bacillus subtilis 16

Hình 1.10 Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis 17

Hình 1.11 Hệ thống thiết bị phân tích HPLC 24

Hình 1.12 Cấu tạo máy đo phổ hấp thu UV-VIS 26

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu chung 30

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập humin 31

Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát sắc ký đồ HPLC của 1-naphthol và các yếu tố ảnh hưởng 32

Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của Bacillus subtilis 35

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau 36

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng humin trong quá trình tạo chế phẩm cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol 38

Hình 3.1 Kết quả phổ IR của humin 42

Hình 3.2 Hình SEM của humin 43

Hình 3.3 Phổ hấp thu UV-VIS của dung dịch 1-naphthol 44

Hình 3.4 Đường chuẩn dung dịch 1-naphthol 45

Hình 3.5 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau 46

Hình 3.8 Đường chuẩn giữa OD và mật độ tế bào vi sinh 50

Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis 51

Hình 3.10 Xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau 53

Hình 3.11 Hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau 53

Hình 3.12 Ảnh hưởng của hàm lượng humin đến khả năng xử lý 1-naphthol 56

Hình 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng humin đến hiệu suất xử lý 1-naphthol 56

Hình 3.14 Ảnh hưởng của pH đến khả năng xử lý 1-naphthol 59

Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất xử lý 1-naphthol 59

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch 1-naphthol ban đầu 62

Hình 3.17 Hiệu suất xử lý 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau 63

Hình 3.18 Khả năng thích nghi với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao 65

Hình 3.19 Hiệu suất xử lý 1-naphthol nồng độ cao của chế phẩm vi sinh cố định trước và sau giai đoạn thích nghi 65

Hình 3.20 Khả năng tái sử dụng của chế phẩm vi sinh cố định trên humin 67

Hình 3.21 Khả năng tái sử dụng humin 69

Hình 3.22 Hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin mới và trên humin tái sử dụng 69

Bảng 1.1 Độ độc của 1-naphthol với các loài sinh vật 20

Bảng 3.1 Đường chuẩn của dung dịch 1-naphthol 45

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các loại nước lọc đến sắc ký đồ của 1-naphthol 47

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ của dung dịch 1-naphthol 49

Bảng 3.4 Mật độ tế bào và giá trị OD tương ứng của Bacillus subtilis 50

Bảng 3.5 Giá trị đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis theo thời gian 51

Bảng 3.6 Hàm lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak) sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau 52

Bảng 3.7 Hiệu suất (H%) xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau 52

Bảng 3.8 Hàm lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak) khi sử dụng các hàm lượng humin khác nhau 55

Bảng 3.9 Hiệu suất (H%) xử lý 1-naphthol khi sử dụng các hàm lượng humin khác nhau 55

Bảng 3.10 Hàm lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak) khi xử lý ở các pH khác nhau 58

Bảng 3.11 Hiệu suất (H %) xử lý ở các pH khác nhau 58

Bảng 3.12 Xử lý 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau 61

Bảng 3.13 Khả năng thích nghi của chế phẩm vi sinh cố định đối với dung dịch

1-naphthol nồng độ cao 64

Bảng 3.14 Khả năng tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 67

Bảng 3.15 Khả năng tái sử dụng humin 68

MỞ ĐẦU

Do xu thế phát triển của xã hội, các nhà máy, khu công nghiệp, vùng kinh tế

ra đời, các đô thị mới được mở rộng… đòi hỏi cần rất nhiều nước sạch Trên thực

tế, thế giới chỉ có khoảng 30 triệu km3 nước ngọt, nguồn dự trữ này không đổi trong khi nhu cầu sử dụng nước luôn tăng; nhu cầu nước hàng năm của thế giới hiện nay vào khoảng 3500 – 3900 tỉ km3 nước sạch, một nửa trong số đó trở thành nước thải

1 m3 nước thải có thể làm nhiễm bẩn mạnh 10 m3 nước sạch nước [3] Do đó nguồn nước mất dần khả năng tự làm sạch, nhanh chóng bị cạn kiệt, gây ra nạn thiếu nước

Nước thải nếu chưa qua xử lý, thải trực tiếp ra môi trường, sẽ ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng nước nói chung và gây tác hại cho sức khỏe con người khi sử dụng Chính vì vậy, xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn qui định là vấn đề rất cấp thiết

Trong những năm gần đây đã có một mối quan tâm ngày càng tăng về nước thải công nghiệp có chứa các hợp chất polyphenol, là những chất hết sức độc hại đối với môi trường và đối với sức khoẻ con người 1-naphthol là một dạng polyphenol được sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp tổng hợp chất hữu cơ, sản xuất chất màu azo, thuốc trừ giun sán, thuốc trừ sâu, trong công nghệ thuộc da và sản xuất giấy Đặc biệt, 1-naphthol được xác định là sản phẩm chính của quá trình phân huỷ thuốc trừ sâu carbaryl trong điều kiện tự nhiên [2] Chỉ với liều nhỏ 1-naphthol,

có thể gây ảnh hưởng xấu tới gan, thận và chức năng của tuyến giáp [17], làm giảm nồng độ testoterone ở nam giới [22] Về lâu dài, 1-naphthol có thể tích tụ ở các mô

và gây ra các khối u ở đại trực tràng [16] 1-naphthol cũng gây độc cho giun, tảo và các loài cá [5] Do độc tính của nó, nước thải công nghiệp có chứa 1-naphthol nhất thiết phải được xử lý trước khi thải ra môi trường

