Nghiên cứu tạo chế phẩm bảo tử bacillus subtilis bất hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm a h5n1 và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên chuột

DANH MỤC HÌNH 1.2 Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm chia theo 1.4 Cấu trúc hạt virion và hình thái của virus cúm A 13 3.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu của dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
  -

LÊ LAN HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM BÀO TỬ

NGUYÊN CÚM A/H5N1 VÀ ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH

ðÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS ðINH DUY KHÁNG GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Lê Lan Hương

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của toàn thể cán bộ nghiên cứu của phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Và sự hướng dẫn, góp ý của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS TS Nguyễn Quang Thạch

ñã truyền ñạt những kiến thức mới và giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến PGS.TS ðinh Duy Kháng ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu

ñể tôi hoàn thành khóa luận, mà trên tất cả là truyền ñạt cho tôi kinh nghiệm làm việc và tư duy nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện, giúp ñỡ tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này

Hà Nội, ngày 12 tháng 09 năm 2013

Học viên

Lê Lan Hương

MỤC LỤC

1.1.1 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới 4 1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam 7

1.2.1 Phân loại và cấu trúc di truyền virus cúm A/H5N1 11 1.2.2 Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm 13 1.2.3 Các phân đoạn mã hĩa các kháng nguyên bề mặt chủ yếu 15

1.3.2 Phát hiện vật liệu di truyền của virus 17 1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch sử dụng trong chẩn đốn huyết thanh học

1.3.5 Chất bổ trợ dùng trong vaccine cúm A/H5N1 21

2.1.2 Các dung dịch, hố chất, mơi trường dùng trong nghiên cứu 24

2.1.3 Các trang thiết bị và dụng cụ dùng cho nghiên cứu 25

2.2.8 ðịnh lượng HA bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch (SRD) 32

2.2.10 Phương pháp phân tích khả năng hấp phụ hạt virus bất hoạt trên

2.2.11 Phương pháp chuẩn bị chế phẩm bào tử B.subtilis PY79 hấp phụ

hạt virus cúm NIBRG-14 tinh chế bất hoạt 35 2.2.12 Gây miễn dịch trên chuột thí nghiệm và thu mẫu ñể phân tích ñáp

3.1.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu của dịch niệu nhiễm cúm

H5N1 chủng NIBRG-14 ñể sản xuất kháng nguyên tinh chế 36 3.1.2 Kết quả tinh chế kháng nguyên HA bằng li tâm siêu tốc trên

3.1.4 Kết quả ñiện di SDS-PAGE kiểm tra protein virus cúm

3.1.5 Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp Bradford 40

3.1.6 Kết quả ñịnh lượng kháng nguyên HA bằng phương pháp khuếch

3.2 Kết quả sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus subtilis PY79 hấp phụ

3.2.2 Kết quả tạo ñáp ứng kháng thể trên chuột gây miễn dịch bằng chế

phẩm bào tử B.subtilis PY79 bất hoạt hấp phụ virus

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 BSA: Albumin from Bovine Serum (Albumin từ huyết thanh bê)

2 CDC: Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm soát

và Ngăn ngừa dịch bệnh)

3 FAO: Food and Agriculture Organisation of United Nations (Tổ chức lương thực và nông nghiệp của Liên hiệp quốc)

4 HPAI: Highly pathogenic avian influenza (Cúm gia cầm ñộc lực cao)

5 IVI: International Vaccine Institute (Viện Vaccine Quốc tế)

6 MDCK: Madin – Darby Canine Kidney (Tế bào thận chó Madin – Darby)

7 NIBSC: The National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh Sinh học)

8 OIE: World Organisation for Animal Health (Tổ chức Thú y Thế giới)

9 PBS: Phosphate Buffered Saline (Muối ñệm phosphate)

10 WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH MỤC BẢNG

1.1 Thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên thế giới ñược báo cáo

1.2 Tổng hợp tình hình bệnh cúm gia cầm trong 5 năm (2008-2012) 9

3.1 Giá trị OD595nm của ñường chuẩn BSA và mẫu virus 41

3.2 Kết quả ñáp ứng kháng thể HI của các nhóm chuột ñược gây miễn dịch với

DANH MỤC HÌNH

1.2 Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm chia theo

1.4 Cấu trúc hạt virion và hình thái của virus cúm A 13 3.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu của dịch niệu 36 3.2 Hai dải băng virus xuất hiện sau khi li tâm phân vùng 37 3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra protein của virus NIBRG-14 sau tinh chế 39 3.4 ðồ thị biểu diễn ñường chuẩn tương quan giữa giá trị OD595nm và

3.5 Kỹ thuật SRD ñịnh lượng kháng nguyên HA 43 3.6 Kết quả hấp phụ hạt virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tinh chế lên

3.7 Kết quả ñáp ứng kháng thể của chuột gây miễn dịch với kháng

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Trên thế giới, bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ñã lan rộng ra nhiều nước thuộc Châu Á, Châu Âu và Châu Phi Hàng triệu gia cầm ñã bị chết và bị tiêu huỷ mỗi năm do virus cúm H5N1 Ở nước ta, bệnh cúm A/H5N1 trên gia cầm xảy vào cuối năm 2003, nhưng ñến nay bệnh vẫn còn xảy ra ở nhiều ñịa phương trên toàn quốc và có tính lặp lại hàng năm Do ñó, bệnh cúm gia cầm vẫn ñang là nỗi lo lớn của người chăn nuôi gia cầm và gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi trong nước Nghiêm trọng hơn, virus cúm A/H5N1 có thể biến ñổi, lây nhiễm từ gia cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất trầm trọng và gây ra nhiều ca tử vong

Trước tình hình cấp bách trên, WHO ñã kêu gọi các nước cùng hợp tác trong phòng chống dịch cúm gia cầm H5N1 Thế giới ñã triển khai nhiều biện pháp phòng chống tổng hợp nhằm khống chế dịch bệnh, trong ñó biện pháp

sử dụng vaccine ñược xem là công cụ hữu hiệu trong việc khống chế và tiến tới thanh toán dịch bệnh

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống cúm cũng

là nhiệm vụ cấp bách ñược ñặt ra Nhiều ñơn vị trong nước ñã nghiên cứu sản xuất vaccine H5N1 phòng bệnh cho gia cầm và cho người như Viện Công nghệ sinh học, Công ty vaccine và sinh phẩm số 1 (VABIOTEC), Viện Vaccine Nha Trang, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Các vaccine cúm ñược sản xuất tại Việt Nam ñều sử dụng chủng virus cúm tái tổ hợp ñược tạo trên

cơ sở di truyền ngược với hai gen HA và NA lấy từ chủng A/Vietnam/1194/2004(H5N1) và 6 gen còn lại ñược lấy từ chủng A/PR/8/34 (H1N1) Các vaccine sản xuất trên cơ sở các chủng virus ñược tạo ra bằng di truyền ngược có lợi thế là giảm ñộc lực, ñảm bảo an toàn cho sản xuất nhưng

có tính sinh miễn dịch thấp ðối với vaccine cúm H5N1 sử dụng chủng di

truyền ngược, người ta bắt buộc phải sử dụng chất bổ trợ vaccine Hiện nay, Viện Công nghệ sinh học ñã sản xuất thành công vaccine cúm gia cầm H5N1 với chủng NIBRG-14 nhận của NIBSC (Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh sinh học), Vương Quốc Anh Vaccine ñã ñược thử nghiệm công cường ñộc tại viện thú y và ñã chuyển giao công nghệ sản xuất cho NAVETCO, Thành phố Hồ Chí Minh Chất bổ trợ vaccine dùng cho vaccine cúm gia cầm ñược sử dụng ở Việt Nam là Montanide ISA 50 và Montanide ISA 70 ðối với vaccine cúm cho người, các cơ sở sản xuất ñều dùng chất chất bổ trợ vaccine là hydroxide nhôm Tuy nhiên, ñây là những chất bổ trợ

có giá thành tương ñối cao Hơn nữa, cho ñến nay, các vaccine cúm H5N1 dùng cho gia cầm và cho người ở Việt Nam ñược ñưa vào cơ thể qua ñường tiêm bắp, chưa có công trình nào nghiên cứu về khả năng tìm kiếm phương thức ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô hấp bằng phương pháp khí dung và ñánh giá tính sinh miễn dịch của vaccine