Đã có nhiều nghiên cứu về phương pháp loại bỏ 1-naphthol Các phương pháp chính để loại bỏ 1-naphthol từ môi trường bao gồm: quá trình sử dụng bức xạ năng lượng cao, quá trình xúc tác quang trên các vật liệu bán dẫn, quá trình oxi hoá học, quá trình quang oxi hoá sử dụng ozon hoặc phản ứng Fenton, quá trình hấp phụ lên các vật liệu xốp, quá trình phân huỷ sinh học bởi vi sinh vật [1], [2], [5], [14],

[20], [23], [24], [25], [29], [35] Các phương pháp sử dụng quá trình oxi hoá hoá học tỏ ra có hiệu quả khi phân huỷ dung dịch 1-naphthol nồng độ thấp, nhưng đối với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao, việc sử dụng các phương pháp này rất tốn kém Các phương pháp sử dụng quá trình quang oxi hoá thường bị hạn chế về sự phân bố ánh sáng theo độ sâu của dung dịch [30] Quá trình hấp phụ 1-naphthol lên humin đã tận dụng được nguồn bã thải than bùn của các nhà máy phân bón humic Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này ở chỗ dung lượng hấp phụ thấp (dung lượng hấp phụ 15.15 mg/g humin đối với dung dịch 1-naphthol 100 ppm ở pH 0.91 trong 60 phút) [2]

Một phương pháp có ưu điểm vượt trội về hiệu quả kinh tế và hiệu quả loại

bỏ 1-naphthol chính là sử dụng quá trình phân huỷ sinh học bằng vi sinh vật Ví dụ,

sau 74 giờ xử lý bằng Bacillus subtilis, hiệu quả loại bỏ 1-naphthol trong dung dịch

có nồng độ 80 ppm đạt hơn 80% [1] Ưu điểm của việc sử dụng quá trình phân huỷ sinh học 1-naphthol bằng vi sinh chính là phương pháp nuôi cấy vi khuẩn rất đơn giản, dễ dàng, kinh tế và bằng cách tăng khối lượng sinh khối kết hợp với tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy, có thể xử lý khối lượng lớn nước thải có chứa 1-naphthol cũng như các hợp chất hữu cơ khác Nhược điểm của phương pháp là việc sử dụng vi sinh tự do dễ bị rửa trôi khỏi các hệ thống xử lý nước thải [4], [26]

Để tận dụng các ưu điểm vượt trội của phương pháp phân huỷ sinh học và khắc phục nhược điểm dễ bị rửa trôi của phương pháp, chúng tôi đã tiến hành xử lý 1-naphthol bằng vi sinh vật cố định Ưu điểm của việc sử dụng vi sinh cố định chính là có thể xử lý tập trung, tránh được hiện tượng bị rửa trôi khỏi hệ thống xử

lý, có khả năng tái sử dụng, do đó mang lại hiệu quả kinh tế và hiệu quả xử lý tốt [33]

Khi lựa chọn giá thể cố định cho vi sinh vật, với mong muốn tận dụng nguồn bã thải than bùn của các nhà máy phân bón humic (hiện nguồn bã thải này cũng đang là yếu tố gây ô nhiễm môi trường), cũng như dựa trên các yêu cầu đối với vật liệu cố định (rẻ tiền, bền vững về mặt cơ lý hoá, bền vững dưới sự tấn công

của vi khuẩn, có cấu trúc lỗ xốp hoặc bề mặt hấp phụ lớn…) [27], chúng tôi lựa

chọn humin làm vật liệu cố định vi sinh trong quá trình xử lý 1-naphthol

Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát vai trò

của humin trong xử lý 1-naphthol bằng vi sinh” nhằm tìm khả năng kết hợp humin

và vi sinh vật để xử lý 1-naphthol với những nội dung nghiên cứu như sau:

1) Phân lập humin từ bã thải than bùn của nhà máy phân bón Humix

(Bình Dương)

2) Theo dõi sự gia tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus

subtilis

3) Cố định Bacillus subtilis lên giá thể humin

4) Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS của 1-naphthol

5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sắc ký đồ HPLC của dung dịch 1-naphthol (pH của môi trường và các loại nước lọc dùng để pha loãng dung dịch 1-naphthol)

6) So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtilis cố định trên

humin, Bacillus subtilis tự do, humin tự do; nhằm đánh giá tiềm năng xử lý

1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin

7) Tối ưu hoá các điều kiện xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên

humin

8) Khảo sát khả năng thích nghi của vi sinh cố định trên humin đối với

dung dịch 1-naphthol nồng độ cao

9) Khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin

10) Khảo sát khả năng tái sử dụng humin để tạo chế phẩm cố định mới

Thành phần của than bùn bao gồm các hợp chất hữu cơ và chất mùn [2]

 Các hợp chất hữu cơ trong than bùn:

- Các chất hữu cơ hoà tan trong nước (chủ yếu là polysaccharide, đường đơn, tanin)

- Các hợp chất hoà tan trong ester và rượu (gồm acid béo, sáp, resin…)

Hình 1.1 Sơ đồ tách các hợp chất humic từ than bùn [2]

Các hợp chất này đều là các chất điện ly có phân tử lƣợng rất cao, từ vài trăm (acid fulvic) đến vài vạn (acid humic, humin) Chúng gồm nhiều phân tử liên kết với nhau tạo thành cấu trúc phức tạp chứa nhân thơm, một số nhóm oxy hoạt động và có thể có những nhóm giống nhƣ protein và carbuahydro

Model structure of fulvic acid (Buffle)

Hình 1.2 Cấu trúc của acid fulvic [38]