Việc tiếp tục tìm kiếm các chất bổ trợ vaccine có ưu thế hơn, ñặc biệt các chất bổ trợ ñưa vaccine qua ñường mũi bằng khí dung ñể tạo ñáp ứng miễn dịch tại chỗ là công việc ñã và ñang ñược nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm Các chất bổ trợ ñể ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô hấp – khí dung tạo ñáp ứng miễn dịch tại chỗ có ý nghĩa ñặc biệt vì giá thành

hạ và ít tác dụng phụ Bào tử Bacillus subtilis ñã ñược nhiều phòng thí

nghiệm trên thế giới chứng minh là chất bổ trợ vaccine tạo ñáp ứng miễn dịch tại chỗ có tiềm năng ðây sẽ là phương pháp có lợi thế vì dễ thực hiện, giá thành rẻ, dễ triển khai rộng rãi, ñặc biệt ñối với gia cầm

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành ñề tài: Nghiên cứu tạo

chế phẩm bào tử Bacillus subtilis bất hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm

A/H5N1 và ñánh giá khả năng sinh ñáp ứng miễn dịch trên chuột

2 Mục tiêu

Tạo ra ñược qui trình sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus subtilis bất

hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm A/H5N1 ở qui mô phòng thí nghiệm và kích thích sinh ñáp ứng miễn dịch phòng chống cúm A/H5N1 trên chuột khi gây miễn dịch qua ñường mũi bằng khí dung

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu tạo chế phẩm virus cúm A/H5N1 bất hoạt tinh chế hấp phụ

bào tử Bacillus subtilis bất hoạt

Gây miễn dịch cho chuột ñánh giá khả năng sinh ñáp ứng miễn dịch

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Diễn biến dịch cúm gia cầm A/H5N1

1.1.1 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới

Virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện trên thế giới ñã từ lâu Ngay từ năm

1988, De BK và cộng sự ñã giải mã ñược gen mã hoá hemagglutinin (gen H5) của virus cúm H5N1 phân lập ở Scotland (De BK và cs, 1988) Nhóm tác giả này cũng ñã thành công trong việc tạo ra vaccine H5N1 tái tổ hợp bằng việc chuyển gien H5 phân lập ñược vào virus ñậu mùa chủng vaccine Tuy nhiên, virus cúm gia cầm chỉ ñược ñặc biệt quan tâm khi virus này ñược phân lập từ một trẻ em ba tuổi bị tử vong ở Hong Kong năm 1997 (Subbarao K và cs, 1998) Theo thông báo của WHO, tới cuối năm 1997, ñã có 18 trường hợp nhiễm cúm H5N1 tại Hong Kong, trong ñó có 06 ca tử vong Tình hình ñặc biệt trở nên nghiêm trọng từ cuối năm 2003 ñầu năm 2004, khi dịch cúm gia cầm ñã lan rộng ra nhiều nước châu Á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Indonesia Tại các nước này, hàng triệu gia cầm ñã bị chết và bị tiêu huỷ do virus cúm H5N1

Năm 2009, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 17 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Afghanistan, Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, ðức, ðặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Nhật Bản, Lào, Mông Cổ, Nepal, Nigeria, Nga, Tây Ban Nha, Thái Lan, Togo, Việt Nam

Năm 2010, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 16 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Bhutan, Bungari, Cămpuchia, Trung Quốc, ðặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Israel, Lào, Mông Cổ, Myanmar, Nepal, Rumani, Nga, Tây Ban Nha và Việt Nam

Năm 2011, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại các quốc gia và vùng lãnh

thổ bao gồm: Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, Ấn ðộ, Indonesia, Iran,

Israel, Nhật Bản, Mông Cổ, Myanmar, Hàn Quốc, Hy Lạp, đặc khu hành chắnh Hồng Kông và Việt Nam

Từ ựầu năm 2012 ựến nay, dịch cúm trên gia cầm ựã xảy ra tại: Ai Cập, Bangladesh, Nepal, Bhutan, Ấn độ, đặc khu hành chắnh Hồng Kông, đài Loan (Trung Quốc), Myanmar, Israel, Việt Nam, Bangladesh, Indonesia, Nepal, Bhutan

Tắnh ựến nay, virus H5N1 ựã lan rộng ra hơn 60 nước thuộc châu Á, châu Âu và châu Phi (Peiris JSM et al 2007; Cục Thú y, 2012)

Tình hình càng trở nên rất ựáng lo ngại khi H5N1 có thể nhiễm từ gia cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất trầm trọng và gây ra nhiều

ca tử vong Theo số liệu thống kê của WHO, tắnh ựến tháng 6 năm 2013, trên toàn thế giới ựã phát hiện ựược 630 trường hợp nhiễm cúm gia cầm H5N1, trong ựó

có 375 trường hợp tử vong (WHO-http://www.who.int/influenza/human_animal_ interface/EN_GIP_20130604CumulativeNumberH5N1cases.pdf) Các quốc gia

có bệnh nhân cúm trong năm 2012 gồm: Bangladesh (3 ca), Cambodia (3 ca), Trung Quốc (2 ca), Ai Cập (11 ca), Indonesia (9 ca) và Việt Nam (4 ca) Trong 6 tháng ựầu năm 2013, số người bị nhiễm cúm H5N1 có: Bangladesh (1 ca), Cambodia (11 ca), Trung Quốc (2 ca), Ai Cập (4 ca) và Việt Nam (2 ca)

Bảng 1.1 Thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên thế giới

ñược báo cáo cho Tổ chức Y tế Thế giới năm 2003-2013

Phi trong giai ựoạn 2006-2007 và hiện vẫn ựang tồn tại trong quần thể gia cầm ở một số nước thuộc châu Á và châu Phi (Li Y et al 2011) Trong thời gian này, clade lưu hành chủ yếu ở đông Nam Á là clade 2.3.4 Gần ựây, clade 2.3.2 lại ựược phát hiện trên chim hoang dại ở Hồng Kong, Nhật Bản, Nga và Mông Cổ Người ta cũng phát hiện sự xuất hiện lặp ựi lặp lại của clade 2.3.2 ở chim hoang dại tại châu Âu, ựồng thời cũng thấy các vụ dịch do clade này xuất hiện thường xuyên hơn ở các nước đông Nam Á (Kang HM et

al 2011; Reid SM et al 2011) Các chủng virus cúm ựược phân lập và xác ựịnh từ ngày 16 tháng 2 ựến ngày 19 tháng 9 năm 2011 thuộc các clade sau: Clade 1.1, Clade 2.2.1, Clade 2.2.1.1, Clade 2.2.2, Clade 2.3.2.1, Clade 2.3.4, Clade 2.3.4.2 (WHO- www.who.int/csr/disease/avian_influenza/ uidelines/ 011_09_h5_h9_ accinevirusupdate.pdf) Tuy nhiên, cho ựến nay, các chủng virus cúm H5N1 nhiễm sang người chỉ tìm thấy ở 4 clade: clade 1, clade 2.1, clade 2.2, and clade 2.3.4 (Webster RG and Govorkova EA, 2006)

Vụ ựại dịch cúm H1N1 xuất hiện vào mùa xuân năm 2009 làm cho hàng trăm ngàn người mắc trên toàn thế giới (Qiu J, 2009; Stone R, 2009) Người ta sợ rằng nếu cứ tồn tại ựồng thời hai phân type (subtype) cúm H5N1 ựộc lực cao và H1N1 ựại dịch có khả năng lây truyền cao từ người sang người thì nguy cơ tạo ra một chủng tái tổ hợp vừa có ựộc lực cao vừa

có khả năng lây truyền từ người sang người là một hiểm họa ựối với nhân

loại (Huang YH, 2009)

1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phắa Bắc, sau ựó ựã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn đây là lần ựầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân Dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều ựịa phương trong cả nước Thống

kê các ñợt dịch lớn trong cả nước từ năm 2003 -2012 như sau:

Từ tháng 12/2003 ñến tháng 3/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng ñã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng ñàn gia cầm ðặc biệt, có 3 người ñược xác ñịnh nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 ñã tử vong trong ñợt dịch này

Từ tháng 4/2004 ñến tháng 11/2004, dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao ñiểm nhất là trong tháng 7, sau ñó giảm dần ñến tháng 11/2004 chỉ còn một ñiểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy ñược thống kê trong vụ dịch này là 84.078 con Và ñã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong ñó có 9 ca tử vong

Từ tháng 12/2004 cho ñến tháng 15/12/2005, dịch cúm gà xảy ra trên

36 tỉnh thành trong cả nước Số gia cầm bị tiêu hủy ñược Cục Thú y thống kê

là 1,846 triệu con Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các ñàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam Mặc dù vậy, ñến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 ñã tái bùng phát ở Cà Mau, sau ñó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ

Theo báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) ñến ngày 10/06/2007 dịch ñã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam ðịnh, ðồng Tháp, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ ñược khống chế hoàn toàn vào 8/2007

Dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008 Cho ñến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản ñã ñược khống chế trên toàn quốc (http://www.cucthuy.gov.vn)

Năm 2009, cả nước ñã có 129 ổ dịch tại 71 xã, phường, thị trấn của 35

huyện, thị xã thuộc 18 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 112.847 con

Năm 2010, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 62 xã, phường của 36 huyện,

quận thuộc 23 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 75.769 con, trong ñó gà là 21.938 con (chiếm 28,95 %), vịt là 52.809 con (chiếm 69,7 %) và ngan là 1022 con (chiếm 1,34%)

Năm 2011, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 82 xã, 43 huyện, quận thuộc

22 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh là 110.311 con gia cầm trong

ñó có 39,126 con gà, 70,020 con vịt và 1.165 ngan con tổng số gia cầm chết

và tiêu hủy là 151.356 con gia cầm

Từ ñầu năm 2012 ñến nay, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 296 xã, 121 huyện, quận thuộc 32 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 616.109 con gia cầm trong ñó 117.946 con gà (chiếm 19,14%), 479.859 con vịt (chiếm 77,89%) và 18.304 con ngan (chiếm 2,97%) (http://www.cucthuy.gov.vn)

Bảng 1.2 Tổng hợp tình hình bệnh cúm gia cầm trong 5 năm (2008-2012)

tỉnh

Số huyện Số xã Gà Vịt Ngan Tổng

Qua 5 năm từ 2008 – 2012, trung bình mỗi năm có khoảng 118 xã tại

58 huyện thuộc 25 tỉnh có dịch Số gia cầm bệnh chết tiêu hủy là hơn 212

ngàn con, chủ yếu là vịt chiếm 72,30%, gà chiếm 25,03% và ngan là 2,67% Như vậy, bình quân mỗi năm, mỗi tỉnh có dịch có khoảng 5 xã có dịch và tiêu hủy khoảng 8.500 con gia cầm bệnh

Hình 1.2: Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm

chia theo các tháng (Cục Thú y, 2012)

Như vậy, các tháng mùa xuân (tháng 1 ñến tháng 3) và mùa hè (tháng

7, tháng 8) là cao ñiểm xuất hiện nhiều ổ dịch cúm gia cầm

Hình 1.3: So sánh mức ñộ dịch cúm qua các năm

(Cục Thú y, 2012)

Từ năm 2008 ñến 2011, số gia cầm bệnh, chết và tiêu hủy là tương ñương nhau (khoảng trên dưới 100 ngàn con, chủ yếu vẫn là vịt) Năm 2012,

số gia cầm mắc bệnh, chết tăng cao ñột biến, ñặc biệt là vịt và ngan

Về tình hình người bị nhiễm cúm gia cầm tại Việt Nam, theo số liệu của WHO, tính ñến nay, cả nước ñã có 125 ca nhiễm cúm H5N1 trong ñó 62

ca tử vong Riêng năm 2012 có 4 ca nhiễm cúm trong ñó 2 ca ñã tử vong và 6 tháng ñầu năm 2013 có 2 ca nhiễm cúm trong ñó 1 ca ñã tử vong

1.2 ðặc ñiểm virus cúm A/H5N1

1.2.1 Phân loại và cấu trúc di truyền virus cúm A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 thuộc type A chi Influenzavirus họ

Orthomyxoviridae là họ virus ña hình thái, có vỏ ngoài, genom là RNA ñơn,

âm (-), phân ñoạn Họ này gồm 4 nhóm virus: Nhóm virus cúm A, nhóm virus

cúm B, nhóm virus nhóm C, nhóm Thogotovirus Virus Orthomyxoviridae là

tác nhân chủ yếu gây bệnh ñường hô hấp trên ở người, ñộng vật, gia cầm và chim Các nhóm virus này khác nhau kháng nguyên ở bề mặt Trong ñó nói

chung cúm C là loại thường gặp nhất ở người nhưng hiếm khi gây bệnh trầm trọng, cúm B thỉnh thoảng bùng phát thành dịch ở trẻ em, còn virus cúm A là loại có ñộc lực cao nhất có thể gây nên những ñại dịch rất nguy hiểm trên cả gia cầm và con người trên toàn cầu Virus họ này rất nhạy cảm với nhiệt ñộ, với các dung môi hoà tan lipit, các loại hoá chất sát trùng và oxi hoá, với formaldehyt, và các tia phóng xạ (Murphy, Webster, 1996)

Bốn nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae ñều có hệ gen chỉ gồm

RNA ñơn, sợi âm (negative single stranded RNA – (-)ssRNA), ñộ dài 10.000 – 15.000 nuleotide, ñược phân thành 6 – 8 ñoạn Mỗi ñoạn gồm nhiều phân tử axit nucleic, khác nhau về tính chất vật lý, cùng ñược gói lại trong một virion theo một cơ chế bọc gói rất kỹ lưỡng Do thông tin di truyền chứa trong các sợi RNA kích thước nhỏ nên ít xảy ra sự sai lệch thông tin Nếu một phân tử

bị hư hỏng thì cũng không ảnh hưởng ñến quá trình nhân lên của virus

Genome của virus cúm A có chiều dài tổng số khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân ñoạn mã hoá cho 8 protein: Phân ñoạn 1 – 3 mã hoá cho các protein không cấu trúc (enzyme polymerase – protein sớm phục vụ cho sao chép nucleic) gồm PB1 (87 kDa), PB2 (84 kDa) và PA (83 kDa); phân ñoạn 4 mã hoá cho hemaglutinin (HA) (protein bề mặt gắn vào thụ thể tế bào, gây ngưng kết hồng cầu) (63 kDa khi chưa ñược glycosyl hoá và 77 kDa nếu ñược glycosyl hoá); phân ñoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP) (protein muộn ñóng vai trò cấu trúc dưới ñơn vị nucleocapsid) (56 kDa); phân ñoạn 6

mã hoá cho enzyme neuraminidase (NA); phân ñoạn 7 mã hoá cho protein ñệm (M) (matrix protein), gồm 2 tiểu phần M1 (28 kDa) và M2 (11 kDa); phân ñoạn 8 mã hoá cho protein không cấu trúc (NS) (non – structural protein) với chức năng chưa rõ, gồm 2 tiểu phần NS1 (27 kDa) và NS2 (14 kDa) (Murphy, Webster, 1996; Luong, Palese, 1992)