Hình 1.3 Cấu trúc của acid humic [59]

1.1.2 Humin

Humin chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ trong than bùn (6,84%), gồm các chất cao phân tử xuất hiện do quá trình già hóa của acid humic và acid fulvic Đây là thành phần bền nhất của than bùn, đƣợc tách ra bằng cách hòa tan than bùn trong dung dịch NaOH có pH khoảng 13 Ở pH này, acid humic và acid fulvic đã tan hết, chỉ

còn lại humin không tan

Humin có màu từ nâu đến đen tùy vào mức độ già hóa các acid [15]

Humin cũng là thành phần có khối lƣợng phân tử cao nhất trong than bùn

và có cấu trúc phức tạp

Các hợp chất hữu cơ có trong humin cũng dựa trên cơ sở những hợp chất hữu cơ có trong than bùn, bao gồm các hợp chất béo có mạch carbon dài (chiếm khoảng 50%), cellulose và hemicellulose (khoảng 30-35%), các hợp chất aromatic

và polyaromatic (khoảng 15%), các hợp chất amid và carboxylic (khoảng 3%) [2]

Hình 1.4 Kết quả chụp phổ XRD của humin [2]

Kết quả chụp phổ XRD đã khẳng định trong humin, ngoài các hợp chất hữu

cơ còn có mặt các khoáng vô cơ nhƣ quartz – SiO2, aluminosilicat…

Hình 1.5 Kết quả chụp phổ IR của humin [2]

Kết quả chụp phổ IR của humin cho thấy có các dao động của nhóm chức

và liên kết sau:

- Nhóm –OH liên kết hydro: khoảng 3400 cm-1

- Nhóm C=O của nhóm carboxyl –COOH: khoảng 1710 cm-1

C O O M

O

C O C O

O

M O

1.1.3 Một số phương pháp xử lý humin thô

1.1.3.1 Phương pháp base (phương pháp kiềm chảy)

SiO2 là một oxide acid và Al2O3 là một oxide lưỡng tính, chúng đều tác dụng tốt với kiềm đặc biệt ở nhiệt độ cao

SiO2 + 2NaOH  Na2SiO3 + H2O

Al2O3 + 2NaOH  2NaAlO2 + H2O Cho base tác dụng với mẫu humin ở nhiệt độ cao sẽ làm phá vỡ cấu trúc của mẫu SiO2, Al2O3 có trong humin chuyển thành các muối tan, từ đó loại bỏ chúng qua quá trình lọc rửa

Base được sử dụng để kiềm chảy có thể là KOH, NaOH,Na2CO3, Nhiệt

độ kiềm chảy từ 450-500oC đối với kiềm mạnh và 900-1000oC đối với kiềm yếu Thời gian gia nhiệt từ 30-60 phút

Phương pháp này có ưu điểm là không độc hại, thời gian phản ứng nhanh

Nhưng lại gặp khó khăn trong quá trình lọc rửa, quá trình nung phức tạp vì phải đảm bảo humin không bị cháy trong quá trình nung Đặc biệt khi nung ở nhiệt độ

cao, có thể làm cho humin mất đi khả năng hấp phụ [7]

1.1.3.2 Phương pháp acid

Phương pháp sử dụng hỗn hợp HF và HCl

Đối với phương pháp này người ta loại bỏ SiO2, Al2O3 và các hợp chất khác trong humin bằng hỗn hợp HF, HCl

SiO2 tác dụng được với HF tạo thành SiF4 dễ bay hơi khi nung nóng hoặc tạo thành các phức tan trong nước có thể loại bỏ trong quá trình lọc rửa [7]

SiO2 + 4HF  SiF4 + 2H2O SiF4 + 2HF H2SiF6

Al2O3 có thể tác dụng đồng thời với HF, HCl:

Al2O3 + 3HCl  AlCl3 + 3H2O

Al3+ +3F-  AlF3 (hoặc AlF63-) Phương pháp này đơn giản, loại bỏ được một lượng lớn các hợp chất vô cơ Tuy nhiên các phản ứng trên xảy ra chậm và HF là acid rất độc

Phương pháp rửa bằng acid HCl

Than bùn trong quá trình hình thành, tồn tại và trong quá trình khai thác, tồn chứa ở bãi thải đã hấp phụ một lượng lớn kim loại nặng Điều này làm giảm đáng kể khả năng hấp phụ của humin Phương pháp rửa thực hiện quá trình loại bỏ các kim loại nặng trong humin bằng việc trao đổi ion H+ với acid mạnh như HCl, nhằm phục hồi các nhóm chức -COOH trên bề mặt humin - tác nhân chính của quá trình hấp phụ [7]

Phương pháp này thực hiện đơn giản, thời gian ngắn, chi phí thấp Tuy vậy, trong humin vẫn tồn tại một lượng lớn SiO2, Al2O3

1.1.3.3 Ứng dụng của humin

Than bùn sau khi chiết acid humic để làm phân bón (bằng cách trao đổi ion

K+, NH4+ với H+), phần bã là humin, một phần dùng làm chất độn thêm vào phân bón để tăng hàm lượng mùn trong phân bón, một phần dùng làm than đốt

So với acid fulvic và acid humic, phản ứng của humin với ion kim loại thấp hơn do các nhóm chức bề mặt của humin đã bị chiếm bởi các khoáng vô cơ (quartz-SiO2, khoáng sét, ferrihydrite-FeOOH, gibbsite-Al(OH)3) thông qua cầu nối cation Tuy vậy, với số lượng lớn các nhóm chức trên bề mặt, cũng như khả năng không bị hoà tan với bất kì pH nào, humin được xem là vật liệu hấp phụ tốt Dựa

trên tính chất này, người ta sử dụng humin để hấp phụ các ion kim loại nặng và các chất độc hữu cơ trong nước thải