Axit nucleic và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung quanh một trục tạo nên câu trúc ñối xứng xoắn hình cầu (ñường kính 89 – 120 nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài µm) của virion Một hạt virion có trọng lượng phân tử khoảng 250 triệu Da Nucleocapsid ñược bao bọc bởi màng

protein nền M1; phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn ñịnh cấu trúc của virus Lớp vỏ ngoài vủa virus còn có các glycoprotein (protein ñã ñược glycosyl hoá) Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm ñã ñược ñặc biệt hoá ñể gắn protein màng của virus vào, gồm: protein M2 ñâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA)

Hình 1.4: Cấu trúc hạt virion và hình thái của virus cúm A

A: Hình thái hạt virion chụp dưới kính hiển vi ñiện tử;

B: Mô hình cấu trúc hạt virus (Wikipedia.Bách khoa toàn thư mở)

1.2.2 Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm

Virus cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô ñường hô hấp thông qua

cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể Sau khi vào ñược trong tế bào biểu mô ñường hô hấp, virus nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào ñể chui ra

và xâm nhập vào các tế bào lành khác Ở niêm mạc ñường hô hấp trên, virus cúm bị các yếu tố miễn dịch không ñặc hiệu của cơ thể như dịch mũi họng, dịch phế nang và IgA chống lại Khi virus cúm vượt qua ñược hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm xuống cơ quan hô hấp dưới, ñó là phổi Tại ñây chúng nhân lên rất nhanh và phá huỷ các tế bào

Quần thể chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời) và gia cầm (vịt, gà tây, gà, ngan, ngỗng) là các vật chủ tự nhiên của virus cúm A Do ñó, virus cúm A

thường không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho chim và gia cầm Tuy nhiên, một số biến thể cường ñộc (H5, H7) xuất hiện gần ñây do tái tổ hợp với nhiều gen khác nhau, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở

chim và gia cầm (Li et al., 2004; Alexander, 2007) Thời gian ủ bệnh từ vài

giờ ñến 21 ngày, có trường hợp kéo dài ñến 28 ngày Gia cầm bệnh sốt cao, chảy nước mắt, ñứng tụm một chỗ, lông xù, phù ñầu và mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh Triệu chứng chung

là giảm hoạt ñộng, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu Trường hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở tư thế không bình thường Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ (Lê Văn Năm, 2005)

Tuy nhiên, virus cúm A ñặc biệt là chủng virus A/H5N1 hiện ñang lưu hành có thể xâm nhiễm gây bệnh ở các loài ñộng vật có vú khác như hổ, mèo ngựa, lợn và người (Murphy, Webster, 1996; Alexander, 2007) Bệnh lây truyền nhanh chóng từ cơ thể bệnh sang cơ thể khỏe mạnh bằng ñường hô hấp thông qua các hạt aerosol có chứa virus trong không khí và/hoặc qua ñường tiêu hóa do tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (không khí, ñất, nước, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm (dịch bài xuất, xác vật bệnh, chất thải) của cơ thể bệnh (Alexander, 2007; Lê Thanh Hòa, 2004)

ðối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 ñến 5 ngày trung bình là khoảng 3 ngày Lúc ñầu bệnh nhân sốt cao 39oC và kéo dài từ 1 ñến 3 ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho, sổ mũi nhức ñầu khủng khiếp, có thể tiến tới khó thở rồi nghẹt thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác ðặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỉ lệ tử vong rất cao cả ở gia cầm và trên người, có người có thể nhiễm cả ñường hô hấp trên

và dưới (Claas et al., 1998) Trong trường hợp không xảy ra những biến

chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong

vòng một tuần Tuy nhiên, nếu trường hợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn ñến tử vong, ñó là trường hợp bị biến chứng ñi kèm viêm phổi do virus hoặc do vi khuẩn hoặc cả hai

1.2.3 Các phân ñoạn mã hóa các kháng nguyên bề mặt chủ yếu

HA và NA là các kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm A, có vai trò kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể ñặc hiệu chống lại virus bảo

vệ cơ thể Các phân ñoạn HA và NA của virus cúm A có tần suất ñột biến cao

và hình thành các phân type HA và NA khác nhau (16 phân type HA và 9 phân type NA) Tuy nhiên chỉ có 4 phân type HA (H1, H2, H3, H5) và 2 phân type NA (N1, N2) là ñược phân lập từ chủng virus gây bệnh cho người:

- Phân ñoạn HA có ñộ dài thay ñổi tùy theo từng chủng virus cúm A ðây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp Hemagglutinin - một kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm Glycoprotein HA giúp virus có thể gắn với các thụ thể sialic acid ñặc hiệu trên bề mặt tế bào, hòa màng và xâm nhiễm tế bào chủ Về mặt miễn dịch học, HA là kháng nguyên chủ yếu của virus cúm A, là ñích quan trọng của các kháng thể trung hòa; do ñó HA là cơ

sở ñể ñiều chế các vaccine phòng cúm hiện nay

Về cấu tạo, phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), bao gồm 3 ñơn phân (trimer), mỗi ñơn phân (monomer) ñược tạo thành từ hai dưới ñơn vị là HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các ñơn phân sau khi tổng hợp ñã ñược glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới ñơn vị HA2, phần ñầu tự do hình chỏm cầu ñược tạo bởi dưới ñơn vị HA1 chứa ñựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của

HA trên bề mặt màng tế bào ñích Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm ðây chính là ñiểm cắt của protein HA (HA cleavage site) dưới tác dụng của enzyme protease và trình tự amino acid tại vùng này có vai trò quyết ñịnh ñộc lực của virus (Bosch et al., 1979;

Gambotto et al., 2008) HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu

khơng được glycosyl hĩa) và 77.103 Da (nếu được glycosyl hĩa, trong đĩ

HA1 là 48.103 Da và HA2 là 29.103 Da)

- Phân đoạn NA cũng là một gen kháng nguyên của virus, cĩ chiều dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A: ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 – 1410 bp Phân đoạn này mã hĩa cho neuraminidase (NA), một kháng nguyên bề mặt cĩ bản chất enzyme NA cĩ khối lượng phân

tử theo tính tốn khoảng 50.103 Da (trên thực tế là 50 - 60.103 Da)

Về cấu tạo, phân tử NA cĩ dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid

Neuraminidase xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết glycosid giữa sialic acid của tế bào chủ và glycoprotein trên bề mặt hạt virus để virus cĩ thể xâm nhiễm tế bào và giúp cho các hạt virus mới hình thành cĩ thể tách ra khỏi bề mặt tế bào nhiễm và phát tán trong cơ thể vật chủ Do đĩ, các thuốc ức chế neuraminidase (neuraminidase inhibitors – NAI’s) cĩ vai trị quan trọng trong điều trị bệnh cúm, ngăn chặn sự phát tán của virus trong cơ thể vật chủ