Mặt khác humin rất bền vững dưới các tác nhân sinh học Do đó humin cũng được nghiên cứu và sử dụng để làm giá thể cho vi sinh xử lý nước thải, nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng các chế phẩm vi sinh, cũng như làm giảm giá thành của các công trình xử lý nước thải

1.2.1 Giới thiệu

Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học dựa trên cơ sở hoạt động của vi sinh vật để phân hủy các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng làm nguồn dinh dưỡng và tạo năng lượng Trong quá trình dinh dưỡng, vi sinh vật nhận các chất dinh dưỡng để xây dựng tế bào, sinh trưởng và sinh sản (tăng sinh khối) Kết quả là chất bẩn hữu cơ được khoáng hóa và trở thành các chất vô cơ, các chất đơn giản,

CO2, H2O,…

Tùy vào môi trường sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật mà người ta chia thành môi trường sinh hóa hiếu khí, kỵ khí, hoặc thiếu khí Đặc tính quan trọng nhất của môi trường sinh hóa là nơi tiếp nhận cuối cùng của các e- khi chúng oxy hóa các hợp chất hữu cơ để hấp thụ năng lượng Có 3 loại chất nhận e- chủ yếu là

O2, hợp chất hữu cơ, hợp chất vô cơ [6], [1]

Trong môi trường hiếu khí, chất nhận e- là O2 hòa tan Điện thế của môi trường lệch về dương

Trong môi trường kỵ khí, chất nhận e- là hợp chất hữu cơ, CO2, SO42- Điện thế của môi trường lệch về âm

Trong môi trường thiếu khí, chất nhận e- chủ yếu là NO2-, NO3- (do thiếu

O2) Điện thế của môi trường lệch về dương

1.2.2 Quá trình sinh hoá trong xử lý nước thải

Gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Hợp chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt của tế bào vi sinh vật (bằng cách hấp phụ, hay keo tụ sinh học), sau đó xảy ra quá trình dị hóa – là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn và cấu trúc mạch dài, thành các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ

1.2.3 Sự sinh trưởng của vi sinh vật

Sự sinh trưởng của vi sinh vật bao gồm quá trình sinh sản (tăng số lượng và kích thước tế bào) và tăng sinh khối Tất cả những biến đổi về hình thái, sinh lí diễn

ra trong tế bào như trên, gọi là sự phát triển Vi sinh vật sinh sản chủ yếu bằng cách phân đôi tế bào Thời gian phân cắt này (thời gian sinh sản hoặc thời gian thế hệ) thường là 20 phút cho tới vài ngày

Để phát triển, vi sinh vật cần các chất dinh dưỡng Các nguyên tố cần thiết cho sự dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm N (nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ), C, một số nguyên tố khoáng (P, Na, K, Mg, Cu, Fe, Zn…) Khi các chất dinh dưỡng cạn kiệt,

và khi pH, nhiệt độ của môi trường sinh hóa vượt qua các trị số tối ưu thì quá trình phát triển của vi sinh vật bị dừng lại

Sự sinh trưởng của vi sinh vật được chia làm nhiều giai đoạn, bao gồm:

- Giai đoạn chậm: Giai đoạn để vi sinh vật thích nghi với môi trường mới

và bắt đầu quá trình phân bào

- Giai đoạn tăng trưởng: Giai đoạn này các tế bào vi khuẩn tiến hành phân bào và tăng nhanh về số lượng Tốc độ phân bào phụ thuộc vào thời gian cần thiết cho các lần phân bào và lượng thức ăn trong môi trường

- Giai đoạn cân bằng: Lúc này mật độ vi khuẩn được giữ ở một số lượng ổn định Nguyên nhân là do các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình tăng trưởng của vi khuẩn đã bị sử dụng hết hoặc số lượng vi khuẩn sinh ra bằng số lượng vi khuẩn chết đi

- Giai đoạn chết: Số lượng vi khuẩn chết đi nhiều hơn số lượng vi khuẩn sinh ra, do đó mật độ vi khuẩn giảm nhanh

Hình 1.7 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật [8]

1.2.4 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Theo S.F Karel và cộng sự (1985), kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa

là “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn trong một vùng không gian nhất định, nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn” [28]

Có 4 phương pháp cố định chính:

- Cố định tế bào lên bề mặt chất mang rắn

- Nhốt tế bào trong cấu trúc gel

- Kết bông tế bào

- Vi bao tế bào

Tuy nhiên, trong lĩnh vực xử lý nước thải thường sử dụng 3 phương pháp đầu

Hình 1.8 Các phương pháp cố định tế bào [34]

1.2.4.1 Kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang rắn

Theo Y Kourkoutas và cộng sự (2004), quá trình cố định tế bào trên chất mang rắn thực chất là sự hấp phụ thông qua các liên kết ion, tĩnh điện, liên kết cộng hoá trị, hoặc liên kết hydro, liên kết Van der Waals Chiều dày của lớp tế bào hấp phụ thường rất mỏng (khoảng 1 mm) và giảm dần trong quá trình lên men Khả năng hấp phụ phụ thuộc vào nhiệt độ, mật độ tế bào, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất mang [34]

Các chất mang thường sử dụng là các polysaccharide có nguồn gốc tự nhiên (cellulose, gỗ, mùn cưa, dextran…), polysaccharide tổng hợp (các dẫn xuất của polystyrene), hoặc các hợp chất vô cơ (ceramic, thuỷ tinh xốp, silicate…)