Kháng nguyên NA và kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, là cơ sở điều chế các vaccine phịng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm

ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người

1.3 Phương pháp chẩn đốn và dự phịng

1.3.1 Phân lập và định loại virus

Phân lập virus được tiến hành trên trứng gà cĩ phơi hoặc trên hệ thống nuơi cấy tế MDCK hoặc thận khỉ tiên phát

Về danh pháp, nhĩm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân

type (subtype), các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc

tính kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các chủng virus ở cơ thể bị nhiễm (Murphy, Webster, 1996)

1.3.2 Phát hiện vật liệu di truyền của virus

Vật liệu di truyền của virus cúm là ARN sợi đơn âm Các kỹ thuật phân

tử được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vật liệu di truyền của virus cúm là RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) và kỹ thuật Real-time RT-PCR Trước hết ARN tồn phần được tách chiết từ bệnh phẩm, chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase), sau đĩ tiến hành PCR với cặp mồi (primer) đặc hiệu Tùy theo mục đích nghiên cứu và chẩn đốn, người ta cĩ thể thiết kế các cặp mồi để phát hiện type hay phân type (subtype) virus cúm dựa trên các gen đặc hiệu type hay phân type Các gen đặc hiệu type bao gồm: gen mã hĩa protein M và gen mã hĩa nucleoprotein Thiết kế mồi trên các gen này sẽ phát hiện và phân biệt được virus cúm của các type A, B, C Tuy nhiên, muốn phân biệt được các phân type trong cùng một type cúm A thì người ta phải thiết kế các cặp mồi thuộc các gen đặc hiệu phân type (gen mã hĩa kháng nguyên HA và NA)

Từ khi xuất hiện đại dịch cúm A/H1N1, nhiều hãng và tổ chức nghiên cứu trên thế giới đã đưa ra thị trường nhiều bộ kit chẩn đốn, phát hiện virus cúm A/H1N1 đại dịch bằng RT-PCR hoặc Real-time RT-PCR Các bộ kit phát hiện cúm A/H1N1 gần đây nhất phải kể đến: Bộ kit của CDC (Hurt AC

et al 2009); Bộ kit của Qiagen; Bộ kit của Roche v.v… Tuy nhiên, các bộ sinh phẩm này thường cĩ giá thành rất cao so với túi tiền của người Việt Nam

và luơn bí mật về cơng nghệ chế tạo, nên rất khĩ cĩ thể áp dụng rộng rãi ở nước ta

1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch sử dụng trong chẩn đốn huyết thanh học và nghiên cứu cúm

Các kỹ thuật miễn dịch thường được sử dụng trong chẩn đốn huyết thanh học và nghiên cứu cúm, bao gồm:

+ Phản ứng kết hợp bổ thể: Phản ứng kết hợp bổ thể thường được sử dụng phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên NP (nucleoprotein) Kháng

nguyên NP được sản xuất bằng phương pháp nhiễm virut cúm vào tế bào nuơi (thận bào thai bê), phá tế bào và thu kháng nguyên nội bào NP của virus cúm

để sử dụng cho phản ứng CF Phản ứng CF với kháng nguyên NP là phản ứng đặc hiệu type nên cĩ thể phát hiện được kháng thể kháng tất cả các phân type cúm A và chỉ phân biệt được kháng thể kháng các type cúm A, B, C

+ Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu: ðây là kỹ thuật quan trọng nhất, thường được sử dụng trong chẩn đốn huyết thanh học của cúm, xác định phân type virus cúm A, đánh giá hiệu lực vaccine cúm Kháng nguyên được sử dụng là kháng nguyên HA của hạt virus cúm tồn phần khơng cần tinh chế (cĩ thể ở dạng dịch niệu tươi, cơ đặc hoặc đơng khơ) Về nguyên tắc, kháng thể kháng HA sẽ phong bế khả năng ngưng kết hồng cầu của virus làm cho hồng cầu khơng bị ngưng kết và lắng xuống Hồng cầu sử dụng cho phản ứng này là hồng cầu gà, hồng cầu chuột lang hoặc hồng cầu người nhĩm máu O

+ Phản ứng trung hịa: Phản ứng trung hịa virus cho kết quả tương đồng với phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu, vì kháng thể kháng HA thường cũng là kháng thể trung hịa virus Tuy nhiên phản ứng trung hịa cĩ

độ nhạy cao hơn nhưng thực hiện phức tạp hơn và tốn kém hơn Phản ứng Nt thường được thực hiện trên các phiến nhựa vi lượng nuơi tế bào Tế bào được

sử dụng cho phản ứng này thường là MDCK

+ Kỹ thuật ELISA: Thường được sử dụng trong chẩn đốn cúm B với kháng nguyên NP, vì đối với cúm B, đặc biệt là ở trẻ em, phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hịa cĩ độ nhạy rất thấp ELISA với kháng nguyên HA tinh chế cịn được sử dụng trong các phịng thí nghiệm nghiên cứu để xác định kháng thể đặc hiệu isotype trong dịch tiết của đường hơ hấp

+ Phản ứng khuếch tán miễn dịch: Sử dụng kháng thể kháng kháng nguyên HA tinh chế, thường được sử dụng để định lượng kháng nguyên HA trong kiểm định vaccine cúm

1.3.4 Vaccine phòng cúm A/H5N1

Vaccine là biện pháp có tính chiến lược, tạo miễn dịch chủ ñộng nhằm ngăn chặn lây lan dịch bệnh cúm A/H5N1 trên gia cầm và con người (Horimoto T, and Kawaoka Y, 2001) Sau khi sử dụng vaccine, cơ thể sẽ sinh

ra các kháng thể ñặc hiệu giúp chống lại virus H5N1 khi virus xâm nhập cơ thể Tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm A/H5N1 gặp khá nhiều khó khăn bởi khả năng biến ñổi kháng nguyên nhanh chóng của virus cúm và chúng ta không thể biết trước clade virus nào sẽ gây ñại dịch (Chen H

et al., 2006) Như vậy cần phải phát triển một loại vaccine có khả năng tạo miễn dịch chéo với nhiều clade virus khác nhau hoặc phát triển nhiều loại vaccine ñặc hiệu cho các clade H5N1 khác nhau Hiện tại WHO ñã xác ñịnh các chủng virus H5N1 có thể sử dụng ñể phát triển vaccine cho các clade khác nhau, bao gồm: clade 1 (A/Vietnam/1203/04-like); clade 2.1 (A/Indonesia/5/05); clade 2.2 (A/Bar-Headed Goose/Qinghai/1A/05-like); và clade 2.3 (A/Anhui/1/05)

Năm 2007, FDA phê chuẩn loại vaccine H5N1 do Sanofi Pasteur Inc sản xuất và loại vaccine này chỉ ñược dự trữ ñể sử dụng nếu xảy ra ñại dịch chứ không ñược dùng thường quy trong phòng bệnh Vaccine ñược sản xuất bằng công nghệ di truyền ngược từ chủng virus H5N1 clade 1 (A/VN/1203/04) tuy nhiên mặc dù dung nạp tốt nhưng loại vaccine này có khả năng gây miễn dịch tương ñối thấp (Sambhara S et al., 2007) Năm 2008, FDA lại phê chuẩn một loại vaccine khác do CBER/FDA (Center for Biologics and Evaluation and Research, Food and Drug Administration) sản xuất từ chủng virus thuộc clade 2.3.4 (A/duck/Laos/3295/2006) và hiệu lực của loại vaccine này hiện vẫn ñang ñược kiểm tra Ngoài ra, nhiều loại vaccine khác ñang ñược thử nghiệm trên người và ñộng vật Kết quả thử nghiệm giai ñoạn I và II của vaccine sống giảm ñộc lực H5N2 cho thấy vắcxin dung nạp tốt và làm tăng ≥ 4 lần hiệu giá ñối với các kháng thể ñặc

hiệu và có phản ứng chéo với HPAI H5N1 khi thử nghiệm trên khỉ (Rudenko

L et al., 2008) Thử nghiệm giai ñoạn I của vaccine tái tổ hợp H5 clade 1 biểu hiện bằng vector baculovirus cho thấy một liều duy nhất tiêm trong cơ có khả năng làm tăng hiệu giá kháng thể HI ≥4 lần ở 68% trường hợp thử nghiệm (Goji NA et al., 2008) Thử nghiệm giai ñoạn II với vaccine H5N1 clade 1 (clade 1 H5N1 split-virus vaccine) cũng cho thấy khi dùng lượng lớn kháng nguyên HA có thể tạo ra hiệu giá kháng thể HI ≥ 1:32 bền vững trong 6 tháng

và cũng có phản ứng chéo với kháng nguyên HA của các chủng ñang lưu hành thuộc clade 2.2 (Nolan TM et al., 2008) Các vaccine H5N1 dự tuyển cho clade 1 như A/Vietnam/1203/04 hay A/Vietnam/1194/04, ñược sản xuất dựa trên công nghệ di truyền ngược (Webby RJ et al., 2004) Thử nghiệm giai ñoạn 1 trên người cho thấy vaccine này cần sử dụng 2 liều (90 µg HA) ñể có thể tạo ñược miễn dịch bảo vệ (Treanor JJ et al., 2006) Liều kháng nguyên như vậy là cao hơn nhiều so với vaccine cúm mùa và không thể ñưa vào sản xuất vaccine với khối lượng lớn Các vaccine H5N1 dưới ñơn vị (H5N1 subunit vaccines) sử dụng nhôm phôtphat (AlPO4) làm tá dược giúp làm tăng khả năng gây miễn dịch nhưng vẫn chưa ñạt yêu cầu ñể có thể sản xuất với khối lượng lớn Một loại vaccine bất hoạt sử dụng tá dược là nhôm có thể tạo ñáp ứng miễn dịch tốt hơn với 2 liều 10 µg HA khi thử nghiệm lâm sàng giai ñoạn I (Lin J et al., 2006)

Hầu hết các nghiên cứu mặc dù ñã có những kết quả nhất ñịnh nhưng vẫn chưa tạo ñược mức hiệu giá kháng thể tương ñương với hiệu giá kháng thể ñủ ñể bảo vệ như vaccine cúm mùa (≥ 1:40) Tuy nhiên người ta cũng chưa biết rằng hiệu giá kháng thể cần ñạt mức nào thì có thể bảo vệ cơ thể trước virus cúm gia cầm Trong nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1, hiện tại chúng ta còn chưa xác ñịnh ñược chiến lược phát triển vaccine nào là phù hợp nhất, vaccine bán phần, vaccine DNA, vaccine bất hoạt hay vaccine sống giảm ñộc lực

Việc sử dụng vaccine, thậm chí vaccine có hiệu lực trung bình, cũng góp phần làm giảm bớt ảnh hưởng khi ñại dịch cúm xảy ra (Ferguson NM et al., 2006) Mặc dù vậy, kể cả khi ñã phát triển ñược loại vaccine H5N1 gây ñáp ứng miễn dịch tốt, thì việc sản xuất vaccine cũng không ñủ ñể ñáp ứng nhu cầu của cộng ñồng khi có ñại dịch xảy ra Khả năng sản xuất vaccine của thế giới hiện tại là 300 triệu liều vaccine tam giá (phòng cúm mùa), tương ñương 900 triệu liều vaccine ñơn giá Như vậy chỉ ñủ ñáp ứng cho 450 triệu người với 2 liều vaccine ñơn giá, mỗi liều 15 µg HA

ðể giải quyết khó khăn trong sản xuất vaccine, cần phải áp dụng kỹ thuật sản xuất vaccine bằng phương pháp nuôi cấy tế bào (Nicolson C et al., 2005) và giảm liều kháng nguyên bằng cách sử dụng các tá dược mới hoặc phương thức ñưa vaccine vào cơ thể phù hợp Sử dụng vaccine bằng cách tiêm trong da là phương pháp tiết kiệm kháng nguyên ñã áp dụng với cúm mùa (Belshe RB et al., 2004), tuy nhiên phương pháp này lại không phù hợp khi xảy ra ñại dịch cúm Ngoài ra nếu nhu cầu sử dụng vaccine cúm mùa tăng lên thì khả năng sản xuất vaccine khi xảy ra ñại dịch cũng sẽ tăng theo Hiện tại mức ñộ sử dụng vaccine cúm mùa còn thấp, một phần là do chưa ñánh giá ñúng mức tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ tử vong do virus cúm, ñặc biệt là ở các vùng nhiệt ñới Tuy nhiên một số nghiên cứu gần ñây ñã cho thấy virus cúm ảnh hưởng ñến các vùng khí hậu nóng hay lạnh là như nhau và khuyến cáo nên tăng cường sử dụng vaccine phòng cúm mùa ñối với các ñối tượng có nguy cơ

cao (Wong CM et al., 2004)

1.3.5 Chất bổ trợ dùng trong vaccine cúm A/H5N1

Các vaccine sản xuất trên cơ sở các chủng virus ñược tạo ra bằng di truyền ngược có lợi thế là giảm ñộc lực, ñảm bảo an toàn cho sản xuất nhưng

có tính sinh miễn dịch thấp hơn hẳn so với vaccine cúm mùa Ví dụ: trong một liều vaccine cúm mùa người ta chỉ sử dụng 15 µg HA cho mỗi phân type

và không cần sử dụng chất bổ trợ vaccine Tuy nhiên, ñối với vaccine cúm

H5N1 sử dụng chủng di truyền ngược người ta bắt buộc phải sử dụng chất bổ trợ vaccine Các chất bổ trợ vaccine ñược sử dụng chủ yếu cho vaccine H5N1 ngày nay là MF59 Rất nhiều công trình nghiên cứu tìm kiếm các chất bổ trợ vaccine, ñặc biệt các chất bổ trợ ñể ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô hấp (ñường mũi) Tumpey TM et al (2001) ñã sử dụng enterotoxin mẫn cảm nhiệt

của Escherichia coli [ký hiệu là LT(R192G)] làm chất bổ trợ ñưa vaccine cúm

gia cầm H5N1 qua ñường mũi và bảo vệ ñược 100% chuột gây miễn dịch khi công cường ñộc với cúm H5N1 ñộc lực cao Các nhà khoa học Nhật Bản ñã

sử dụng cholera toxin B tiểu ñơn vị chứa một lượng nhỏ holotoxin (CTB*) làm chất bổ trợ cho vaccine phá vỡ hạt virus sử dụng chủng H5N1 tái tổ hợp Kết quả cho thấy xuất hiện cả kháng thể IgA trong dịch tiết của ñường hô hấp

và IgG trong huyết thanh chuột Chuột ñược bảo vệ khi công cường ñộc với chủng ñộc lực A/Hong Kong/483/97(H5N1) (Asahi-Ozaki Y et al 2006) Một loại chất bổ trợ thường ñược dùng cho nhiều loại vaccine là hydroxide nhôm