Ưu điểm:

- Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện

- Tế bào dễ dàng tiếp xúc với cơ chất Vì thế quá trình trao đổi chất ít bị ảnh hưởng

1.2.4.2 Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel

Theo T Branyik và cộng sự (2005), nhốt tế bào trong cấu trúc gel là quá trình bao bọc tế bào vào trong cấu trúc gel, nhằm ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi trường xung quanh nhưng vẫn cho phép tế bào trao đổi chất với môi trường Hình dạng của chất mang thường là các hạt gel hình cầu, đường kính 0.3-5 mm

Chất mang thường sử dụng là polysaccharide (alginate, agar, pectin…), protein (gelatin, collagen…), hoặc polymer tổng hợp (polyvinyl alcohol, polyacrylamide…)

Quá trình trao đổi chất giữa môi trường bên trong và bên ngoài hạt gel được thực hiện do sự chênh lệch nồng độ cơ chất [32]

Ưu điểm:

- Phương pháp đơn giản, dễ tối ưu hoá quá trình cố định, chi phí thấp

- Hạt gel có độ bền cao, có thể thể chứa được mật độ tế bào rất cao

- Hạt gel có thể bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi của môi trường

Nhược điểm:

- Tế bào có thể phát triển trên bề mặt hạt gel và tách khỏi hạt gel

- Nồng độ cơ chất và sản phẩm tại bề mặt hạt gel và tại tâm khác nhau Do

đó hoạt tính và đặc điểm sinh lý của tế bào tại các vị trí khác nhau cũng khác nhau

- Khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men có thể làm nứt vỡ hạt gel

1.2.4.3 Kỹ thuật kết bông tế bào

Một số loài vi sinh vật có khả năng tự kết lại với nhau thành một khối (kết bông tự nhiên) [26], [32] Tuy nhiên phương pháp này ít được áp dụng trong thực tế

vì có khá nhiều nhược điểm:

- Việc điều khiển quá trình cố định phức tạp và tốn kém

- Quá trình trao đổi chất của tế bào ở tâm khối hạt bị hạn chế

- Khả năng bảo vệ tế bào trước điều kiện bất lợi của môi trường thấp

1.2.4.4 Yêu cầu đối với chất cố định

- Rẻ tiền

- Bền vững và ổn định về mặt cơ, lý, hoá

- Bền vững dưới sự tấn công của vi khuẩn

- Chất cố định có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có diện tích bề mặt lớn, có thể sử dụng ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng…

1.2.5 Giới thiệu về Bacillus subtilis

Bacillus subtilis thuộc giới bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ

Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus [39]

Bacillus subtilis là loại vi khuẩn rất phổ biến, được tìm thấy trong đất,

nước, không khí, và từ sự phân huỷ thực vật [37]

1.2.5.1 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử,

do đó nó có thể tồn tại trong môi trường sống hết sức khắc nghiệt Khuẩn lạc tròn, dẹp, khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có mép nhăn bám vào bề mặt thạch [11]

(a)

(b)

Hình 1.9 Hình thái của Bacillus subtilis

(a) Khuẩn lạc Bacillus subtilis mọc trên thạch đĩa

(b) Bacillus subtitis quan sát dưới kính hiển vi

1.2.5.2 Đặc tính sinh trưởng

Là loại hiếu khí bắt buộc hoặc hiếu khí tuỳ tiện Bacillus subtilis sử dụng

oxy hoà tan làm chất nhận điện tử trong quá trình trao đổi chất [1], [11]

Cũng giống như các loài khác trong chi Bacillus, Bacillus subtilis có thể sử

dụng nhiều nguồn carbon và nitơ khác nhau Đây là loại vi khuẩn dễ sinh trưởng và phát triển rộng Điều kiện nuôi cấy tối ưu là pH 6.5 – 7.5, nhiệt độ từ 30 – 45oC

Đường cong sinh trưởng vào giai đoạn ổn định ở trong khoảng 18 – 30 giờ

Hình 1.10 Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis [11]

1.2.5.3 Ứng dụng của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis mang lại lợi ích trong nhiều lĩnh vực, bao gồm các ứng

dụng công nghiệp Chúng được sử dụng để sản xuất enzyme amylase – có tác dụng thuỷ phân tinh bột để sử dụng trong các ngành công nghiệp sản xuất giấy, ngành

công nghiệp dệt may Bacillus subtilis cũng sản xuất các enzyme protease,

subtilisin, được sử dụng trong chất tẩy rửa và các ngành công nghiệp da [39]

Trong ngành y tế, Bacillus subtilis được dùng để sản xuất nhiều loại thuốc

kháng sinh, như difficidin, oxydifficidin, bacillomyin B, Bacitracin, dùng điều trị nhiễm trùng da do vi khuẩn, ngăn ngừa nhiễm trùng do các vết cắt nhỏ hoặc các vết bỏng

Trong nông nghiệp, Bacillus subtilis được sử dụng như một loại thuốc diệt

nấm Vi khuẩn xâm chiếm hệ thống rễ cây, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh nấm [13] Chúng được sử dụng cho các hạt giống nông nghiệp, như rau, đậu tương, bông, đậu phộng, hạt giống hoa và cây cảnh Chúng cũng được sử dụng để sản xuất chất độc tiêu diệt côn trùng, như tiêu diệt ấu trùng muỗi sốt rét

Trong vài năm gần đây, cũng đã có một số nghiên cứu sử dụng Bacillus

subtilis như là một loại probiotic hỗ trợ sức khoẻ của con người Tuy nhiên người

đã bị suy giảm hệ miễn dịch không được sử dụng chế phẩm này

1.3.1 Giới thiệu về 1-naphthol

1–Naphthol là hydrocarbon thơm có chứa một nhóm -OH liên kết trực tiếp với carbon ở nhân thơm, thuộc họ phenol [36]

Công thức phân tử: C10H8O (144,17 g/mol)

Công thức cấu tạo:

Tan ít trong nước, độ tan ở 20oC: 866 mg/l

Tan tốt trong rượu, eter, benzene, chloroform, dung dịch kiềm…

Hằng số phân ly ở 25oC: pKa = 9,34

1.3.3 Tính chất hóa học

Do nguyên tử oxy còn dư hai cặp điện tử chưa liên kết và thêm vào đó là hệ

thống điện tử π có trong nhân thơm tạo nên hiệu ứng liên hợp làm cho liên kết

C – O trở nên bền vững hơn [9]

- Hiệu ứng liên hợp này càng làm tăng sự phân cực trong liên kết O – H

làm cho nguyên tử hydro dễ tách ra trong các phản ứng hóa học Do đó

1-naphthol thể hiện tính acid mạnh hơn alcol Tuy nhiên, tính acid của

1-naphthol vẫn yếu hơn tính acid của acid carboxylic và acid carbonic

- Hiệu ứng liên hợp kéo điện tích tập trung trong nhân thơm, làm cho mật

độ điện tử ở nhân thơm trở nên âm hơn Vì vậy 1-naphthol có thể tham

gia phản ứng thế ái điện tử

Các muối naphtholate tác dụng với alkylhalogenua, clorua acid, alkyl sulfat

tạo eter 1-naphthol tham gia tất cả các phản ứng ái nhân, phản ứng thế nhóm O–H,

phản ứng oxy hóa, phản ứng thế hydro ở nhân thơm, phản ứng ghép đôi với các hợp

chất diazo [9]

1.3.4 Độc tính

Đối với cơ thể con người:

Là chất độc nếu nuốt phải hay hấp thu qua da, qua đường hô hấp 1-Naphthol kích thích đến mắt, ảnh hưởng tới gan và thận Cùng với 3,5,6-trichloro-2-pyridiol (một chất chuyển hoá của chlorpyrifos và chlorpyrifos

methyl), 1-naphthol làm giảm nồng độ testoterone ở nam giới trưởng thành [22]

Kích thích hô hấp: xuất hiện các triệu chứng ho, thở dốc

Nuốt phải liều lớn có thể gây ra đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, đổ mồ hôi

và khát cường, tổn thương tới gan, giảm huyết áp, tiêu chảy, mạch thu hẹp, gây co

giật nếu có thể dẫn tới tử vong với liều 5g [5]

Với da: kích thích mẩn đỏ và gây đau đớn, có thể được hấp thu qua da, độ

hấp thu cực đại qua da là 5,46 μg/cm2

Với mắt: gây kích ứng, mẩn đỏ, đau và thương tích cho giác mạc [36]

Về lâu dài, 1-naphthol ảnh hưởng xấu đến chức năng của tuyến giáp [17] Ngoài ra, 1-naphthol có thể tích tụ trong các mô và gây nên các khối u ở đại trực tràng [16]

Độc tính của 1-naphthol còn thể hiện gián tiếp qua chất chuyển hoá của nó

là 1,2 hoặc 1,4-naphthoquinone [21]

Đối với sinh vật và môi trường:

1-naphthol ảnh hưởng xấu đến cá, giun đất và động vật có vú với liều lượng nhất định

Bảng 1.1 Độ độc của 1-naphthol với các loài sinh vật [5], [19]

Giun đất Tảo Cá Động vật có vú Nồng độ độc (ppm) 17,8 14 4,24 134

1.3.5 Nguồn phát sinh 1-naphthol

1-naphthol có trong nước thải của nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp tổng hợp chất hữu cơ, sản xuất chất màu azo, thuốc trừ giun sán, thuốc trừ sâu, trong công nghệ thuộc da và sản xuất giấy…) [2]

Đặc biệt, 1-naphthol được xác định là sản phẩm chính của quá trình phân huỷ thuốc trừ sâu carbaryl trong điều kiện tự nhiên [18], [19]

Đã có khá nhiều phương pháp xử lý 1-naphthol được nghiên cứu trong những năm gần đây, như nghiên cứu của Chockalingam Karunakaran và cộng sự đã khảo sát hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng phương pháp xúc tác quang hoá trên bề mặt TiO2, ZnO [14]; nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Lợi (2010) xử lý 1-naphthol bằng phương pháp oxi hoá nâng cao sử dụng O3 Hiệu suất phân huỷ 1-naphthol bằng phương pháp O3 kết hợp với UV, O3 kết hợp với H2O2 cũng được khảo sát [5] Các kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng phương pháp oxi hoá nâng cao tỏ ra có hiệu quả khi xử lý dung dịch 1-naphthol nồng độ thấp (dưới 20 ppm), nhưng khi xử lý

dung dịch 1-naphthol nồng độ cao, phương pháp này rất tốn kém và sau quá trình

xử lý 1-naphthol, phải tiến hành xử lý lượng O3 còn dư trong dung dịch

Với mong muốn tìm phương pháp xử lý 1-naphthol hiệu quả và kinh tế, nhiều nghiên cứu trong nước đã bước đầu tiến hành khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol sử dụng các nguyên vật liệu rẻ tiền, như nghiên cứu của Nguyễn Hoàng