Từ năm 2007, các nhà khoa học Nhật Bản cũng ñã sử dụng hydroxide nhôm như chất bổ trợ miễn dịch cho vaccine cúm H5N1 Sử dụng vaccine tái tổ hợp rgHK213/03 bổ trợ với hydroxide nhôm gây miễn dịch cho chuột ñã bảo vệ ñược chuột khi công cường ñộc với chủng virus A/Turkey/12/06 (Ninomiya

A et al 2007) Vaccine H5N1 với tá chất hydroxide nhôm cũng ñã có hiệu quả tạo ñáp ứng miễn dịch rõ rệt khi gây miễn dịch cho khỉ vàng Macaque Khỉ ñược gây miễn dịch hoàn toàn không xuất hiện triệu chứng bệnh khi công cường ñộc với chủng virus ñộc lực, trong khi ñó vaccine không ñược bổ trợ chỉ bảo vệ ñược ñộng vật một phần (Ruat C et al 2008) Các nhà khoa học Hoa Kỳ ñã thử nghiệm sử dụng hai loại chất bổ trợ miễn dịch là MF59 và hydroxide nhôm cho vaccine cúm H5N1 có nguồn gốc từ chủng A/Vietnam/1203/2004(H5N1) Kết quả cho thấy khi sử dụng liều vaccine 15

µg có có chất bổ trợ là MF59, có thể tạo ra ñáp ứng kháng thể bảo vệ (hiệu giá HI ≥ 40) ở người tình nguyện ñạt tới 63%, trong khi ñó sử dụng hydroxide

nhôm không tạo ra ñáp ứng kháng thể bảo vệ ở của liều vaccine 15 và 30 µg (Bernstein DI et al 2008) Như vậy có thể nói, cho ñến nay MF59 vẫn là chất

bổ trợ vaccine có hiệu quả nhất ñối với vaccine cúm H5N1 Tuy nhiên, MF59

là chất bổ trợ có giá thành tương ñối cao và chỉ sử dụng qua ñưòng tiêm Việc tiếp tục tìm kiếm các chất bổ trợ vaccine có ưu thế hơn, ñặc biệt các chất bổ trợ ñưa vaccine qua ñường mũi bằng khí dung ñể tạo ñáp ứng miễn dịch tại chỗ là công việc ñang ñược nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm

Ngay từ năm 1998, các tác giả Nhật Bản ñã nhận thấy rằng bào tử Bacillus subtilis có khả năng hoạt hóa các ñại thực bào và các tế bào giết tự nhiên (Kosaka T et al 1998) Tiếp ñó, người ta còn chứng minh ñược rằng bào tử

Bacillus subtilis có khả năng ñiều khiển sự cân bằng tế bào helper Th1 và Th2 trong ñáp ứng miễn dịch với một kháng nguyên ñặc hiệu nhất ñịnh (Barnes A

G et al 2007) Người ta cũng ñã sử dụng bào tử Bacillus subtilis như vaccine

hiệu quả, bền nhiệt biểu hiện phân ñoạn C của ñộc tố uốn ván và ñưa vào cơ thể qua ñường mũi (Lee S et al 2010) Nhóm tác giả này cũng ñã thành công trong việc thiết kế ñược vaccine phòng bệnh tiêu chảy do rotavirus trên cơ sở

biểu hiện ở Bacillus subtilis

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Sinh phẩm nghiên cứu

- Chủng virus NIBRG-14 do Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh Sinh học (NIBSC), Vương Quốc Anh cung cấp

- Bacillus subtilis chủng PY79 do Giáo sư Simon Cutting, School of

Biological Sciences, Royal Holloway, University of London cung cấp

- Trứng gà Leghorn do trung tâm Giống Gia cầm Thụy Phương cung cấp

- Chuột BALB/c do Viện Vaccine Quốc tế (IVI) cung cấp

- Kháng huyết thanh chuẩn kháng hemagglutinin của chủng virus NIBRG-14 và Kháng nguyên HA chuẩn do Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh Sinh học (NIBSC), Vương Quốc Anh cung cấp

2.1.2 Các dung dịch, hoá chất, môi trường dùng trong nghiên cứu

- Dung dịch PBS 0,01M

- Chloramin 1%

- Cồn Iốt 5 %

- Chất hiện màu TMB (3,3,5,5, Tetramethyl Benzidine)

- Dung dịch nước muối sinh lý 0,9%

- Dung dịch Alserver

- Dung dịch dùng cho ñiện di protein: Dung dịch ñệm SDS- PAGE 10X; Dung dịch ñệm tra mẫu (SDS-PAGE sample) 2X; Dung dịch acrylamit- bisacrylamit 30%; Dung dịch tẩy màu;

- Dung dịch Thimerosal 1/100

- Dung dịch formandehide 37%

- Dung dịch NaHSO3 8,8%

- Cồn 700

- Dung dịch Sacaroza 15%, 30% và 60% trong PBS 0,01 M pH 7,0-7,2

- Dung dịch 20 µM succinimidyl tetramethyl rhodamine (TMR, Invitrogen)

- Dung dịch 20 µM succinimidyl fluorescein isothiocyanate (FITC, Invitrogen)

- Dung dịch dùng cho ELISA: Dung dịch gắn bản pH=9,6; Dung dịch PBS 1X, pH= 7,3; Dung dịch rửa bản pH= 7,2- 7,5; Dung dịch phủ bản

- Môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis

Thành phần môi trường (g/l):

Glucose: 2 g; sodium citrate 3H20: 0,5 g; NH4CI: 0,5 g; tryptophan: 0,02 g; KH2PO4: 1,36 g; Na2SO4: 0,142 g; NaNO3: 0,085 g; KCI: 0,075 g; MgCl2-6H20: 0,0246 g; FeCI3-6H20: 1,08 mg; MnCl2-4H20: 0,079 g; CaCl2-6H20: 0,219 g Chỉnh pH về 7,1 với NaOH

ðối với môi trường thạch, cần bổ sung 2 % agar

2.1.3 Các trang thiết bị và dụng cụ dùng cho nghiên cứu

- Cân ñiện 10-2g (Mettler Toledo)

- Máy ly tâm siêu tốc (Sorvall Pro80, Dupon, Mỹ)

- Máy ño pH Meter Delta 320 (Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ)

- Bộ ñiện di protein (bio-Rad, Mỹ)

- Máy quang phổ NanoDrop (Thermo Scientific)

- Kính hiển vi ñối pha (Phase-contrast microscope, Nikon E400)

- Epi-Fluorescence Microscope (Nikon Eclipse E400)

- Confocal microscope (Carl Zeiss LSM 510)

- Máy ựọc ELISA (Dynatech Minireader II, Mỹ)

- Khuấy từ và máy khuấy từ (IKA)

- Máy li tâm lạnh tốc ựộ cao li tâm ống 1,5-2ml (Sorvall, Mỹ)

- Máy vortexer (IKA, đức)

- Ống nghiệm vô trùng nút bông có gạc và nút cao su

- Pipet thủy tinh (pipet Pasteur thân dài 20cm)

- Pipet tự ựộng 1 kênh và 12 kênh

- Quả bóp (dùng cho pipet Pasteur)

- Dao, kéo cong, panh kẹp

- Bơm tiêm vô trùng (loại nhựa 1ml), bơm tiêm vô trùng (loại nhựa 10ml)