Hạ (2010) sử dụng chiết xuất humin từ bã than bùn để xử lý 1-naphthol Kết quả được ghi nhận khi pH giảm, dung lượng hấp phụ 1-naphthol lên humin tăng, quá trình hấp phụ 1-naphthol lên humin là quá trình hấp phụ vật lý Dung lượng hấp phụ tối đa đạt được ở điều kiện thí nghiệm pH 0.91 là 15.15 mg/g humin sau 60 phút hấp phụ dung dịch 1-naphthol 100 ppm [2]

Một phương pháp kinh tế và thân thiện với môi trường cũng được khảo sát trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Dung (2009) Tác giả Phan Thị Thu Dung đã

tiến hành khảo sát khả năng thích nghi của ba chủng vi khuẩn Bacillus spp trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung 1-naphthol Các kết quả ghi nhận chủng Bacillus

subtilis có khả năng thích nghi tốt với môi trường có bổ sung 1-naphthol và có thể

phân huỷ được 1-naphthol (quá trình loại bỏ 1-naphthol trong dung dịch có nồng độ

80 ppm sau 74 giờ xử lý bằng Bacillus subtilis đạt hiệu suất trên 80%) [1]

Quá trình nuôi cấy Bacillus subtils đơn giản, ít tốn kém Bacillus subtilis lại

sinh sản nhanh Phương pháp xử lý bằng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Dung tỏ ra ưu điểm vượt trội về mặt kinh tế, có nhiều tiềm năng

để ứng dụng thực tế Tuy nhiên, nếu sử dụng tế bào Bacillus subtils tự do trong các

thiết bị xử lý nước thải sẽ xảy ra hiện tượng các tế bào tự do bị rửa trôi khỏi hệ thống xử lý Để khắc phục nhược điểm đó, tác giả Phan Thị Thu Dung đã tiến hành

cố định tế bào Bacillus subtils lên humin và bước đầu khảo sát so sánh khả năng xử

lý 1-naphthol bằng Bacillus subtils tự do, bằng Bacillus subtils cố định trên humin,

bằng humin tự do Tuy nhiên, khi phân tích định lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch sau quá trình xử lý, Phan Thị Thu Dung sử dụng phương pháp phổ hấp thu UV-VIS, kết quả cho độ hấp thu của 1-naphthol trong mẫu sau khi xử lý bằng

Bacillus subtils cố định trên humin đạt giá trị âm Tác giả Phan Thị Thu Dung đã

kiến nghị lặp lại thí nghiệm và sử dụng phương pháp phân tích phù hợp để đánh giá

chính xác hiệu quả xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtils cố định trên humin, đồng thời tìm điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtils cố

định trên humin

Cho tới thời điểm thực hiện luận văn của chúng tôi, chưa có nghiên cứu nào xây dựng điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin, chưa có nghiên cứu nào khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin

1.5 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ PHÂN TÍCH

1.5.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là viết tắt của High Performance Liquid Chromatography (phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao), trước kia gọi là High Pressure Liquid Chromatography (phương pháp sắc ký lỏng cao áp)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến

từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng [5]

1.5.1.1 Phân loại sắc ký

Theo cơ chế chia tách của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:

- Sắc ký hấp phụ (NP - HPLC và RP - HPLC)

- Sắc ký phân bố - sắc ký chiết (LLC)

- Sắc ký trao đổi ion (IE - HPLC)

- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG - HPLC)

Nhưng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu

 Sắc ký hấp phụ [5]:

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP - HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Loại sắc ký hấp phụ pha đảo được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình

Ưu điểm:

+ Tốc độ nhanh

+ Độ tách tốt (nhờ sử dụng các chất nhồi có kích thước rất nhỏ 5-10m) + Độ nhạy cao

+ Cột tách được sử dụng nhiều lần, khả năng thu hồi mẫu cao

+ Lượng mẫu cho phép bơm vào cột tách lớn hơn so với phương pháp sắc

ký khí

+ Quá trình phân tích phần lớn được thực hiện tại nhiệt độ phòng, rất thích hợp cho các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi và không bền nhiệt (ưu điểm rõ rệt của phương pháp này so với phương pháp sắc ký khí)

1.5.1.2 Hệ thống thiết bị HPLC

Hình 1.11 Hệ thống thiết bị phân tích HPLC [5]

Có thể sử dụng nhiều loại detector khác nhau để làm tăng khả năng phát hiện, tăng hiệu quả và độ chính xác của phép phân tích: detector hấp thu tử ngoại (ultra violet – UV), detector chiết suất vi sai (refractive index – RI), detector vận chuyển, detector huỳnh quang (fluorescence), detector hấp thu nhiệt, detector cực phổ, detector độ dẫn…

1.5.1.3 Ứng dụng của phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong phương pháp HPLC, người ta định tính mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu (tr) của cấu tử phân tích với chất chuẩn Việc so sánh này chỉ có giá trị khi tiến hành thí nghiệm trên mẫu và chất chuẩn ở các điều kiện hoàn toàn giống nhau

cả về pha tĩnh, pha động, nhiệt độ…

So với phương pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hoặc khối phổ, phương pháp HPLC có vai trò kém quan trọng hơn trong phân tích định tính vì việc đánh giá sự hiện diện của các cấu tử dựa vào thời gian lưu (tr) có độ chính xác không cao lắm