- Phiến nhựa vi lượng 96 giếng ựáy chữ U ựể làm phản ứng HA và HI

- Phiến nhựa vi lượng 96 giếng ựáy bằng ựể làm phản ứng ELISA

- đèn soi trứng

- Dùi ựục trứng

- Băng keo dán, sáp nến

- Túi thẩm tắch 20 cm, kẹp túi thẩm tắch

- Bơm tiêm vô trùng loại 1ml, 10ml

- Lọ penicilin vô trùng loại 10ml

- Lọ Pyrex vô trùng loại 100ml, 500ml, 1000ml

- Quần áo bảo vệ, khẩu trang, găng tay cao su vô trùng,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- ðặt các khay trứng vào tủ ấm 38,5°C và ấp trong 10-11 ngày Trong quá trình ấp phải ñảm bảo nhiệt ñộ tủ ấp ổn ñịnh ở 38,5°C và luôn có khay nước vô trùng trong tủ ấm ñể ñảm bảo ñộ ẩm

Quá trình ấp trứng là bước ñầu tiên trong quy trình sản xuất kháng nguyên Chỉ những quả trứng ấp có phôi mới ñược sử dụng ñể cấy virus

2.2.2 Soi trứng

Sau khi trứng ñã ấp 7 ngày, tiến hành soi trứng ñể kiểm tra, phân loại những quả trứng phát triển bình thường và những quả không phát triển thành phôi, bị chết, hỏng Soi trứng trong phòng tối vô trùng bằng ñèn soi trứng Những quả trứng phát triển tốt là những quả có phôi, có thể nhìn thấy bằng mắt thường ñầu của phôi cử ñộng bên trong quả trứng

Sau khi soi, những quả có phôi ñược ñưa vào ấp tiếp trong tủ ấm 38,5°C, những quả hỏng sẽ bị loại bỏ

- Sau 10 ngày ấp trứng, tiến hành soi lại trứng ñể ñảm bảo trứng ñược tiêm là hoàn toàn khỏe mạnh bình thường, loại ñi những quả có hiện tượng thối hỏng

- Dùng bút chì ñánh dấu túi hơi và ñầu phôi trứng

- Dùng khăn tẩm cồn 70% lau lại trứng một lần nữa

Pha virus:

Giống virus: Nước trứng chứa virus vacxin giống gốc có hiệu giá HAU

> 1/640 bảo quản ở -70oC Sau khi lấy khỏi tủ lạnh sâu (-70oC) ñể ống gốc trong ñá cho tan tiến hành pha giống

+ Pha loãng virus trong PBS 0,01M (pH = 7,2) vô trùng chứa 100 µg gentamycin/ml ở ñộ 10-3 ñể ñạt 1000 liều EID50

Dung dịch pha virus luôn ñược giữ trên ñá

Tiến hành tiêm virus vào trứng:

+ Dùng cồn Iốt 0,5% sát trùng vị trí tiêm là túi hơi, ñầu phôi

+ Khử trùng dùi ñục trứng trên ngọn lửa ñèn cồn, ñục hai vị trí ñã sát trùng bằng cồn iốt, 1 ở túi hơi, 1 ở ñầu phôi

+ Dùng bơm tiêm vô trùng tiêm dịch virus ñã pha loãng vào vị trí ñầu phôi của trứng, mỗi quả 200 µl dịch virus ñã pha loãng

+ Sau khi tiêm dùng cồn iốt sát trùng lại viết tiêm

+ Hàn kín vết tiêm bằng paraphin nấu chảy

+ ðưa trứng sang tủ ấm 33,5 °C Ấp tiếp trong vòng 3 ngày (72 giờ) Sau 24 giờ soi trứng kiểm tra và loại bỏ những trứng bị chết phôi

dịch niệu virus ñược bảo quản trong tủ lạnh 4°C

- Dịch kháng nguyên thu ñược sau khi nuôi cấy trên trứng ñược kiểm tra hiệu giá HA

2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (kiểm tra hiệu giá HA)

Chuẩn bị hồng cầu gà:

- Lấy 2 ml máu gà trống tơ khỏe mạnh từ ven cánh vào trong bơm tiêm

ñã chứa sẵn 2ml dung dịch chống ñông Alserver

- Chuyển sang ống li tâm ñã chứa sẵn 4 ml dung dịch Alserver Li tâm

Làm phản ứng trên phiến nhựa vi lượng 96 giếng hình chữ U:

- Dùng pipet 12 kênh, cho 90 µl dung dịch PBS 1X vào hàng ñầu tiên (hàng A) của phiến nhựa và 50 µl vào tất cả các giếng còn lại

- Bổ sung tiếp 10 µl dịch niệu thu từ trứng ñã cấy virus vào 11 giếng hàng trên cùng theo các vị trí tương ứng lần lượt từ A1 ñến A11 và 10 µl dung dịch PBS 1X vào giếng A12

- Pha loãng dịch virus theo bậc hai từ hàng A ñến hàng H:

+ Vặn pipet 12 kênh ở thể tích 50 µl

+ Dùng pipet hút lên ñẩy xuống 3 lần bắt ñầu ở hàng A

+ Hút lên 50 µl hỗn dịch từ hàng A chuyển xuống hàng B

+ Làm tương tự từ hàng B ñến hàng H Tại hàng cuối cùng hút

bỏ 50µl hỗn dịch

- Bổ sung 50 µl hồng cầu gà 0,5% theo thứ tự các cột từ 1 ñến 12 của phiến nhựa

- Lắc nhẹ, ñể tĩnh ở nhiệt ñộ phòng trong khoảng 30 phút và ñọc kết quả: Cột 12 (A12 ñến H12) là chứng hồng cầu, hồng cầu phải lắng hoàn toàn Hiệu giá HA là ñộ pha loãng cao nhất vẫn gây ngưng kết hồng cầu

2.2.6 Phương pháp sản xuất kháng nguyên virus tinh chế

Tinh chế kháng nguyên ñược làm theo phương pháp Laver mô tả năm

1969 Sau khi thu dịch niệu xác ñịnh hiệu giá ngưng kết hồng cầu và li tâm bằng máy li tâm lạnh với tốc ñộ 5000v/ph trong 10 phút, loại bỏ cặn và thu dịch Dịch này ñược xác ñịnh hiệu giá ngưng kết hồng cầu ñể kiểm tra lượng virus Virus ñược cô ñặc bằng li tâm siêu tốc 30.000v/ph 40C trong 2 giờ với rotor góc cố ñịnh T865 của máy li tâm Sorvall Pro80 Cặn virus ñược tinh chế bằng li tâm phân vùng trong thang phân vùng saccaroza ở nồng ñộ 60, 30 và 15% pha trong ñệm PBS 0,01M, pH 7,0-7,2 Băng virus ñược hình thành sau khi li tâm tốc ñộ 25.000v/ph, 2 giờ, 40C với rotor góc văng Surespin 630 của máy li tâm Solvall Pro80 Thu nhận băng virus và thẩm tích 24 giờ trong ñệm PBS 0,01M

Sau li tâm xuất hiện 2 băng, một băng nằm ở vùng có nồng ñộ ñường 15% (ký hiệu là F1 ), một băng nằm ở vùng có nồng ñộ ñường 30% (kí hiệu là

F2) Hạt virus toàn phần tinh chế ở băng F2 ñược thu nhận và tiến hành thẩm tích ñể loại bỏ ñường

Băng virus ñược hút ra khỏi ống li tâm bằng bơm tiêm và chuyển sang túi thẩm tích Túi thẩm tích ñược ñặt trong cốc ñựng PBS 0,01M, có khuấy từ

và tiến hành thẩm tích 24 giờ trong tủ lạnh 4oC

Sau khi tinh chế, kháng nguyên ñược chuẩn ñộ bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu, bất hoạt virus bằng formaline 1/4000 trong tủ lạnh thường 4-

5oC, trong 5 ngày, ñiện di kiểm tra và ñịnh lượng protein HA bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch trên thạch (SRD) sử dụng kháng nguyên HA và kháng huyết thanh chuẩn của NIBSC (Wood JM et al., 1977)