Phương pháp HPLC chỉ được xem là một công cụ đắc lực được sử dụng để đánh giá sự hiện diện hoặc vắng mặt của các hỗn hợp chứa một số giới hạn các cấu

tử có thể đã được nhận danh trước

Phân tích định lượng

Cơ sở của phương pháp dựa trên giả thiết rằng các biến đổi tín hiệu của detector có quan hệ mật thiết với sự biến đổi nồng độ của các chất được tách ra bằng sắc ký theo một tương quan tỷ lệ thuận

- Phương pháp dựa vào chiều cao peak:

Chiều cao peak được đo bằng cách nối đường nền giữa hai chân của peak bằng một đường thẳng và đo chiều cao của peak từ đường nền này Chỉ nên sử dụng phương pháp này khi bề rộng của peak mẫu và peak chuẩn hoàn toàn bằng nhau Điều này chỉ thực hiện được khi khống chế nghiêm ngặt nhiệt độ cột, tốc độ của pha động, tốc độ bơm mẫu và tránh cho cột không bị quá tải

- Phương pháp dựa vào diện tích peak

Diện tích peak không phụ thuộc vào độ rộng của peak Mặt khác diện tích peak rất dễ được xác định một cách chính xác, nhất là đối với các peak hẹp Hầu hết các thiết bị sắc ký hiện đại đều có bộ tích phân kế điện tử cho phép xác định chính xác diện tích peak

Phương pháp 100% diện tích peak: Phương pháp này hầu như không còn được sử dụng vì sai số rất lớn (ngoài hàm lượng của mẫu khảo sát, tín hiệu của detector còn phụ thuộc vào loại detector và bản chất hoá học của chất nghiên cứu)

Phương pháp chuẩn ngoại: Lập đường chuẩn diện tích peak theo nồng độ của cấu tử cần khảo sát Chọn điều kiện thích hợp để quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ là tuyến tính Định lượng cấu tử cần khảo sát bằng việc xây dựng đường chuẩn hoặc bằng phương pháp bình phương cực tiểu

Phương pháp chuẩn nội: Thêm vào mẫu một chất chuẩn có nồng độ biết trước được gọi là chất chuẩn nội Chất chuẩn nội có thể có tính chất hoá lý rất gần với cấu tử khảo sát hoặc có thể là một cấu tử nào đó có mặt trên sắc ký đồ Độ chính xác của phương pháp này không phụ thuộc vào độ lặp lại của quá trình bơm mẫu

1.5.2 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thu UV-VIS (phổ kích thích electron)

Thông qua việc khảo sát các đám phổ của miền tử ngoại gần đến miền hồng ngoại, phương pháp phổ kích thích electron là một trong những phương pháp được ứng dụng sớm nhất và rộng rãi nhất trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất hữu cơ,

1.5.2.2 Máy đo phổ hấp thu UV-VIS và nguyên lý hoạt động

Hình 1.12 Cấu tạo máy đo phổ hấp thu UV-VIS [5]

Nguyên lý hoạt động: Các bức xạ do nguồn cung cấp được bộ đơn sắc tách riêng thành từng dải đơn sắc, được bộ phận chia chùm sáng hướng chùm tia đơn sắc lần lượt qua curvet chứa dung môi và curvet chứa mẫu Detector sẽ so sánh cường

độ bức xạ qua mẫu và qua dung môi, chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện và tính toán dựa vào định luật Lambert – Beer Bộ phận đọc tín hiệu thường được nối với máy tính [12]

Định luật Lamber – Beer :

A = εbC

Trong đó :

A là độ hấp thu

ε là hệ số hấp thu mol, đặc trưng cho cường độ hấp thu của chất nghiên cứu ở bước sóng khảo sát

b là bề dày của curvet chứa mẫu (cm)

C là nồng độ mol/l của dung dịch chất khảo sát

 Giới hạn ứng dụng của định luật Lamber – Beer [12]

Định luật Lamber-Beer chỉ nghiệm đúng đối với dung dịch loãng (nồng

độ cấu tử khảo sát nhỏ hơn 0,01 M)

Định luật Lamber-Beer chỉ nghiệm đúng với bức xạ đơn sắc

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Giống vi sinh vật

Giống Bacillus subtilis được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ sinh học,

trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Nguyên liệu

Bã than bùn được lấy từ nhà máy phân bón Humic – Bình Dương

2.1.3 Hoá chất

 Hóa chất chuẩn bị để pha môi trường nuôi cấy:

Nguồn carbon: đường maltose công nghiệp

Nguồn cung cấp nitơ: cao nấm men (Himedia - Ấn Độ), peptone (Trung Quốc)

Các muối cung cấp khoáng: K2HPO4, Na2HPO4, NH4Cl, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, CuSO4, CaCl2, MnCl2 (Trung Quốc)

 Các hóa chất dùng trong phân tích:

1-naphthol (C6H8O, độ tinh khiết 99%, Merk, Đức)

Methanol (CH3OH, Baker, Mỹ)

Nước siêu sạch (lọc nước cất một lần bằng hệ thống lọc chân không với màng lọc có kích thước lỗ 0,45µm)

Các hóa chất khác: Na2CO3, HCl… (Trung Quốc)

2.1.4 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh

2.1.4.1 Môi trường nhân giống (MT1) [1]

Maltose 30 (g/l)

Cao nấm men 5 (g/l)

Peptone 10 (g/l)

2.1.4.3 Môi trường cấy chuyền và trải đĩa

Thành phần như môi trường nhân giống (MT1) nhưng có bổ sung 20 g agar

2.2 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu chung

Bã than bùn

Nhân giống cấp 2

B sub

Sinh khối

Nhân giống cấp 1

Hoạt hoá Humin

Tách humin